細菌病毒培養(yǎng)技術(shù)詳解演示文稿

細菌病毒培養(yǎng)技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有47頁\編于星期四\7點（優(yōu)選）細菌病毒培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有47頁\編于星期四\7點當(dāng)前第3頁\共有47頁\編于星期四\7點（二）細菌生長繁殖的方式二分裂法繁殖方式：鏈球菌八疊球菌葡萄球菌當(dāng)前第4頁\共有47頁\編于星期四\7點（三）細菌生長繁殖的速度當(dāng)前第5頁\共有47頁\編于星期四\7點（四）細菌生長繁殖的速度分為四期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期當(dāng)前第6頁\共有47頁\編于星期四\7點（五）常用培養(yǎng)基種類厭氧培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基當(dāng)前第7頁\共有47頁\編于星期四\7點細菌培養(yǎng)技術(shù)

1細菌的培養(yǎng)基本知識2細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)3細菌的計數(shù)技術(shù)當(dāng)前第8頁\共有47頁\編于星期四\7點二、細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)種子接種

是指菌體增殖培養(yǎng)物。收獲時間

最佳培養(yǎng)時間依據(jù)細菌的生長曲線而定。對數(shù)生長期當(dāng)前第9頁\共有47頁\編于星期四\7點培養(yǎng)方法1．固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法

用于制備抗原、滅活苗、凍干苗。2．液體靜置培養(yǎng)法

需氧菌（深度1/2）和兼性厭氧均可用，厭氧菌（深度3/4），還需加肝塊。3．深層通氣培養(yǎng)法

是目前菌苗生產(chǎn)的主要培養(yǎng)法。安裝有自動控溫、消泡、調(diào)pH、自動控制通氣量、自動磁力攪拌等裝置。細菌接種1～2h，再通入濾過除菌空氣，并適當(dāng)攪拌分散通入的氣體，以增加培養(yǎng)液中的溶氧量。及時補充營養(yǎng)。當(dāng)前第10頁\共有47頁\編于星期四\7點4．透析培養(yǎng)法在細菌培養(yǎng)液與培養(yǎng)基之間隔有一層透析膜，使培養(yǎng)基中高濃度小分子量的營養(yǎng)成分通過透析膜（不能透過大分子的細菌或毒素）不斷擴散到細菌培養(yǎng)液中，供細菌生長繁殖，獲得高濃度的細菌或毒素。透析器1.螺栓2.培養(yǎng)基貯存室3.視鏡4.透析膜5.培養(yǎng)室當(dāng)前第11頁\共有47頁\編于星期四\7點5、連續(xù)培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)是一個恒定體積的流動系統(tǒng)，新鮮培養(yǎng)基以恒定的速度流入，又以相同的速率流出除去多余的液體，細菌始終保持在對數(shù)生長期。當(dāng)前第12頁\共有47頁\編于星期四\7點細菌培養(yǎng)技術(shù)

1細菌的培養(yǎng)基本知識2細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)3細菌的計數(shù)技術(shù)當(dāng)前第13頁\共有47頁\編于星期四\7點三細菌的計數(shù)技術(shù)細菌性疫苗在制造中，往往需要計算每毫升所含細菌的總數(shù)。

1.顯微鏡直接計數(shù)法2.活菌計數(shù)法傾注平板培養(yǎng)法將被測樣品根據(jù)菌數(shù)含量多少，用普通肉湯或生理鹽水作10倍遞進稀釋。分別取其1ml加在滅菌的平皿中，然后取預(yù)先加熱融化且冷至45～50℃，立即搖勻放平，凝固后培養(yǎng)，統(tǒng)計平皿上長出的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為每毫升樣品中含有的活菌數(shù)。當(dāng)前第14頁\共有47頁\編于星期四\7點平板表面散布法

接種量為0.1ml瓊脂板的制備稀釋菌液接種培養(yǎng)計數(shù)選擇菌落數(shù)在30～300之間的平皿用以計數(shù)，每個稀釋度應(yīng)取其菌落平均數(shù)。

活菌數(shù)／ml=2個平板平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。舉例：在10稀釋的平板中所得平均菌落數(shù)為78個。計算結(jié)果：78×10×10

=7.8×10個活菌／ml微量點板計數(shù)法

接種量為0.02ml10-8-8當(dāng)前第15頁\共有47頁\編于星期四\7點

3比濁計數(shù)法

是對比細菌懸液與標(biāo)準(zhǔn)管的濁度，求出大致的菌數(shù)。原理：菌液中含數(shù)多少與其渾濁度成正比。方法：比濁管比濁法和分光光度計法。優(yōu)點：快速簡便應(yīng)用：常用于菌苗及其他生物制劑的生產(chǎn)、細菌毒力的測定和攻毒量的確定等。當(dāng)前第16頁\共有47頁\編于星期四\7點標(biāo)準(zhǔn)比濁法比濁管由國家生物制品檢定部門提供，每套包括一支細菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管、數(shù)支對照空管和一張比濁用的圖片。比濁方法將空管拭刷干凈，加入待測菌液1ml。將標(biāo)準(zhǔn)管與待測管并列緊貼在圖片前，使兩管受光均勻，然后透過兩管管壁對比觀察，目測圖片的清晰度，并將兩管左右換位，反復(fù)對比。例如：測定大腸桿菌的菌數(shù)，若1ml菌液加入4ml的生理鹽水后，與標(biāo)準(zhǔn)管的濁度相同，即表示該菌液經(jīng)5倍稀釋后相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)管的菌數(shù)相當(dāng)于8億個／ml，故被測菌數(shù)為8×5=40億個／ml。當(dāng)前第17頁\共有47頁\編于星期四\7點分光光度計法借助于分光光度計。在一定波長下測定菌液的光密度值注意：測量時一定要控制菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。當(dāng)前第18頁\共有47頁\編于星期四\7點病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第19頁\共有47頁\編于星期四\7點

病毒復(fù)制：以病毒基因為模板，在酶的作用下，分別合成基因和蛋白質(zhì)，再組裝成完整的蛋白顆粒，這種方式稱為復(fù)制（replication)。當(dāng)前第20頁\共有47頁\編于星期四\7點吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成當(dāng)前第21頁\共有47頁\編于星期四\7點病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第22頁\共有47頁\編于星期四\7點1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇應(yīng)當(dāng)選擇SPF動物。選擇動物的條件下：①選用對病毒易感性高。②動物健康、體重、年齡盡可能一致，符合培養(yǎng)病毒要求。③遺傳特性相似，實驗結(jié)果具有一致性、準(zhǔn)確性和可比性。④外購動物要了解當(dāng)?shù)貏游锶航】?，飼養(yǎng)及免疫接種情況，接前要經(jīng)過健康觀察，以免誤用帶有病原體動物。當(dāng)前第23頁\共有47頁\編于星期四\7點1.皮內(nèi)接種2.皮下接種3.肌肉接種4.靜脈接種5.腹腔接種動物接種途徑和方法當(dāng)前第24頁\共有47頁\編于星期四\7點動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒

1.接種病毒后的動物,每天觀察和檢查規(guī)定的各項指標(biāo)，主要有精神、食欲、糞便、尿液、被毛狀態(tài)、活動情況和接種部位的局部反應(yīng)，每天測體溫1次，做好記錄。2.出現(xiàn)反應(yīng)癥候動物，按規(guī)定方法剖殺，采取含病毒高的組織臟器。當(dāng)前第25頁\共有47頁\編于星期四\7點病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第26頁\共有47頁\編于星期四\7點2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)工序過程：如何完成此項任務(wù)？選擇禽胚前孵育接種后孵育收獲病毒當(dāng)前第27頁\共有47頁\編于星期四\7點操作要點1禽胚的選擇理想的禽胚是SPF雞胚，常以非免疫雞胚補充。2禽胚的接種前孵育孵化前消毒，溫度37.5～38.5℃，相對濕度50%～60%，定時翻蛋，保證通風(fēng)。孵化4～5d照蛋檢查，淘汰無精蛋和死胚，孵化至所培養(yǎng)病毒需要的日齡即可接種。

當(dāng)前第28頁\共有47頁\編于星期四\7點3禽胚的接種途徑痘病毒和皰疹病毒，10～13日齡

流感、新城疫、傳支等，9～11日齡鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等，6～8日齡正粘病毒和副粘病毒，10～11日齡當(dāng)前第29頁\共有47頁\編于星期四\7點4禽胚的接種后孵育

接種后，蠟淚封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通過禽胚的病變初步確定病毒的存在及增殖情況，淘汰24h內(nèi)死胚。操作要點病毒感染指征：死亡充血、出血或出現(xiàn)壞死灶畸形出現(xiàn)痘斑當(dāng)前第30頁\共有47頁\編于星期四\7點5病毒的收獲

操作要點絨毛尿囊膜接種尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種當(dāng)前第31頁\共有47頁\編于星期四\7點照蛋任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第32頁\共有47頁\編于星期四\7點尿囊腔接種法當(dāng)前第33頁\共有47頁\編于星期四\7點接種部位消毒任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第34頁\共有47頁\編于星期四\7點尿囊腔接種任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第35頁\共有47頁\編于星期四\7點當(dāng)前第36頁\共有47頁\編于星期四\7點收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第37頁\共有47頁\編于星期四\7點當(dāng)前第38頁\共有47頁\編于星期四\7點病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第39頁\共有47頁\編于星期四\7點細胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)

細胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。即：利用機械、酶或化學(xué)方法使活體動物組織或傳代細胞分散成單個乃至2～4個細胞團懸液的培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。廣義上:還包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。當(dāng)前第40頁\共有47頁\編于星期四\7點3病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

當(dāng)前第41頁\共有47頁\編于星期四\7點培養(yǎng)常用的細胞上皮細胞、成纖維細胞根據(jù)培養(yǎng)細胞的染色體和繁殖特性，可分為：⑴原代細胞直接利用新鮮動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化、分散，獲得單個細胞，如雞胚成纖維細胞，此細胞對病毒的檢測最為敏感，但制備和應(yīng)用不方便。

⑵二倍體細胞（細胞株）由原代細胞或次代細胞選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細胞，如豬腎細胞株（PK-15）和乳倉鼠腎細胞株（BHK-21）等。適用于病毒性生物制品的制備，常用于疫苗生產(chǎn)，安全可靠。

⑶傳代細胞（非二倍體細胞系、異倍體細胞）指不再保持原來細胞的二倍體細胞數(shù)，在體外可以無限傳代的細胞，如人子宮癌細胞（HeLa細胞）和鼠腎腺癌細胞（RAG細胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生產(chǎn)，多用于病毒的分離鑒定。

當(dāng)前第42頁\共有47頁\編于星期四\7點1.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等營養(yǎng)液

。2.細胞接種量:適宜。3.pH：一般為7.0～7.4因細胞種類不同而略有差異。4.溫度：一般為37～38℃。5.氣體：氧氣和二氧化碳。6.無菌條件：培養(yǎng)的全過程都要求嚴(yán)格的無菌條件。細胞培養(yǎng)的基本條件當(dāng)前第43頁\共有47頁\編于星期四\7點各種組織是靠細胞間質(zhì)黏合而成的，要獲得分散的細胞，必須破壞細胞間質(zhì)。分散細胞的方法的三種：機械分散法：適用于細胞間連接較松的組織，如禽胚組織。

酶消化法：此法適用于原代細胞的制備及細胞的傳代培養(yǎng)。螯合劑分散法：一般只用于單層細胞的分散。

分散細胞的方法當(dāng)前第44頁\共有47頁\編于星期四\7點

1.單層細胞培養(yǎng)法

用胰酶將剪碎的組織或傳代細胞分散成2～6個成團的細胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，讓細胞貼壁生長，靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶生長培養(yǎng)。

2.懸浮細胞培養(yǎng)法（攪拌培養(yǎng)）

通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。3.微載體培養(yǎng)通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液