


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
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文檔簡介
細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)質(zhì)譜分析詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)(優(yōu)選)細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)質(zhì)譜分析當(dāng)前第2頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)氣體分子或固體、液體的蒸氣受到一定能量的電子流轟擊或強(qiáng)電場作用,丟失價(jià)電子生成分子離子;同時(shí),化學(xué)鍵也發(fā)生某些有規(guī)律裂解,生成各種碎片離子。這些帶正電荷的離子在電場和磁場的作用下,按質(zhì)荷比(即質(zhì)量與電荷比值m/z)的大小分開,排列成譜,記錄下來即為質(zhì)譜(MassSpectroscopy)。概述——基本概念當(dāng)前第3頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第4頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)概述——特點(diǎn)質(zhì)譜是定性鑒定與研究分子結(jié)構(gòu)的有效方法。
靈敏度高:絕對靈敏度可達(dá)5pg(pg為10-12g)
樣品用量少:微克級
分析速度快:掃描1-1000u僅需1/1000秒
測定對象廣:氣體、液體、室溫下具有10-7Pa蒸汽
壓的固體當(dāng)前第5頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)概述——用途
求準(zhǔn)確的分子量化學(xué)式的確定推測未知物的結(jié)構(gòu)
鑒定同分異構(gòu)體測定分子中Cl、Br等的原子數(shù)……當(dāng)前第6頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)概述——質(zhì)譜的發(fā)展史1912年世界上第一臺現(xiàn)代意義質(zhì)譜儀在英國劍橋Cavendish實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)1918年世界上第一臺實(shí)際意義質(zhì)譜儀在美國芝加哥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)(扇型磁場MS)1943年世界上第一臺商業(yè)質(zhì)譜儀1953年四極桿質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀1955年飛行時(shí)間質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀60’s開發(fā)GC/MS60’s-70’s大氣壓電離(APcI)源被發(fā)現(xiàn)(但并未被廣泛應(yīng)用)70’s-80’s開始廣泛研究LC/MS1982年離子束LC/MS接口出現(xiàn)1984年第一臺電噴霧MS儀宣告誕生1988年電噴霧離子源MS首次應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析......當(dāng)前第7頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)
JosephJ.Thomson1906年諾貝爾物理獎(jiǎng)電荷在氣體中的運(yùn)動(dòng)FrancisWilliamAston1922年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)同位素
WolfgangPaul1989年諾貝爾物理獎(jiǎng)離子阱技術(shù)質(zhì)譜的發(fā)展史HansG.Dehmelt1989年諾貝爾物理獎(jiǎng)離子阱技術(shù)年KoichiTanaka2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)基質(zhì)輔助激光解吸電離方法JohnBennetFenn2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)電噴霧離子化當(dāng)前第8頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)MALDI-TOF-TOFMS
MALDI-TOFMSnanoESIQ-TOFMS4000QTRAPMS串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀納升液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀當(dāng)前第9頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)分子離子MolecularIon
試樣分子失去或得到一個(gè)電子而形成的離子。它在正離子場合下表示為M?+。它的質(zhì)荷比即表明試樣分子所對應(yīng)的分子量數(shù)值。母離子
ParentIon產(chǎn)生某一碎片的前體離子,母離子不一定是分子離子。子離子
DaughterIon由母子離子裂解后形成的離子。常見術(shù)語:當(dāng)前第10頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)常見術(shù)語:質(zhì)荷比:
離子質(zhì)量(以相對原子量單位計(jì))與它所帶電荷(以電子電量為單位計(jì))的比值,寫作m/Z.峰:
質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:
檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度.當(dāng)前第11頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)質(zhì)譜儀的工作原理即:
由分子結(jié)構(gòu)與裂解方式的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律,根據(jù)分子離子和各種碎片離子的質(zhì)荷比及其相對豐度,就可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。有機(jī)分子電子轟擊質(zhì)譜裂解碎片離子分子離子(-e)(M)(M)+分離、收集、記錄當(dāng)前第12頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)分子離子化,它通過在離子源中進(jìn)行電子電離、快速原子/離子轟擊、基體輔助激光解吸或電噴霧來實(shí)現(xiàn);帶電分子的離子及其碎片必須根據(jù)其質(zhì)荷比來得到分離,這往往在質(zhì)量分析器中進(jìn)行;最后,分離的帶電荷的碎片必須通過檢測器檢測。真空系統(tǒng)當(dāng)前第13頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)直接進(jìn)樣法(靜態(tài)法):對純的化合物來說,一般為氣體或揮發(fā)性液體,可直接進(jìn)樣到離子源室,而不需要專用設(shè)備或器件,這類似于氣相色譜中的樣品進(jìn)樣。直接插入探針法:對于揮發(fā)性很小的固體樣品,需將樣品放在不銹鋼桿或探針頂端的小杯內(nèi),將探針通過樣品加入口放進(jìn)離子源中,然后加熱離子源直至固體揮發(fā)。動(dòng)態(tài)平衡法(色譜進(jìn)樣):對一些組分較復(fù)雜的混合物時(shí),需將樣品分離成一個(gè)個(gè)單一組分,再進(jìn)入質(zhì)譜儀。最典型的就是氣相或液相色譜通過接口與質(zhì)譜連接。進(jìn)樣系統(tǒng)當(dāng)前第14頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)在離子源中樣品被電離成離子,不同性質(zhì)的樣品可能需要不同的電離方式。電子轟擊電離(electronimpact,EI)電子轟擊電離使用具有一定能量的電子直接作用于樣品分子,使其電離。用鎢或錸制作的燈絲在高真空中發(fā)射出電子。燈絲與電離盒之間的電壓稱為電離電壓。對有機(jī)化合物通常選用70eV的電壓。離子源當(dāng)前第15頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)化學(xué)電離(Chemicalionization,CI)化學(xué)電離:是將樣品氣體和反應(yīng)氣體分子混合(其中樣品含量約0.1%),進(jìn)入電離室后,首先用電子轟擊方式使反應(yīng)氣體電離,然后反應(yīng)氣體與樣品氣體進(jìn)行離子-分子反應(yīng)而使樣品氣體電離,因此樣品的離子是由離子-分子反應(yīng)產(chǎn)生的。這樣產(chǎn)生的離子能量較小,故碎片較少。對于不穩(wěn)定的有機(jī)化合物,可得到較強(qiáng)的分子離子峰。當(dāng)前第16頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)大氣壓化學(xué)電離(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)在大氣壓下,化學(xué)電離反應(yīng)的速率更大,電離效率應(yīng)更高。主要困難是將大氣壓力下產(chǎn)生的離子轉(zhuǎn)移到處于高真空(<10-6Torr)狀態(tài)的質(zhì)量分析器中?,F(xiàn)在常用的是電暈放電大氣壓電離。當(dāng)前第17頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)快原子轟擊(Fastatombombardment,FAB)用加速的中性原子(快原子)撞擊以甘油(底物)調(diào)和后涂在金屬表面的有機(jī)化合物(“靶面”),導(dǎo)致這些有機(jī)化合物電離的方法稱之為快原子轟擊(FAB)。由于快原子轟擊是一種軟電離技術(shù),被分析樣品不須經(jīng)過氣化而直接電離,所以,快原子轟擊質(zhì)譜法常用于分析極性強(qiáng)、不易氣化和熱穩(wěn)定性差的樣品。當(dāng)前第18頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)電噴霧電離(Electrosprayionization,ESI)原理:不銹鋼毛細(xì)管被加以3-5kV的正電壓,與相距約1cm接地的反電極形成強(qiáng)靜電場。被分析的樣品溶液從毛細(xì)管流出時(shí)在電場作用下形成高度荷電的霧狀小液滴;在向質(zhì)量分析器移動(dòng)的過程中,液滴因溶劑的揮發(fā)逐漸縮小,其表面上的電荷密度不斷增大。當(dāng)電荷之間的排斥力足以克服表面張力時(shí),液滴發(fā)生裂分;經(jīng)過這樣反復(fù)的溶劑揮發(fā)-液滴裂分過程,最后產(chǎn)生單個(gè)多電荷離子。電噴霧通常要選擇合適的溶劑。除了考慮對樣品的溶解能力外,溶劑的極性也需考慮。一般來說,極性溶劑(如甲醇、乙腈、丙酮等)更適合于電噴霧。當(dāng)前第19頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)電噴霧(ESI)離子化過程電噴霧離子化可分為三個(gè)過程:1、形成帶電小液滴2、溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂3、最終形成氣相離子當(dāng)前第20頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器的作用是將離子源中形成的離子按質(zhì)荷比的大小不同分開,質(zhì)量分析器可分為靜態(tài)分析器和動(dòng)態(tài)分析器兩類。靜態(tài)分析器采用穩(wěn)定不變的電磁場(電磁場隨時(shí)間改變,只是為了記錄質(zhì)譜而不是分離原理所要求的),并且按照空間位置把不同質(zhì)量(m/e)的離子分開。屬于這一類的儀器有單聚焦磁場分析器和雙聚焦磁場分析器。動(dòng)態(tài)分析器采用變化的電磁場,按照時(shí)間或空間來區(qū)分質(zhì)量不同的離子。屬于這一類的儀器有飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、四極濾質(zhì)器等。當(dāng)前第21頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)四極桿質(zhì)量分析器由四根精密加工的電極桿以及分別施加于x、y方向兩組高壓高頻射頻組成的電場分析器。高壓高頻信號提供了離子在分析器中運(yùn)動(dòng)的輔助能量,只有符合一定數(shù)學(xué)條件的離子才能夠不被無限制的加速,從而安全的通過四極桿分析器。當(dāng)前第22頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)離子阱離子阱質(zhì)譜與四極桿質(zhì)譜同樣利用了離子在射頻電場的運(yùn)動(dòng)特性。用高頻交流電把離子限制在離子阱里,然后用離子的特征電壓分別將其推出離子阱,到檢測器檢測。離子阱質(zhì)量分析器具有結(jié)構(gòu)簡單和對真空度要求低等特點(diǎn),因而成為制造小型質(zhì)譜儀的首選.當(dāng)前第23頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)飛行時(shí)間質(zhì)譜這種質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器是一個(gè)離子漂移管,由離子源產(chǎn)生的離子加速后進(jìn)入無場漂移管,并以恒定速度飛向離子接收器。離子質(zhì)量越大,到達(dá)接收器所用時(shí)間越長,離子質(zhì)量越小,到達(dá)接收器所用時(shí)間越短,根據(jù)這一原理,可以把不同質(zhì)量的離子按m/z值大小進(jìn)行分離。當(dāng)前第24頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第25頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀器中凡有樣品分子和離子的地方必須抽成真空狀態(tài),即質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器及檢測系統(tǒng)都必須處于真空狀態(tài)下工作(一般為1.333×10-4~1.333×10-6Pa
)。質(zhì)譜儀的真空系統(tǒng)要求殘余氣體中不能留有對測定不利的氣體成分,否則:空氣中的氧會(huì)燒壞離子源的燈絲;會(huì)引起額外的離子-分子反應(yīng),使質(zhì)譜復(fù)雜化;且干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié),影響儀器的分辨率;真空度低會(huì)使本底增高,干擾質(zhì)譜圖。當(dāng)前第26頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)質(zhì)譜儀種類有機(jī)質(zhì)譜儀:
①
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)在這類儀器中,由于質(zhì)譜儀工作原理不同,又有氣相色譜-四極質(zhì)譜儀,氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,氣相色譜-離子阱質(zhì)譜儀等。
②液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)。同樣,有液相色譜-四極質(zhì)譜儀,液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀,液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,以及各種各樣的液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。
③
其他有機(jī)質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS);傅立葉變換質(zhì)譜儀(FT-MS)。當(dāng)前第27頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)質(zhì)譜儀種類無機(jī)質(zhì)譜儀包括:①火花源雙聚焦質(zhì)譜儀。②感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)。③二次離子質(zhì)譜儀(SIMS)。同位素質(zhì)譜儀氣體分析質(zhì)譜儀主要有呼氣質(zhì)譜儀,氦質(zhì)譜檢漏儀等。除上述分類外,還可以根據(jù)質(zhì)譜儀所用質(zhì)量分析器的不同,把質(zhì)譜儀分為雙聚焦質(zhì)譜儀、四極桿質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀、傅立葉變換質(zhì)譜儀等。當(dāng)前第28頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)質(zhì)譜:純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析色譜:化合物分離色譜-質(zhì)譜聯(lián)用:共同優(yōu)點(diǎn)GC-MS;LC-MS;CZE-MS困難點(diǎn):載氣(或流動(dòng)液)的分離;出峰時(shí)間監(jiān)測;儀器小型化;關(guān)鍵點(diǎn):接口技術(shù)(分子分離器)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用當(dāng)前第29頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用當(dāng)前第30頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)要使氣相色譜和質(zhì)譜儀器聯(lián)用,首先要解決的問題是氣壓問題。色譜柱出口壓通常是常壓,而質(zhì)譜儀在正常工作壓力是高真空,故二者無法相接。必須采用一個(gè)連接器,用來除去載氣,以降低氣相色譜流出物的氣壓并富集試樣,以達(dá)到質(zhì)譜儀的工作要求。如果色譜儀使用填充柱,必須經(jīng)過一種接口裝置——分子分離器,將色譜載氣去除,使樣品氣進(jìn)入質(zhì)譜儀;如果色譜儀使用毛細(xì)管柱,則可以將毛細(xì)管直接插入質(zhì)譜儀離子源,因?yàn)槊?xì)管載氣流量比填充柱小很多,不會(huì)破壞質(zhì)譜儀真空。當(dāng)前第31頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)在GC/MS分析中,常用的離子源有電子轟擊離子源(EI),化學(xué)電離源(CI),EI/±CI復(fù)合源,場致電離源(FI),大氣壓化學(xué)電離源(APCI)等。當(dāng)前第32頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)儀器結(jié)構(gòu)色譜-四極桿質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖當(dāng)前第33頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)LC-MS液質(zhì)聯(lián)用大多數(shù)高效液相色譜的組分是非揮發(fā)性的或熱分解性的,這使得由液相轉(zhuǎn)化為氣相的任務(wù)更具有挑戰(zhàn)性,尤其是要保證組分的完整性。最常用的三種連接方式是熱噴霧(TSP)法、電噴霧(ESI)法和大氣壓電離(APCI)法。當(dāng)前第34頁\共有37頁\編于星期四\7點(diǎn)
液質(zhì)聯(lián)用流程圖當(dāng)前第35頁\共
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