第一章基因工程的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)演示文稿

第一章基因工程的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)優(yōu)選第一章基因工程的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前第2頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3等位基因（allele）：指一個(gè)基因突變而產(chǎn)生的多種形式之一。在二倍體真核生物中，等位基因成對(duì)存在于一對(duì)同源染色體的特定基因座上。在原核生物中，等位基因單獨(dú)存在于染色體上或染色體外（如質(zhì)粒上）。重疊基因的存在表明原核基因的編碼是可以重復(fù)的，可節(jié)省堿基資源，以有限的核酸序列編碼更多的信息。斷裂基因的證實(shí)顯示真核基因多為不連續(xù)的編碼。當(dāng)前第3頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)4二、遺傳的中心法則基因表達(dá)：指DNA分子經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生與之互補(bǔ)的RNA分子。當(dāng)前第4頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)5細(xì)胞分裂依賴(lài)于DNA的復(fù)制從而使染色體復(fù)制。兩條互補(bǔ)的反向平行的DNA單鏈之間由眾多氫鍵的連接，從而形成穩(wěn)定的DNA雙鏈分子。

DNA合成的起始需要引物提供3’羥基，DNA聚合酶按照5’3’方向合成DNA。（一）DNA合成當(dāng)前第5頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)6也稱(chēng)為DNA的轉(zhuǎn)錄，需要RNA聚合酶的催化，以單鏈DNA為模板合成一條互補(bǔ)的RNA序列，將遺傳信息從DNA傳遞到RNA。與DNA合成的區(qū)別：a.轉(zhuǎn)錄時(shí)只有一條DNA鏈模板，復(fù)制時(shí)兩條鏈都作為模板。b.DNA-RNA雜合雙鏈不穩(wěn)定，RNA合成后釋放；DNA復(fù)制，新鏈和母鏈結(jié)合形成子鏈。c.RNA合成不需引物，DNA復(fù)制需要引物；d.轉(zhuǎn)錄的底物是rRNA，復(fù)制的底物是dNTP；e.所用的聚合酶系不同。（二）RNA合成當(dāng)前第6頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)(三)蛋白質(zhì)合成7

蛋白質(zhì)合成涉及細(xì)胞中的翻譯裝置——核糖體，由大量的rRNA和核糖體蛋白組成的。

DNA基因序列忠實(shí)地轉(zhuǎn)錄成mRNA，其三聯(lián)密碼子含有蛋白質(zhì)合成的信息，稱(chēng)為遺傳密碼。共64個(gè)密碼子，其中61個(gè)有義密碼子編碼20個(gè)氨基酸，3個(gè)無(wú)義密碼子作為翻譯的終止密碼子（UGA），61個(gè)有義密碼子中有一個(gè)是翻譯的起始密碼子（AUG），它編碼甲硫氨酸。當(dāng)前第7頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)8核糖體結(jié)合到mRNA的5’端，開(kāi)始蛋白質(zhì)的合成。第一個(gè)氨基酸通常為甲硫氨酸。核糖體以

5’3’的方向閱讀密碼子結(jié)束mRNA，直到終止密碼子結(jié)束。在任何DNA序列中，理論上一個(gè)蛋白質(zhì)或一個(gè)多肽的連續(xù)的密碼子系列稱(chēng)為可讀框。當(dāng)前第8頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)三、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)——操縱子模型9乳糖操縱子：6000bp操縱基因O3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：lacZ、lacY和lacA。乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的決定因素：阻遏蛋白當(dāng)前第9頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)E.ColilacIq突變：lac阻遏蛋白基因超表達(dá)，使阻遏蛋白水平大大提高，結(jié)果高度阻遏了操縱子。lac啟動(dòng)子突變（如lacUV5啟動(dòng)子突變）：雖然這類(lèi)突變不改變操縱子的阻遏，但增加了啟動(dòng)子的活性。用IPTG誘導(dǎo)這兩種突變的菌株，其表達(dá)可超過(guò)野生型菌株100倍。當(dāng)前第10頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)11藍(lán)白斑篩選β-半乳糖苷酶的活性可作為基因活性的指標(biāo)。可使發(fā)色底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。lacZ′基因是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含此基因的重組載體轉(zhuǎn)化lacZ′互補(bǔ)型菌株，可轉(zhuǎn)譯β-半乳糖苷酶，在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基上可使轉(zhuǎn)化子成為藍(lán)色菌落。當(dāng)前第11頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)12一、核酸大分子的結(jié)構(gòu)第二節(jié)核酸的生物化學(xué)生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬(wàn)或更多的有機(jī)分子。常見(jiàn)的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖，其中核酸、蛋白質(zhì)是機(jī)體的兩類(lèi)最基本的生物大分子，它們都屬于信息分子。DNA遺傳信息的載體、mRNA遺傳信息傳遞的中介物、蛋白質(zhì)遺傳信息表達(dá)的終產(chǎn)物。當(dāng)前第12頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)二、DNA雙螺旋的變性與復(fù)性變性：指在一定條件下（高溫或變性劑等）DNA雙螺旋解鏈的過(guò)程。解鏈溫度：在DNA變性進(jìn)行到一半時(shí)的溫度。對(duì)260nm紫外光的吸收率——光密度值（OD），可用來(lái)檢測(cè)溶液中DNA單鏈或雙鏈的濃度。復(fù)性：指DNA分子由單鏈狀態(tài)恢復(fù)到雙鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程，又稱(chēng)退火。當(dāng)前第13頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。當(dāng)前第14頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)變性后的理化性質(zhì)變化：

粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加當(dāng)前第15頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈

階梯式曲線GC含量與Tm值之間的關(guān)系

（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44

Tm=(G+C)%×0.41+69.3當(dāng)前第16頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)復(fù)性過(guò)程①單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈②局部雙鏈周?chē)膲A基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離③局部雙鏈周?chē)膲A基如配對(duì)，則形成中心序列④形成完整的雙鏈分子當(dāng)前第17頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)參數(shù)對(duì)Tm的影響對(duì)復(fù)性速率的影響堿基的成分Tm值隨G-C含量的增加而增加無(wú)序列的長(zhǎng)度Tm值隨序列長(zhǎng)度的增加而增加，當(dāng)>500bp時(shí)，Tm值不受影響隨序列長(zhǎng)度的增加而上升離子濃度Tm值隨Na+濃度的增加而增加最理想的Na+濃度為1.5M堿基錯(cuò)配比例最理想的值隨堿基錯(cuò)配比例（%）的增加而下降隨堿基錯(cuò)配比例而下降DNA濃度不影響Tm值隨Na+濃度的增加而增加變性劑Tm值隨甲酰胺和尿素濃度的增加而減少最理想的甲酰胺濃度為50%溫度不適用最理想的溫度是低于Tm20℃各種影響DNA變性和復(fù)性的因素當(dāng)前第18頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)第三節(jié)分子雜交分子雜交：又稱(chēng)為核酸分子雜交，是用一條單鏈DNA或RNA與另一被測(cè)單鏈DNA形成互補(bǔ)雙鏈分子的過(guò)程，以測(cè)定某特異序列是否存在。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱(chēng)探針。雜交都必須有探針的存在。就是用同位素或非同位素，如熒光染料、生物素等標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA序列。當(dāng)前第19頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)一、原位分子雜交分兩種：玻片原位雜交和膜上原位雜交。玻片原位雜交：要先制片，如中期染色體片和組織切片等。片子制好后不染色，放在緩沖液中慢慢變性，再加入探針讓其復(fù)性，將沒(méi)有結(jié)合的探針充分洗脫。若用同位素標(biāo)記探針，須在片子涂一層乳膠或覆蓋一張同樣大小的X光片進(jìn)行放射自顯影，再觀察同位素的曝光點(diǎn)在組織細(xì)胞或染色體上的相對(duì)位置。若用熒光標(biāo)記，可用熒光顯微鏡直接觀察。此方法用來(lái)進(jìn)行染色體的基本定位或觀察組織中不同的RNA分布。當(dāng)前第20頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)膜上原位雜交：將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜上，這種膜只吸附單鏈DNA，將影印好的膜用NaOH處理，不僅可殺死細(xì)菌，還可使DNA變性吸附在膜上，再用無(wú)關(guān)的單鏈DNA，如小牛胸腺DNA和鮭魚(yú)精子DNA吸附在膜上的空白處，稱(chēng)為預(yù)雜交（防止探針被吸附在背景上，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果），膜經(jīng)中和后再將同位素探針和膜放在緩沖溶液中緩緩復(fù)性，經(jīng)放射自顯影來(lái)確定陽(yáng)性菌落。常用于從基因文庫(kù)中釣基因。當(dāng)前第21頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)*22熒光上原位雜交（FISH）：用熒光標(biāo)記的核酸探針在中期染色體上進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下觀察，以確定與探針互補(bǔ)的核酸序列在染色體的位置和分布。常用作基因定位、基因診斷等。一種FISH的擴(kuò)展是染色體涂染，來(lái)自特異染色體或染色體區(qū)域的一套已知克隆DNA用不同的熒光染料標(biāo)記，這些染料使特異區(qū)域著色，這樣在熒光顯微鏡下易于鑒別。如一個(gè)尚未定位的基因克隆用不同的染料標(biāo)記，那么它的位置在一系列不同的染色帶中被鑒別出。當(dāng)前第22頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)23二、芯片技術(shù)DNA芯片，也稱(chēng)基因芯片或微陣列，是利用反相雜交原理，使用固定化的探針陳列與樣品雜交，通過(guò)熒光掃描和計(jì)算機(jī)分析，獲得樣品中大量基因及表達(dá)信息的一種高通量生物信息分析技術(shù)。當(dāng)前第23頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)24三、印跡雜交（一）DNA印跡即Southern雜交，1975年由英國(guó)人埃德溫·邁勒·薩瑟恩（EdwinMellorSouthern）創(chuàng)建。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析、基因突變分析、特性基因定性和定量及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。當(dāng)前第24頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)1、待測(cè)核酸樣品的制備

1）裂解或破碎細(xì)胞

2）抽取純化基因組DNA

3）限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段2、待測(cè)DNA樣品的電泳分離

1）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠

2）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快， 大小相同的分子處于同一條帶

3）分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記當(dāng)前第25頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)263、凝膠中核酸的變性(堿變性)凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性為單鏈DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。使用稀HCl使DNA脫嘌呤，這樣可以讓DNA片段變短，提高轉(zhuǎn)移效率。4、Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過(guò)程。當(dāng)前第26頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)271）固相支持物的選擇a.理想的固相支持物應(yīng)具備的特性： ①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 ②不影響與探針的雜交反應(yīng) ③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 ④具有良好的機(jī)械性能 ⑤非特異吸附少當(dāng)前第27頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)b.常用的固相支持物

①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本 底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 ③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低當(dāng)前第28頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2）Southern印跡的常用方法a.毛細(xì)管虹吸印跡法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中 的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。當(dāng)前第29頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)基本原理：

容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。55當(dāng)前第30頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)b.電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。當(dāng)前第31頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)c.真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾 膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。當(dāng)前第32頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)5、Southern雜交

1）預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交，緩沖液為不含DNA探針的雜交液。

2）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交。

3）洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA。當(dāng)前第33頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)6、雜交結(jié)果檢測(cè)1）放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針。2）比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針。當(dāng)前第34頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第35頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（二）RNA印跡（Northern印跡雜交）

1、基本原理和基本過(guò)程與Southernblot基本相同

2、對(duì)待檢樣品中mRNA的長(zhǎng)度和豐度進(jìn)行分析

3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA

RNA印跡可以測(cè)定某基因表達(dá)的時(shí)空特異性。當(dāng)前第36頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)37Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性。前者采用的變性劑是甲醛或聚乙二醇，后者只是采用NaOH。

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理。

3、靶核酸為RNA。當(dāng)前第37頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（三）蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）

1、用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)而不是檢測(cè)核酸。

2、不用毛細(xì)管原理，而是通過(guò)電場(chǎng)的作用將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)電泳帶轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以親和反應(yīng)或免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的技術(shù)。 當(dāng)前第38頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（四）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交

1、斑點(diǎn)印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA

4、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量當(dāng)前第39頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)40東方印跡（Easternblotting）用來(lái)檢測(cè)真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)。檢測(cè)目標(biāo)是蛋白質(zhì)上特定的修飾基因或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等。利用雙向電泳分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)到膜上，再用特定探針去檢測(cè)。西南方印跡（Southwesternblotting）結(jié)合蛋白質(zhì)印跡和DNA印跡的特點(diǎn)，用于檢測(cè)序列特異性DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合。首先用SDS的方法將蛋白質(zhì)分離開(kāi)并轉(zhuǎn)移到膜上，在尿素的存在下去除SDS，使蛋白質(zhì)復(fù)性，最后用放射性雙鏈DNA探針與吸印在硝酸纖維素膜的核提取蛋白結(jié)合，來(lái)鑒別DNA結(jié)合蛋白。用于檢測(cè)蛋白的分子質(zhì)量。（五）其他印跡當(dāng)前第40頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)41四、異源雙鏈定位法和R環(huán)定位法異源雙鏈定位法：將異源DNA雙鏈變性后進(jìn)行分子雜交，然后在電鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)有環(huán)形不配對(duì)的部分，表明可能存在缺失。R環(huán)定位法：將標(biāo)記的mRNA和變性后的待測(cè)雙鏈DNA進(jìn)行雜交，制片后，可以以觀察到R環(huán)，這是由于RNA和DNA形成的雙鏈比原來(lái)的DNA雙鏈更為穩(wěn)定，將一條DNA單鏈置換了出來(lái)，表明這些釋放出的環(huán)狀單鏈DNA部分是內(nèi)含子。主要用來(lái)進(jìn)行基因定位、內(nèi)含子的探測(cè)及DNA缺失的確定等。當(dāng)前第41頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)42第四節(jié)基因工程中常采用的酶類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類(lèi)—用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化檢測(cè)等。一、限制性核酸內(nèi)切酶二、DNA連接酶和激酶三、DNA聚合酶和RNA聚合酶當(dāng)前第42頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)一、限制性核酸內(nèi)切酶DNA體外重組，首先必須獲得需要重組和能夠重組的DNA片段用限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切DNA分子是獲得這種DNA片段的主要途徑。當(dāng)前第43頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶－基因的剪刀當(dāng)前第44頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（一）限制性?xún)?nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease）概念是一類(lèi)能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切斷雙鏈DNA磷酸二酯鍵的核酸水解酶。按其性質(zhì)可分為3大類(lèi)。Ⅰ型有特定的識(shí)別順序，但是切點(diǎn)與之有一定距離。反應(yīng)要求有ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α、β和γ亞基組成。全酶兼有限制性?xún)?nèi)切酶的活性和甲基化酶的活性。Ⅲ型與Ⅰ型有相似特征，只是切點(diǎn)距識(shí)別順序距離是嚴(yán)格的。Ⅱ型酶，獨(dú)立的限制性核酸內(nèi)切酶，不兼有甲基化酶的活性，切點(diǎn)在識(shí)別順序中。Ⅱ型的酶只有單一的亞基，以二體或四體發(fā)揮作用。當(dāng)前第45頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)上述3個(gè)酶系統(tǒng)中，只有II型限制酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。如果沒(méi)有專(zhuān)門(mén)說(shuō)明，通常所說(shuō)的限制性?xún)?nèi)切是Ⅱ型酶。限制性?xún)?nèi)切核酸酶一般以酶源生物的屬名和種名前1、2個(gè)字母以及株（型）代號(hào)來(lái)命名。如果從同一種生物中先后提取到多種限制性?xún)?nèi)切核酸酶，則依次用羅馬數(shù)字表示。例如，從HaemophilusinfiuenzaeRd中提取到的第3種限制性?xún)?nèi)切核酸酶被命名為HindⅢ（前三個(gè)字母必須是斜體）。當(dāng)前第46頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（二）限制性?xún)?nèi)切核酸酶特點(diǎn)1.識(shí)別順序和酶切位點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切核酸酶在雙鏈DNA上能夠識(shí)別的核苷酸序列被稱(chēng)為識(shí)別序列。1）多數(shù)識(shí)別４-8個(gè)相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；2）富含GC當(dāng)前第47頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3）對(duì)稱(chēng)性—雙對(duì)稱(chēng)這些酶的識(shí)別順序大都具有180°旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的特征。

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’當(dāng)前第48頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)4）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外DNA在限制性?xún)?nèi)切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置被稱(chēng)為酶切位點(diǎn)，可用↓表示。限制性?xún)?nèi)切核酸酶在DNA上的酶切位點(diǎn)一般是在識(shí)別序列內(nèi)部，如：C↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓CC、AGCGC↓T等。少數(shù)限制性?xún)?nèi)切核酸酶在DNA上的酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列的兩側(cè)，如：↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等。5）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH當(dāng)前第49頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.

末端種類(lèi)有時(shí)切口可帶有一個(gè)短的單鏈末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。這種短的單鏈末端，稱(chēng)為“粘性末端”，它與對(duì)應(yīng)的單鏈末端很容易恢復(fù)原來(lái)的堿基配對(duì)，而粘接成雙鏈。

1）3’-端突起，個(gè)數(shù)為2或4個(gè)核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

2）5’-端突起，個(gè)數(shù)為2或4個(gè)核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’當(dāng)前第50頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第51頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第52頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3）

平齊末端切口有時(shí)是平頭的，即雙鏈的切點(diǎn)位置相同，如AluⅠ和HaeⅢ等。

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

4）非互補(bǔ)的粘性末端

a）切點(diǎn)在識(shí)別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

b）能識(shí)別簡(jiǎn)并順序的，如：AvaI

AvaI5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG；CTCGGG；CCCGAG；CTCGAG

當(dāng)前第53頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第54頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)酶切位點(diǎn)在識(shí)別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATGNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNNN-5’FokI37℃5’-GGATGNNNNNNNNN-OH3’3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNN-P5’當(dāng)前第55頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)5）相容性末端有些限制性?xún)?nèi)切核酸酶雖然識(shí)別序列不同，但是酶切DNA分子產(chǎn)生的DNA片段具有相同的黏性末端，稱(chēng)這樣的一組限制性?xún)?nèi)切核酸酶為同尾酶（isocaudarner）。

如TaqI，ClaI和AccI為一組同尾酶，其中任何一種酶酶切DNA分子，均產(chǎn)生5’-CG黏性末端。同尾酶在基因重組操作中有特殊的用途。當(dāng)把同尾酶切割的DNA片斷與原來(lái)的限制性?xún)?nèi)切酶切割的DNA片段連接后，原來(lái)的酶切位點(diǎn)將不存在。當(dāng)前第56頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)有的限制性?xún)?nèi)切核酸酶可識(shí)別2種以上的核苷酸序列。如AccⅠ即可識(shí)別GTATAC，又可識(shí)別GTCGAC；DdeI可識(shí)別的核苷酸序列有CTAAG、CTTAG、CTGAG和CTCAG共4種。當(dāng)前第57頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)另有一些限制性?xún)?nèi)切核酸酶雖然來(lái)源不同，但是具有相同的識(shí)別序列。這樣的限制性?xún)?nèi)切核酸酶被稱(chēng)為同裂酶（isoschizomer），如BamHI和BstI為同裂酶，識(shí)別序列GGATCC。同裂酶可以具有不同的酶切位點(diǎn)（2種不同的限制性?xún)?nèi)切核酸酶），也可以具有相同的酶切位點(diǎn)（往往是從不同生物中提取到的同一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶）。當(dāng)前第58頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（三）限制酶的星反應(yīng)（staractivity）特點(diǎn)：限制酶識(shí)別序列特異性降低當(dāng)前第59頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)具有星反應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識(shí)別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,71.亞乙二醇(45%)；2.甘油(12%)；3.乙醇(12%)；4.高酶/DNA比(>25U/μg)；

5.Mn++代替Mg++；6.pH8.5；7.二甲基亞砜(8%)；8.無(wú)NaCl。當(dāng)前第60頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（四）其它特異性的內(nèi)切酶

1.λ末端酶（λterminase）：

識(shí)別結(jié)合特異性地切割λDNA的cos序列。

5’-GGGCGGCGACCTN--3’N--5’，出現(xiàn)的頻率約412

2.Omega核酸酶（I-SceI）：

由內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418，其識(shí)別順序?yàn)?/p>

5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’

TATT3.I-PpoI：來(lái)自于Physarumpolycephalum

識(shí)別序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT當(dāng)前第61頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（五）限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切1.反應(yīng)系統(tǒng)限制性?xún)?nèi)切核酸酶同其他酶類(lèi)一樣，反應(yīng)系統(tǒng)除酶本身外，還應(yīng)包括反應(yīng)底物和反應(yīng)緩沖液，并且還需要合適的反應(yīng)溫度。限制性?xún)?nèi)切核酸酶的反應(yīng)底物是環(huán)狀的或線形的雙鏈DNA分子（或DNA片段）。廠家提供某種限制性?xún)?nèi)切核酸酶時(shí)一般同時(shí)提供一種相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液。大多數(shù)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的最適反應(yīng)溫度是37℃。當(dāng)前第62頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.酶切方法常用的酶切方法有單酶切、雙酶切和部分酶切等幾種。（1）單酶切法這是用一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切DNA樣品。若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產(chǎn)生與識(shí)別序列數(shù)（n）相同的DNA片段數(shù)，并且DNA片段的兩末端相同。若DNA樣品本來(lái)就是線形DNA片段，完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生n+1個(gè)DNA片段數(shù)，其中有2個(gè)片段的一端仍保留原來(lái)的末端。當(dāng)前第63頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（2）雙酶切法這是用2種不同的限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切同一種DNA分子的方法。

考慮緩沖液DNA分子無(wú)論是環(huán)狀DNA分子，還是線形DNA片段，酶切結(jié)果，DNA片段的2個(gè)黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。環(huán)狀DNA分子完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)是兩種限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別序列數(shù)之和。線形DNA片段完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)是兩種限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別序列數(shù)之和加1。當(dāng)前第64頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（3）部分酶切指選用的限制性?xún)?nèi)切核酸酶對(duì)其在DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)行不完全的酶切。導(dǎo)致部分酶切的原因底物DNA的純度低、識(shí)別序列的甲基化、酶用量不足、反應(yīng)時(shí)間不夠以及反應(yīng)緩沖液和溫度不適宜等。部分酶切會(huì)影響需要的DNA片段的得率。但是從另一方面說(shuō)，有時(shí)根據(jù)重組DNA的需要，還專(zhuān)門(mén)創(chuàng)造部分酶切的條件，以獲得需要的DNA片段。當(dāng)前第65頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)AB標(biāo)示反了？BA當(dāng)前第66頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（六）限制酶的用途

1、DNA重組

2、限制酶（物理）圖譜繪制3、突變分析（RFLP分析）4、限制酶的部分酶切與完全酶切當(dāng)前第67頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)二、DNA連接酶和激酶基因工程的實(shí)質(zhì)是基因重組?；蛑阅軌蛟谠嚬軆?nèi)進(jìn)行重組，是因?yàn)镈NA片段在DNA連接酶作用下能夠進(jìn)行連接，組成重組DNA分子。當(dāng)前第68頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)1.DNA連接酶（DNAligase）概念能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’-OH末端與

5’-磷酸末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于試管中連接DNA片段的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。E.coli

DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，而T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。當(dāng)前第69頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.DNA片段之間的連接（1）具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接連接反應(yīng)可用E.coliDNA連接酶，也可用T4DNA連接酶。待連接的兩個(gè)DNA片段的末端如果是用同一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切的，連接后仍保留原限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。如果是用2種同尾酶酶切的，雖然產(chǎn)生相同的互補(bǔ)黏性末端，可以有效地進(jìn)行連接，但是獲得的重組DNA分子往往消失了原來(lái)用于酶切的那兩種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。當(dāng)前第70頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（2）具平末端DNA片段之間的連接連接反應(yīng)必須用T4DNA連接酶（圖b）。如果用2種不同限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的平末端DNA片段之間進(jìn)行連接后的DNA分子失去那2種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。如果2個(gè)DNA片段的末端是用同一種限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切后產(chǎn)生的，連接后的DNA分子仍保留那種酶的識(shí)別序列，有的還出現(xiàn)另一種新的限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別序列。當(dāng)前第71頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（3）DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接

待連接的兩個(gè)DNA片段經(jīng)過(guò)不同限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切后，產(chǎn)生的末端未必是互補(bǔ)黏性末端，或者未必都是平末端，因此無(wú)法進(jìn)行連接,在這種情況下，連接之前必須對(duì)兩個(gè)末端或一個(gè)末端進(jìn)行修飾。修飾的方式主要是采用核酸外切酶Ⅶ（ExoⅦ）將黏性末端修飾成平末端；采用末端轉(zhuǎn)移酶將平末端修飾成互補(bǔ)黏性末端；有時(shí)為了避免待連接的兩個(gè)DNA片段自行連接成環(huán)形DNA，或二聚體、多聚體，可采用堿性磷酸酯酶將其中一種DNA片段5’末端的一P修飾成一OH。當(dāng)前第72頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（4）DNA片段加銜接頭后連接如果要連接既不具互補(bǔ)黏性末端又不具平末端的兩種DNA片段，除了上述用修飾一種或兩種DNA片段末端后進(jìn)行連接的方法外，還可以采用人工合成的銜接頭。先將銜接頭連接到待連接的1種或2種DNA片段的末端，然后用合適的限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切銜接頭，使待連接的兩種DNA片段具互補(bǔ)黏性末端，最后在DNA連接酶催化下使兩種DNA片段連接，產(chǎn)生重組DNA分子。此外，也可以根據(jù)兩DNA片段的末端，選用合適的銜接頭直接把兩DNA片段連接在一起。當(dāng)前第73頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3、激酶

通過(guò)催化ATP的γ-磷酸基共價(jià)附著在靶分子上，磷酸化特異的底物。

T4噬菌體多核苷酸激酶是一種磷酸化DNA或RNA5’羥基的酶。用于[γ-32P]ATP標(biāo)記DNA5’端，也可對(duì)缺乏5’-磷酸的DNA或人工接頭進(jìn)行磷酸化。

細(xì)菌的堿性磷酸酯酶是一種去除DNA5’-磷酸的酶。用于T4噬菌體多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記前除去5’-磷酸，或用來(lái)處理經(jīng)切過(guò)的載體DNA，防止其重新環(huán)化而降低轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)前第74頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)2009-11-2666當(dāng)前第75頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)三、DNA聚合酶和RNA聚合酶以單鏈DNA作為模板，DNA聚合酶和RNA聚合酶可直接合成互補(bǔ)的核酸。DNA合成時(shí)需要具有3’羥基的DNA或RNA作為引物，而RNA可起始從頭合成。RNA聚合酶是催化RNA合成的酶。DNA聚合酶的特性PCR反應(yīng)時(shí)，需要用耐高溫的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶，其在75℃具有最佳活性，對(duì)95℃高溫具有良好的穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性當(dāng)前第76頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）當(dāng)前第77頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)基本用途當(dāng)前第78頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)T4DNA酶的基本特性：有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合 酶活性。在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3`-OH端外切－在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸。－在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。當(dāng)前第79頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)基本用途當(dāng)前第80頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2009-11-2655當(dāng)前第81頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNA

DNA連接酶

DNA聚合酶Ⅰ

Klenow片段

反轉(zhuǎn)錄酶 多聚核苷酸激酶 末端轉(zhuǎn)移酶 堿性磷酸酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接①合成雙鏈cDNA分子或片段連接②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補(bǔ)3′末端又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′聚合、3′→5′外切活性，而無(wú)5′→3′外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3′末端標(biāo)記等①合成cDNA②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基當(dāng)前第82頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)83測(cè)序酶：經(jīng)修飾后消除了3’5’外切酶活性的T7DNA聚合酶。

在體外反應(yīng)中用含有雙脫氧的核苷進(jìn)行鏈的終止。反轉(zhuǎn)錄酶：用來(lái)產(chǎn)生互補(bǔ)DNA（cDNA）；用于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可進(jìn)行放射標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶：反應(yīng)特點(diǎn)：底物：dNTP及衍生物，>3個(gè)核苷酸，要求3’-OH 端，需要單鏈DNA作為引物，以3’-突起端的雙鏈DNA為最高，亦可用于雙鏈DNA加尾。用于3’-加尾，便于兩DNA分子重組;3’-末端標(biāo)記當(dāng)前第83頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)84測(cè)序酶：經(jīng)修飾后消除了3’5’外切酶活性的T7DNA聚合酶。

在體外反應(yīng)中用含有雙脫氧的核苷進(jìn)行鏈的終止。反轉(zhuǎn)錄酶：用來(lái)產(chǎn)生互補(bǔ)DNA（cDNA）；用于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可進(jìn)行放射標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶：反應(yīng)特點(diǎn)：底物：dNTP及衍生物，>3個(gè)核苷酸，要求3’-OH 端，需要單鏈DNA作為引物，以3’-突起端的雙鏈DNA為最高，亦可用于雙鏈DNA加尾。用于3’-加尾，便于兩DNA分子重組;3’-末端標(biāo)記當(dāng)前第84頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)85第五節(jié)研究DNA和RNA的方法一、核酸的分離純化分離提取的核酸樣品，分為DNA和RNA，由于不同的實(shí)驗(yàn)要求，需用不同的方法進(jìn)一步純化，核酸純化的主要目標(biāo)是去除其中的蛋白、多糖、多酚、鹽離子等雜質(zhì)。核酸的純化、濃縮、

沉淀、定量、保存。當(dāng)前第85頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（一）核酸的純化DNA作為核酸內(nèi)切酶的底物，應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有酚、氯仿、乙醚、大于l0mmol/L的EDTA、去污劑（如SDS）以及過(guò)量的鹽離子濃度，這些因素的存在均可不同程度地影響限制性?xún)?nèi)切酶的活性。當(dāng)前第86頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)核酸純化的方法很多，不同的方法對(duì)應(yīng)于不同的研究目的。酚/氯仿抽提、超速離心、柱層析、分子雜交、免疫沉淀、凝膠電泳等方法。在此僅介紹從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的酚/氯仿抽提法。這個(gè)方法的標(biāo)準(zhǔn)程序是酚/氯仿（1:1）抽提1次，氯仿抽提1-2次，如果情況需要可再重復(fù)幾次。當(dāng)前第87頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)1、酚/氯仿抽提法的基本原理混合使用酚、氯仿（蛋白質(zhì)變性劑），以增加去除蛋白雜質(zhì)的效果。因?yàn)榉与m可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶的活性；而且酚能溶解10％-15％的水，從而能溶解一部分核酸，同時(shí)氯仿還能加速有機(jī)相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。在氯仿中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生氣泡。最后用氯仿抽提處理，是為了去除核酸溶液中的痕量酚。當(dāng)前第88頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)如果所提核酸的酶反應(yīng)條件要求極嚴(yán)格，最可靠的方法是再用水飽和的乙醚抽提一次，以徹底去除核酸樣品中的痕量酚與氯仿，然后在68℃水浴中放置10分鐘，使痕量乙醚蒸發(fā)掉。當(dāng)前第89頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.酚/氯仿抽提法的基本步驟如果DNA或RNA體積較小，一般于1.5ml的Eppendorf離心管中進(jìn)行，若體積較大則于10-50ml的離心管中進(jìn)行。1）在每一樣品中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）溶液。2）若DNA片段小于l0kb，可以振蕩混合；

大于l0kb，則反復(fù)輕柔地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，形成乳狀液。（切勿使用高速的振蕩器）3）室溫下，于10000×g以上（一般要10000-12000rpm以上）離心l0分鐘。當(dāng)前第90頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)4）吸取上層水相于一個(gè)新的離心管中。如果DNA的分子量較大，可將槍頭的尖端剪去一截，以增大槍頭口的直徑。吸取速度要慢而勻，這樣既減少吸液時(shí)的機(jī)械剪切，又可盡量避免吸取界面處的蛋白雜質(zhì)層。5）加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）溶液，重復(fù)步驟(2)、(3)、(4)。6）向核酸溶液中加入等體積的水飽和乙醚，混勻，靜止2-5分鐘，分層，含核酸樣品的水相在下層（乙醚高度揮發(fā)、易燃，應(yīng)在通風(fēng)廚中工作）。7）移棄上層乙醚。8）將核酸溶液于68℃水浴5-10分鐘，不時(shí)用手指彈動(dòng)管壁，使乙醚蒸發(fā)。

（第6-8步一般不用）9）乙醇沉淀核酸。當(dāng)前第91頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3.酚/氯仿抽提法的注意事項(xiàng)1）必須采用Tris緩沖液平衡后的重蒸酚，pH必須在8.0，中性尤其是酸性酚，在核酸沉淀中會(huì)導(dǎo)致DNA沉淀而隨雜質(zhì)一塊丟失。2）該法只能去除核酸中的蛋白雜質(zhì)，而多酚、多糖等雜質(zhì)則很難除去。3）如果對(duì)DNA去蛋白效果要求更高，可以在酚/氯仿/異戊醇抽提后又重復(fù)1次抽提。當(dāng)前第92頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)4）如果要求非常徹底地去除產(chǎn)物中的痕量酚，可以在氯仿/異戊醇抽提后又重復(fù)一次抽提。5）常規(guī)實(shí)驗(yàn)中一般對(duì)痕量殘存氯仿的去除效果要求不太高，可以省略乙醚抽提過(guò)程，氯仿/異戊醇抽提后直接用乙醇沉淀。6）根據(jù)DNA片斷長(zhǎng)度及研究目的而選擇合適的混勻方式和力度很重要，總的原則是讓酚/氯仿/異戊醇，或氯仿/異戊醇與核酸水相混勻成乳狀液并保持10分鐘左右才能達(dá)到去蛋白的效果。當(dāng)前第93頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)7）若是大分子量DNA可以將樣品在預(yù)冷的STE（pH7.8）中充分透析，以減少對(duì)大分子量核酸的機(jī)械損傷。8）乙醚在室溫下應(yīng)保存在通風(fēng)櫥中或試劑架上。千萬(wàn)不能放入冰箱（冰箱自動(dòng)化霜后起動(dòng)打火，揮發(fā)的乙醚發(fā)生爆炸）。9）在酚中加入0.1%8-羥基喹啉可以延長(zhǎng)保存時(shí)間和提高純化效果。當(dāng)前第94頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（二）核酸的濃縮一般情況下抽提的核酸液在去除雜質(zhì)后，可直接進(jìn)行沉淀，而無(wú)需進(jìn)行核酸的濃縮。但若溶液中DNA含量低，并且體積較大，不易進(jìn)行乙醇沉淀，可以采用以下2種方法，減少溶液體積并濃縮核酸。當(dāng)前第95頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)1.固體聚乙二醇（PEG）吸水濃縮法1）將DNA溶液裝入透析袋，透析完畢后，置于一平皿中。2）加人適量PEG（分子量6000-12000）包埋透析袋。3）待PEG吸濕（大約10分鐘）后，再換新的PEG顆粒包圍透析袋，

重復(fù)步驟（2）、（3），直到體積合適。4）用TE懸浮透析袋，漂洗凈表面的PEG。5）取出透析袋中的DNA溶液，分裝貯存?zhèn)溆?，或再用乙醇沉淀回收DNA。當(dāng)前第96頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.丁醇抽提濃縮法正丁醇或仲丁醇抽提水溶液時(shí)，可將溶液中的水吸入有機(jī)相，而溶液中的溶質(zhì)（DNA）則不會(huì)分配到正丁醇中去。利用該特性，可以顯著減少DNA溶液的體積。1）在DNA溶液中，加入等體積丁醇，充分混合，（加入過(guò)多的丁醇會(huì)使溶液中的水迅速丟失，而導(dǎo)致DNA沉淀）2）以1600×g離心1分鐘，棄上層有機(jī)相。3）重復(fù)步驟(1)、(2)，以達(dá)到所需體積。4）用水飽和乙醚抽提2次，可去除痕量丁醇，然后在68℃條件下，蒸發(fā)去除痕量乙醚。丁醇抽提，并不能去除溶液中鹽類(lèi)，抽提后可利用乙醇沉淀回收DNA。當(dāng)前第97頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（三）核酸的沉淀1.有機(jī)沉淀劑乙醇等有機(jī)溶劑能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來(lái)。Na+等離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽，在許多種有機(jī)溶劑中不溶解。優(yōu)點(diǎn)通過(guò)核酸沉淀來(lái)改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)節(jié)核酸在溶液中的濃度；可去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)，在一定程度上純化核酸。當(dāng)前第98頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)1）乙醇沉淀DNA乙醇是首選的有機(jī)溶劑，它對(duì)鹽類(lèi)沉淀少，DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸發(fā)去除，不影響以后的實(shí)驗(yàn)。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，2倍樣品體積的無(wú)水乙醇可有效沉淀DNA，

對(duì)于RNA則需要將乙醇量增至2.5倍樣品體積。2）異丙醇

倍樣品體積的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，對(duì)5SrRNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀。優(yōu)點(diǎn)：所需體積小且速度快，適用于濃度低、而體積大DNA樣品的沉淀。缺點(diǎn)：易使鹽類(lèi)（如NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；

DNA沉淀中的異丙醇難以除去（可用70％的乙醇漂洗DNA沉淀）。當(dāng)前第99頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3）聚乙二醇可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同分子量的DNA片段。應(yīng)用6000分子量的PEG進(jìn)行沉淀時(shí)，其使用濃度與DNA片段的大小成反比。除去DNA沉淀中PEG最簡(jiǎn)便有效的辦法是用70％的酒精漂洗2次。4）精胺使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)，與DNA分開(kāi)。要求在溶液中無(wú)鹽或低鹽（小于0.1mol/L）。用70％的乙醇漂洗沉淀或透析，可去除DNA沉淀中的痕量精胺。當(dāng)前第100頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.鹽類(lèi)大多數(shù)金屬鹽都能在短時(shí)間內(nèi)與核酸形成沉淀。使用最多的是1價(jià)陽(yáng)離子，包括鈉、鉀、銨和鋰等離子，但2價(jià)鎂離子的沉淀效力最高。醋酸鈉（NaAc）為沉淀核酸的最常用的鹽類(lèi)，終濃度為0.3mol/L（pH5.2）。醋酸鉀（KAc）使用濃度、沉淀效果與NaAc相同，但核酸的鉀鹽形式很難溶于含SDS（十二烷基硫酸鈉）的溶液。氯化鋰（LiCl）0.8mol/L終濃度的LiCl不與DNA共沉淀，但可直接沉淀大分子量的RNA，故常應(yīng)用于RNA的沉淀。當(dāng)前第101頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)氯化鈉對(duì)于含SDS的DNA，最好用NaCl沉淀，終濃度為0.2mol/L；SDS在70％的乙醇中保持溶解狀態(tài)，在乙醇漂洗時(shí)除去。醋酸銨dNTP在醋酸銨鹽溶液中具有較高的溶解度，乙醇沉沉DNA中，加入一定濃度的醋酸銨，可去除大部分dNTP。（銨鹽是T4噬菌體多核苷酸激酶的抑制劑）氯化鎂Mg2+是核酸沉淀中的有效離子，當(dāng)核酸濃度低于0.1μmo1或長(zhǎng)度小于100個(gè)核苷酸時(shí)，加入Mg2+可明顯提高核酸的沉淀效率，（鎂離子對(duì)DNA降解有促進(jìn)作用，且不利于大分子量的DNA的溶解）當(dāng)前第102頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)3.核酸沉淀的溫度與時(shí)間在一般條件下的DNA沉淀，使用0℃冰水、10-15分鐘足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。當(dāng)前第103頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)4.離心力與離心時(shí)間多數(shù)DNA沉淀在4℃、12000×g、離心10分鐘即可，濃度低于20ng/ml的的DNA沉淀，上述離心條件也可完成。如DNA片段小于100個(gè)核苷酸時(shí)，則需要超速離心。對(duì)于pg水平的核酸沉淀，則應(yīng)加入tRNA作為載體進(jìn)行共沉淀。超速離心每分鐘60,000轉(zhuǎn)以上當(dāng)前第104頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)5.核酸沉淀的操作方法（1）乙醇沉淀DNA（7步）1）在DNA溶液中加入1/10容積的醋酸鈉，終濃度為0.3mol/L，混勻溶液，對(duì)于大片段DNA不能振蕩，應(yīng)輕輕反復(fù)翻動(dòng)離心管混勻。2）加入2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，

混勻后置于冰上15-30分鐘，讓DNA沉淀。3）4℃、12000×g、離心10分鐘，使DNA沉于管底。當(dāng)樣品濃度小于20ng/ml或DNA片段小于100bp時(shí)，需加大離心力和延長(zhǎng)離心時(shí)間。當(dāng)前第105頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)4）45度角斜拿離心管，用移液槍從沉淀的對(duì)面緊貼管壁處輕輕吸出乙醇。5）加入70％的乙醇至管2/3體積，混勻漂洗以去除殘余的鹽，4℃、12000×g、離心2分鐘，吸去乙醇。重復(fù)該步驟漂洗一次。6）敞蓋于室溫中10-15分鐘干燥DNA至沒(méi)有明顯乙醇痕跡且DNA沉淀塊大部分變?yōu)榘胪该鳡睢?）用適當(dāng)體積的TE（pH8.0）或10mmol/L的Tris-Cl溶液溶解DNA沉淀，

37℃-65℃水浴有助于DNA溶解。DNA一般不溶解在純水中，因?yàn)槿菀讛嗔?。?dāng)前第106頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（2）乙醇沉淀RNA在終濃度為0.8mol/L的LiCl

或0.3mol/L的NaAc

或5mol/L的NH4Ac存在的條件下，加入倍容積的無(wú)水乙醇可沉淀RNA，但加入RNA溶液中的鹽溶液和乙醇必須無(wú)RNase，操作時(shí)要防止RNase污染。當(dāng)前第107頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（四）核酸的定量1.比色法測(cè)定核酸濃度1）基本原理組成核酸的4種堿基均具有一定的吸收紫外線特性，由多種核苷酸組成的核酸的最大吸收波長(zhǎng)260nm，吸收低谷在230nm，該特性可用來(lái)測(cè)定核酸溶液濃度。在波長(zhǎng)260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml，

單鏈DNA或RNA為40μg/ml，

單鏈寡聚核苷酸為20-40μg/ml，可以此來(lái)計(jì)算核酸樣品的濃度。當(dāng)前第108頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可初步分析核酸的純度。測(cè)定260nm和280nm紫外線處吸收值的比值（A260/A280）純品DNA的A260/A280值為1.8，純品RNA的A260/A280值為2.0。若DNA比值高于1.8，說(shuō)明DNA中的RNA未除盡。酚和蛋白質(zhì)污染將導(dǎo)致比值降低，270nm處有高吸收表明有酚的干擾。既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值也可能為1.8。751分光光度計(jì)當(dāng)前第109頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2）操作步驟a.吸取一定體積DNA樣品或RNA樣品，

加水稀釋一定倍數(shù)（一般為20-1000倍），

轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。b.用水校正分光光度計(jì)的零點(diǎn)（空白）。c.在260nm和280nm處分別讀取并記錄光密度的OD值。d.計(jì)算核酸濃度并判斷質(zhì)量。

雙鏈DNA的濃度=OD260×50×核酸稀釋倍數(shù)；RNA或單鏈DNA的濃度=OD260×40×核酸稀釋倍數(shù)；機(jī)器合成的短鏈PCR引物的濃度=OD260×33×核酸稀釋倍數(shù)。（單位：μg/ml）當(dāng)前第110頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.凝膠電泳法測(cè)定核酸濃度1）基本原理DNA、RNA本身不產(chǎn)生熒光，熒光染料溴乙錠（EB）插入堿基平面后，核酸樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列不同濃度（已知）DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可粗略比較出被測(cè)DNA溶液的濃度。溴乙錠熒光法一般與核酸電泳分析相結(jié)合進(jìn)行。當(dāng)前第111頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2）操作步驟a.取一定量的DNA樣品（一般為1-5μl），加上1-2μl電泳上樣緩沖液（含溴酚藍(lán)），混勻后點(diǎn)樣至含0.5μg/ml溴乙錠的小型瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中。在樣品泳道的旁邊同時(shí)點(diǎn)上1至數(shù)個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品（一般為DNAMarker）。b.電泳：凝膠孔一端朝向陰（黑線電極），無(wú)孔一端朝向陽(yáng)極（紅線電極），在一定電壓下電泳一定時(shí)間，核酸由陰極度向陽(yáng)極遷移，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠的一半距離為止。c.將凝膠浸入含0.01mol/L的MgCl2的電泳緩沖液中5分鐘，進(jìn)行背景脫色。d.用短波紫外線（254nm）進(jìn)行拍照，比較樣品DNA與Marker的熒光強(qiáng)度，確定樣品中DNA濃度。同時(shí)根據(jù)帶型分析核酸的完整度和純度。當(dāng)前第112頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)比色法與電泳法的比較比色法的優(yōu)點(diǎn)可以對(duì)核酸的濃度和純度準(zhǔn)確進(jìn)行量化分析，測(cè)定時(shí)一般不需要同時(shí)提供標(biāo)準(zhǔn)核酸樣品作對(duì)照，樣品測(cè)定后回收較方便。比色法的缺點(diǎn)不能直觀觀察到核酸分子量的帶型分布特征、核酸的完整性（降解程度）及雜質(zhì)核酸的污染程度。當(dāng)前第113頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)電泳法的優(yōu)點(diǎn)直觀可見(jiàn)，可根據(jù)核酸的電泳帶型分析核酸分子的完整性，雜質(zhì)核酸的污染情況，

直觀比較各帶型核酸的濃度。電泳法的缺點(diǎn)亮度與含量的相關(guān)性，低濃度下正相關(guān)，高于一定濃度嚴(yán)重偏離正相關(guān)；溴乙錠嵌入堿基中的多少與DNA的超螺旋程度密切相關(guān)；亮度受其它影響熒光發(fā)光污染物的影響，因此該法的準(zhǔn)確度較差。對(duì)于較重要的核酸定量分析，一般采用比色法與是電泳法二者結(jié)合，同時(shí)進(jìn)行，綜合分析。當(dāng)前第114頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)（五）核酸的保存1.DNA的保存DNA與RNA樣品貯存條件各異，對(duì)于DNA來(lái)說(shuō)，最好是溶于TE中，

TE中的EDTA可螯合金屬2價(jià)離子，抑制DNA酶的活性。

TE的pH值為8，可減少DNA的脫氨反應(yīng)，并增加DNA的溶解度。短時(shí)間保存可放于4℃冷藏室，一般的長(zhǎng)期保存只需放于-20℃，-70℃下DNA能保存5年以上。當(dāng)前第115頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)2.RNA的保存RNA酶極不易失活，RNA極易污染RNA酶而被降解。RNA溶可溶于0.3mol/L的醋酸鈉（pH5.2）

或無(wú)RNase的雙蒸消毒水（最好是Millipore級(jí)別的水）中，貯放于-70℃以下的超低溫冰箱中。RNA的長(zhǎng)期保存，以沉淀形式貯存于乙醇中，在-20℃至-80℃的情況下，非常安全；或在RNA溶液中

加1滴

0.2mol/L的VRC（氧釩核糖核苷復(fù)合物）（抑制RNase），

-70℃，可保存數(shù)年。無(wú)論是DNA還是RNA，均宜于分成若干小份，

反復(fù)凍融易導(dǎo)致核酸的降解。當(dāng)前第116頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)二、電泳（一）凝膠電泳瓊脂糖或聚丙稀酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速，可直接用低濃度的溴化乙錠進(jìn)行染色，以確定DNA在凝膠中的位置。1～10ng的DNA就可以檢測(cè)出。瓊脂糖和聚丙稀酰胺凝膠可以制備成各種形狀、大小和孔隙度，并在各種裝置中進(jìn)行電泳。聚丙稀酰胺凝膠的分辨率可以達(dá)到1bp。一般在垂直裝置下使用。瓊脂糖凝膠電泳的分辨率不如聚丙稀酰胺凝膠，但其分離范圍較廣。一般在水平裝置下使用。當(dāng)前第117頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線性高聚物，其基本結(jié)構(gòu)為：將瓊脂糖根據(jù)所需濃度，按比例加入到所用緩沖液中熔化成清澈、透明的液體，到入膠模中，冷卻凝固后，放入電場(chǎng)中。在中性pH中，核酸將從負(fù)極向正極遷移。當(dāng)前第118頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)瓊脂糖凝膠的制備及電泳（11步）1）根據(jù)所需濃度稱(chēng)取一定量的瓊脂糖，加入所需體積的1×TAE或TBE電泳緩沖液。2）微波爐加熱使瓊脂糖溶解。3）溶液冷至60℃時(shí)，加入溴乙錠至終濃度為0.5μg/ml。（戴手套操作）4)用醫(yī)用膠布封好制膠模具，有的模具勿需人工封閉。當(dāng)前第119頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)5)將瓊脂糖倒入模具，并在一端安插上梳子，并消除氣泡。6）室溫下20-45分鐘至完全凝固，低熔點(diǎn)凝膠應(yīng)于4℃凝固，小心取出梳子和橡皮膏，將載有凝膠的載膠板放于電泳槽中。7）加入電泳緩沖液（與化膠時(shí)一致），讓液面高于膠面1mm。8）在DNA樣品中加入1/6體積的上樣緩沖液，混勻。當(dāng)前第120頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)9）用移液槍將DNA樣品小心加入樣品孔中。10）接通電泳槽與電泳儀的電源，一般正極為紅色，切記DNA樣品往正極泳動(dòng)。電壓降選擇為1-5V/cm。11）根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳，切斷電源后，再取出凝膠。含EB的凝膠直接于紫外線燈下觀察結(jié)果或拍照記錄。當(dāng)前第121頁(yè)\共有144頁(yè)\編于星期三\8點(diǎn)瓊脂糖