現(xiàn)代分離技術(shù)第二章

現(xiàn)代分離技術(shù)第二章演示文稿當(dāng)前第1頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)現(xiàn)代分離技術(shù)第二章當(dāng)前第2頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

什么是色譜方法(Chtomatography)?

最初，1903年，M.C.Цвег把干燥的葉子用石油醚萃取后，將小量的萃取液傾入充填有沉降碳酸鈣的玻璃柱子的頂端，然后用石油醚淋洗，結(jié)果葉中的色素在碳酸鈣柱上互相分離，形成不同顏色的色帶，分列在柱上；隨著淋洗液的流動(dòng)，色帶的分離越加明顯。他把這種方法叫做“色譜法”，色譜的英文名稱是chromatograph，它是由希臘文chromos和grapho兩字并合而成，字面上意義是顏色的記錄。

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什么是色譜方法(Chtomatography)?當(dāng)前第4頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

可以說茨維特在色譜方面做了開創(chuàng)性的工作，但以后的二十幾年并未引起很多人的注意，直到1931年有人用充填氧化鋁粉末的柱管將性質(zhì)非常相似的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素分離成功（在此之前，人們一直以為胡蘿卜素是一種純物質(zhì)），并且得到的純物質(zhì)可做Ｃ、Ｈ元素定量分析用，這才引起了許多有機(jī)化學(xué)工作者的注意，認(rèn)識(shí)到色譜法在分離混合物方面有廣闊的前景，并且研究出許多新技術(shù)，例如分配色譜法、紙上色譜法、薄層色譜法、離子交換色譜法等。當(dāng)前第5頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

現(xiàn)在，人們所說的“色譜”一詞的含義已經(jīng)遠(yuǎn)不是茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶，而是根據(jù)混合物中各組分在互不相溶的兩相(固定相、流動(dòng)相)中的吸附能力、分配系數(shù)或其它親合能力的差異而設(shè)計(jì)的分離分析方法，它集分離與分析于一體，快速、簡(jiǎn)便、微量，成為分離分析復(fù)雜混合物的理想方法之一。現(xiàn)在，色譜法所涉及到的領(lǐng)域不僅限于分析化學(xué)，而且涉及到許多其它領(lǐng)域如石油化工、精細(xì)化工、近代電子技術(shù)、生命科學(xué)、食品科學(xué)、臨床分析、考古學(xué)、甚至興奮劑檢測(cè)等。當(dāng)前第6頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

雖然目前在各種色譜法中茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶已經(jīng)沒有普遍性，但由于這種名稱在中外已沿用很久，眾所周知，不宜更改。因此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中仍定名為色譜法。當(dāng)前第7頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

色譜分離法的種類很多，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的特點(diǎn)，可以分為：柱色譜（ＣＣcolumuchro.）薄層色譜（ＴＬＣthinlayerchro.）紙色譜（ＰＣpaperchro.）氣相色譜（ＧＣgaschro.）高效液相色譜（ＨＰＬＣhighperformanceliquidchro.）凝膠滲透色譜（ＧＰＣgelpermeationchro.）離子交換色譜（ＩＥＣironexchangchro.）

…………

這里我們主要介紹ＴＬＣ、ＧＣ、ＨＰＬＣ。當(dāng)前第8頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

一、簡(jiǎn)介ＴＬＣ──在鋪成薄層的固體上進(jìn)行色譜的方法。（簡(jiǎn)述ＴＬＣ的操作及儀器）當(dāng)前第9頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

優(yōu)點(diǎn)：①操作容易，設(shè)備簡(jiǎn)單，易于掌握。②分離迅速（ＰＣ需幾個(gè)小時(shí)到幾十個(gè)小時(shí)，ＴＬＣ只需十幾分鐘到幾十分鐘）。③靈敏度高（可檢測(cè)10-5μg物質(zhì)）。④固定相（與ＰＣ相比）、流動(dòng)相（與ＧＣ相比）、顯色劑(與PC相比）均可靈活選用。當(dāng)前第10頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

優(yōu)點(diǎn)：⑤樣品用量可?。◣孜⒖恕珟资⒖耍┛纱螅◣缀量恕珟装俸量耍捎糜趥渖V。⑥特別適用于熱不穩(wěn)定及難揮發(fā)樣品。⑦技術(shù)多樣化（如雙向展開、多次展開等），可分離復(fù)雜樣品。⑧不存在樣品堵塞柱子而使柱效下降或柱子報(bào)廢的問題。當(dāng)前第11頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

缺點(diǎn)：①不適合揮發(fā)性樣品、②自動(dòng)化程度低于ＧＣ、ＨＰＬＣ。③分離效果不及ＧＣ、ＨＰＬＣ，不能分離過于復(fù)雜的樣品。當(dāng)前第12頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

二、基本原理1.TLC分類按照分離過程中樣品與固定相、流動(dòng)相之間相互作用的性質(zhì)，有三種TLC：①吸附色譜：②分配色譜：③離子交換色譜：當(dāng)前第13頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

①吸附色譜：利用樣品中各組分對(duì)吸附劑（固定相）的吸附能力不同，將其分離。Ｒf值大──溶質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附能力小。Ｒf值小──溶質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附能力大。當(dāng)前第14頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

②分配色譜：利用樣品中各組分對(duì)固定液與流動(dòng)相的分配系數(shù)不同，將其分離，原則上與液－液連續(xù)萃取相似。Ｒf值大──溶質(zhì)易溶于流動(dòng)相，不易溶于固定相。Ｒf值小──溶質(zhì)易溶于固定相，不易溶于流動(dòng)相。當(dāng)前第15頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

③離子交換色譜：樣品中某組分與離子交換劑進(jìn)行離子交換作用。這里主要介紹吸附色譜。當(dāng)前第16頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

2.吸附色譜原理二、基本原理

吸附色譜的原理是基于樣品溶液與固定相表面發(fā)生了吸附作用。吸附有物理吸附和化學(xué)吸附之分，物理吸附的特點(diǎn)是無選擇性、吸附速度快、可逆、吸附熱小，化學(xué)吸附的特點(diǎn)是有選擇性、吸附速度慢、不可逆、吸附熱大。在吸附色譜中主要發(fā)生物理吸附。當(dāng)前第17頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

在吸附劑固體表面，溶質(zhì)分子（Ａ）與溶劑分子（Ｓ）以占據(jù)吸附劑表面的位置可以互相競(jìng)爭(zhēng)，Ａ可以頂出Ｓ，Ｓ也可以頂出Ａ，這種競(jìng)爭(zhēng)可用下式表示：Ａ溶＋Ｓ吸＝＝Ａ吸＋nＳ溶

Ａ溶──溶液中的溶質(zhì)分子；Ａ吸──被吸在吸附劑表面的溶質(zhì)分子；Ｓ溶──溶液中的溶劑分子；Ｓ吸──被吸在吸附劑表面的溶劑分子；

n──競(jìng)爭(zhēng)過程中，被溶質(zhì)分子頂出來的溶劑分子的個(gè)數(shù)（假定溶質(zhì)分子體積比溶劑分子大）。當(dāng)前第18頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

溶質(zhì)分子頂替溶劑分子時(shí)，過程從左向右進(jìn)行；溶劑分子頂替溶質(zhì)分子時(shí)，過程從右向左進(jìn)行；一定條件下（如Ａ、Ｓ、吸附劑、Ｔ、Ｐ、…

…），這種競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到平衡，即Ａ、Ｓ的吸附或解吸速度相等。但條件改變時(shí)，平衡就會(huì)遭到破壞，如果向上述平衡體系中加入溶劑，平衡就會(huì)向左移動(dòng)，然后達(dá)到新的平衡。當(dāng)前第19頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

在吸附薄層色譜中，展開劑(溶劑)是不斷供給的。所以，原點(diǎn)上Ａ與Ｓ（展開劑）之間的平衡不斷遭到破壞，吸附在原點(diǎn)上的溶質(zhì)不斷解吸，解吸出來的Ａ溶于Ｓ中并隨之向前移動(dòng)，遇到新的吸附劑表面，Ａ與Ｓ又建立起新的平衡，但又立刻遭到不斷移動(dòng)上來的展開劑（Ｓ）的破壞，又有一部分Ａ解吸并隨之向前移動(dòng)。如此吸附－解吸附－再吸附－再解吸附－再吸附－……的交替過程就構(gòu)成了色譜法的分離基礎(chǔ)。當(dāng)前第20頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

吸附力弱的組分容易解吸而溶于展開劑中，并隨之向前移動(dòng)，Rf值較大；吸附力強(qiáng)的組分不易解吸，也不易隨著展開劑向前移動(dòng)，Ｒf值較?。蝗绻麡悠啡芤褐杏袃煞N溶質(zhì)Ａ1、Ａ2，其極性不同，因而其吸附能力、Rf值也就不同，從而達(dá)到分離。當(dāng)前第21頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

3.吸附作用強(qiáng)弱順序二、基本原理如何判斷各種溶質(zhì)分子在吸附劑表面吸附能力的大?。慨?dāng)然是考慮吸附劑與溶質(zhì)分子間作用力的大小。

吸附色譜常用的吸附劑為：氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個(gè)級(jí)，一級(jí)活性最高，五級(jí)最低。當(dāng)前第22頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

O│

聚酰胺：─C-NH-(CH2)5─吸附劑的共同特點(diǎn)是：①含有帶孤對(duì)電子的氧原子、氯原子。②含有-NH-、-OH-等,易形成氫鍵。即極性大，易成氫鍵。當(dāng)前第23頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

吸附劑與非極性溶質(zhì)分子間的作用力主要是誘導(dǎo)力；吸附劑與極性溶質(zhì)分子間的作用力主要是靜電力。（靜電力＞誘導(dǎo)力）所以，溶質(zhì)的極性越大，與吸附劑的作用力越大，即極性大的樣品與固定相的親合力大。當(dāng)前第24頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

所以，吸附劑與被吸附物質(zhì)間的親合作用遵循下列原則：①被吸附物質(zhì)的極性越大，與極性吸附劑的作用越強(qiáng)，單官能團(tuán)化合物與硅膠或氧化鋁有下列親合順序：羧酸＞醇、酰胺＞伯胺＞酯、醛、酮＞腈、叔胺、硝基化合物＞醚＞烯＞鹵烷＞烷烴②分子中雙鍵數(shù)目越多，親合力越大；③分子中苯環(huán)數(shù)目越多，親合力越大；④分子中官能團(tuán)數(shù)目越多，親合力越大；（有例外：鄰硝基苯酚與硅膠、氧化鋁的親合力＜苯酚或硝基苯）⑤被吸附物質(zhì)的分子量越大，親合力越大（色散力大）。當(dāng)前第25頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

三、儀器裝置：用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板當(dāng)前第26頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

四、實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括：①吸附劑的選擇和制備；②薄板的制備；③薄板的活化；④點(diǎn)樣技術(shù)；⑤展開技術(shù)；⑥顯色技術(shù)。當(dāng)前第27頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑴硅膠(Silicagel):

無定形多孔物質(zhì)，適用于酸性和中性物質(zhì)的分離。硅膠H──不含粘合劑硅膠G──含煅石膏(gypsum)做粘合劑。有時(shí)淀粉、CMC等也可用做粘合劑。硅膠HF254──含無機(jī)螢光(fluoresent)物質(zhì)，在254nm下觀察螢光。硅膠GF254──含煅石膏和無機(jī)螢光物質(zhì)。當(dāng)前第28頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑵氧化鋁:

無定形多孔物質(zhì)，也有氧化鋁H、氧化鋁G、氧化鋁HF、氧化鋁GF等型號(hào)，還有酸性、中性、堿性氧化鋁之分。氧化鋁一般在100-150目。

酸性氧化鋁──10%HCl浸泡過夜，水洗至pH值=4，適用于酸性物質(zhì)的分離。酸性氧化鋁適用于pH4~4.5的酸性有機(jī)酸類的分離。10min

(pH=4指1gAl2O3+10ml水───→測(cè)濾液之pH值)△當(dāng)前第29頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

中性氧化鋁──10％HCl浸泡過夜，水洗至pH值=7，適用于分離中性物質(zhì)。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等pH約為7.5的中性物質(zhì)的分離。堿性氧化鋁──水中浸泡過夜，pH≈10,適用于分離堿性物質(zhì)。堿性氧化鋁，適用于碳?xì)浠衔?、生物堿及堿性化合物的分離，一般適用于pH為9-10的環(huán)境。當(dāng)前第30頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：

由酰胺聚合而成的高分子，其分子內(nèi)存在著許多酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用，根據(jù)樣品中組分的結(jié)構(gòu)不同（如能形成氫鍵基團(tuán)的數(shù)目、位置以及雙鍵和苯環(huán)數(shù)目的多少等）與聚酰胺產(chǎn)生吸附作用的強(qiáng)弱不同，從而使樣品達(dá)到分離。O│

聚酰胺：─C-NH-(CH2)5─當(dāng)前第31頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：聚酰胺可由錦綸絲制備，也可直接購買商品薄層色譜用聚酰胺薄膜。由錦綸絲制備聚酰胺固定相有兩種方法：當(dāng)前第32頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：a.冰醋酸法：當(dāng)前第33頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：b.濃鹽酸法:當(dāng)前第34頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑷葡聚糖凝膠：

凝膠可將分子大小和形狀不同的物質(zhì)分離，好象用過篩的方法把大分子與小分子分開一樣。因此凝膠又稱為凝膠分子篩。葡聚糖凝膠是一種廣泛應(yīng)用的凝膠，它是由一定分子量的葡聚糖懸浮于有機(jī)相中，再加入交聯(lián)劑表氯醇使葡聚糖交聯(lián)聚合而成（可直接購買商品使用）。它適用于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的分離和提純。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。當(dāng)前第35頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

2.展開技術(shù):⑴展開劑的選擇（技術(shù)關(guān)鍵，對(duì)分離效果影響最大）：根據(jù)樣品的極性，溶解度以及吸附的活性等因素來選擇展開劑。原則１：展開劑對(duì)被分離物質(zhì)有一定的解吸能力（否則，不能將Ａ解吸下來，Ａ?xí)谠c(diǎn)不動(dòng)），但又不能太大（否則，Ａ不被吸附，而是跟著Ｓ一起跑，達(dá)不到分離的目的）；展開劑的極性應(yīng)略小于被分離物質(zhì)。原則２：展開劑對(duì)被分離物質(zhì)有一定的溶解度（否則，被頂出的Ａ不溶于Ｓ，就不會(huì)隨著Ｓ向前移動(dòng)）。當(dāng)前第36頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

2.展開技術(shù):⑴展開劑的選擇實(shí)際操作時(shí)，可參考下列溶劑的洗脫能力順序：

硅膠板上：乙腈＞二氧六環(huán)＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞二氯甲烷＞氯仿＞苯＞四氯化碳＞戊烷氧化鋁板上：乙酸＞甲醇＞異丙醇＞吡啶＞乙腈＞二甲亞砜＞乙酸乙酯＞二氧六環(huán)，丙酮＞二氯乙烷＞四氫呋喃＞二氯甲烷＞氯仿＞乙醚＞苯＞甲苯＞四氯化碳＞環(huán)己烷＞石油醚＞戊烷當(dāng)前第37頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

2.展開技術(shù):⑴展開劑的選擇說明:①實(shí)際工作中，某些溶劑的順序會(huì)有顛倒出入，所以以上順序只作參考。②實(shí)際工作中,更常用到二元、三元混合溶劑作展開劑，這時(shí)可參考有關(guān)資料。（例如，分離氨基酸時(shí)，可找有關(guān)氨基酸分離的資料）利用資料上報(bào)導(dǎo)的展開劑試驗(yàn)時(shí)，往往還要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來確定合適的展開劑。當(dāng)前第38頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

2.展開技術(shù):⑵展開方式:

a.上升法:適用于硬板。b.傾斜上升法:適用于軟板。c.下降法:此法受重力影響，展開速度較快，但有時(shí)前沿不整齊。d.雙向展開:使用方形玻板，樣品點(diǎn)在角上，先用一種展開劑展開，將玻板轉(zhuǎn)動(dòng)90°后,再用另一種展開劑展開。此法適用于較復(fù)雜的樣品。當(dāng)前第39頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

3.顯色技術(shù):⑴蒸汽顯色:碘、溴、濃氨水等，放在干燥器中;

薄板揮去展開劑，放在上述干燥器中，顯色時(shí)間與靈敏度隨化合物而異。碘遇有機(jī)物顯黃－黃棕色斑點(diǎn)，拿出后迅速用鉛筆畫下斑點(diǎn)的形狀及位置。當(dāng)前第40頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

3.顯色技術(shù):多數(shù)有機(jī)化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點(diǎn)，這種反應(yīng)有可逆及不可逆兩種情況。前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點(diǎn)逐漸消退，并且不會(huì)改變化合物的性質(zhì)，且靈敏度也很高，故是定位時(shí)常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強(qiáng)了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強(qiáng)烈而穩(wěn)定的熒光，對(duì)定性及定量都非常有利。當(dāng)前第41頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

3.顯色技術(shù):⑵噴霧顯色:

將顯色劑(與被分離物質(zhì)有顏色反應(yīng)的物質(zhì))配成溶液，裝入噴霧器中，噴灑在薄板上，必要時(shí)可用熱吹風(fēng)加熱。(見教材P267表10-1及陳耀祖書P47附錄.顯色劑)當(dāng)前第42頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

五、應(yīng)用1.定性：

以Rf值為指標(biāo)。在一定條件下，各種有機(jī)物的Ｒf值是特定的常數(shù)，但“一定的條件”不易保證（如吸附劑的活性、取樣量的大小、展開槽的飽和程度、邊緣效應(yīng)、薄板的厚度、展開方式等），所以最好用標(biāo)準(zhǔn)樣品做對(duì)照。當(dāng)前第43頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

五、應(yīng)用1.定性：應(yīng)用實(shí)例：例１用薄層色譜分離測(cè)定表面活性劑：硅膠G，碘蒸氣顯色硅膠G，碘蒸氣顯色C18反相硅膠板，碘蒸氣顯色展開劑：CH2Cl2/CH3OH(8∶1)展開劑：CH2Cl2/CH3OH/HAc(8∶1∶0.75)展開劑：C2H5/2%Na2B4O7.10H2O(8∶2)陰離子表面活性劑Rf陽離子表面活性劑Rf非離子表面活性劑Rf十二烷基硫酸鈉0.15十六烷基三甲基氯化銨0.21十二烷基酚聚氧乙烯醚0.54十二烷基苯磺酸鈉0.09十六烷基氯化吡啶0.27月桂酸鈉0.70十二烷基胺0.42乙烯加合物(n=10)0.70二辛基硫代琥珀酸鈉0.28十八烷基胺0.55壬基酚聚氧乙烯醚(n=5)0.45當(dāng)前第44頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

五、應(yīng)用1.定性：例２氨基酸的分離：試樣：天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸的混合物。吸附劑：硅膠Ｇ(厚0.25mm).展開劑：①水：乙醇：乙酸(1:5:0.1);②苯酚:水(4:1)

展開距離：10厘米(約45min)

顯色：茚三酮正丁醇溶液，110℃加熱，天冬氨酸顯紫色，其余均顯桃紅色。

根據(jù)此法可設(shè)計(jì)豬皮、羊皮、牛皮中各種氨基酸含量的分析方法。當(dāng)前第45頁\共有54頁\編于星期四\4點(diǎn)第二章薄層色譜

五、應(yīng)用1.定性：ＴＬＣ在定性方面的應(yīng)用，除了鑒定示知物以外，還有下列用途①檢驗(yàn)藥物的純度及其中的雜質(zhì)。將藥樣溶液點(diǎn)在薄板上，經(jīng)展開后，應(yīng)只出現(xiàn)一個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)樣品位置一致的斑點(diǎn)，若試樣出現(xiàn)另外的斑點(diǎn)，即表明其中有雜質(zhì)存在。若事先測(cè)也顯色劑對(duì)雜質(zhì)的取小檢出量，則可用薄層色譜法做雜質(zhì)的限量檢查。例如，若最小檢出量為0.5μg,在薄層上點(diǎn)樣100μg后,不出現(xiàn)雜質(zhì)的斑點(diǎn)，即說明試樣的純度不低于9