熒光顯微鏡的基本原理及應(yīng)用演示文稿

熒光顯微鏡的基本原理及應(yīng)用演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)熒光顯微鏡的基本原理及應(yīng)用當(dāng)前第2頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第3頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)一、熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)

原理：

某些物質(zhì)經(jīng)一定波長(zhǎng)的光（如紫外光）照射后，物質(zhì)中的分子被激活，吸收能量后躍遷至激發(fā)態(tài)；當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，所吸收的能量除部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，其余較大部分則以光能形式輻射出來(lái)，由于能量沒(méi)能全以光的形式輻射出來(lái)，故所輻射出的光的波長(zhǎng)比激發(fā)光的要長(zhǎng)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光部就是熒光(fluorescence)。所謂熒光就是某些物質(zhì)在一定波長(zhǎng)光（如紫外光）的照射下、在極短時(shí)間內(nèi)所發(fā)出的比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)光。當(dāng)前第4頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第5頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第6頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)二、熒光顯微鏡的組成1、光源：一般采用高壓汞燈2、濾色系統(tǒng)：由激發(fā)濾板和壓制濾板組成a、激發(fā)濾板：提供一定范圍的激發(fā)光b、壓制濾板：完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，提供相應(yīng)濾長(zhǎng)范圍熒光3、反光鏡：一般采用平面反光鏡4、聚光鏡：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物鏡和目鏡當(dāng)前第7頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)Theopticalsystemofafluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroicmirror(beam-splitting2)當(dāng)前第8頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第9頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)三、熒光顯微鏡的操作

(1)安裝紫外防護(hù)罩。

(2)打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。

(3)插入擋光板，中斷光路。

(4)預(yù)熱5—10分鐘。

(5)將載有樣品的載玻片放到載物臺(tái)上。

(6)選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。當(dāng)前第10頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)

(7)旋轉(zhuǎn)分光鏡組件轉(zhuǎn)盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時(shí)用；“WU”為觀察藍(lán)色熒光時(shí)用(如DAPl)；“WB”為觀察綠色熒光時(shí)用(如FITC)；“WG"為觀察紅色熒光時(shí)用(如TRITC)。

(8)使用阻斷濾片(目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡)。

(9)通過(guò)粗、細(xì)螺旋調(diào)整焦距。

(10)打開與顯微鏡連接的計(jì)算機(jī)，點(diǎn)擊數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件，采集數(shù)碼圖像。當(dāng)前第11頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)四、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。當(dāng)前第12頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)（三）標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。當(dāng)前第13頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)五、熒光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。2、溴化乙錠（EB）:染色DNA和RNA。3、熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD本身無(wú)熒光,無(wú)極性,可透過(guò)完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。4、熒光染料Ho33342和羅丹明123:Ho33342能與細(xì)胞中DNA進(jìn)行特異的結(jié)合，羅丹明123能與線粒體進(jìn)行特異的結(jié)合。當(dāng)前第14頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)六、熒光組化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題1、每種熒光染料，均有自己的最適pH值，此時(shí)熒光最強(qiáng)。當(dāng)pH改變時(shí)，不僅熒光強(qiáng)度減弱，而且波長(zhǎng)將有所改變，因此熒光檢測(cè)時(shí)要在一定的pH值的緩沖液中進(jìn)行。2、一放熒光染色在20。C以下時(shí)熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。3、在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強(qiáng)而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長(zhǎng)波長(zhǎng)光進(jìn)行觀察，需照相時(shí)再適當(dāng)增強(qiáng)激發(fā)光。4、一般熒光染液的濃度在萬(wàn)分之一以下，甚至億萬(wàn)分之一，也能使標(biāo)本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強(qiáng)度可隨熒光素的濃度增加而增強(qiáng)，但超過(guò)限度，熒光強(qiáng)度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。當(dāng)前第15頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)七、熒光顯微鏡應(yīng)用技術(shù)1.對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性位、半定量研究免疫熒光技術(shù)

用熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣品(細(xì)胞、組織或分離的物質(zhì)等)中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合，以適當(dāng)檢測(cè)熒光的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測(cè)相應(yīng)特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(shù)(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標(biāo)記的第二、第三抗體等檢測(cè)相應(yīng)抗原抗體復(fù)合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(shù)(indirectimmunofluorescenttechnique)”。當(dāng)前第16頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位當(dāng)前第17頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)1.分子標(biāo)記

利用綠色熒光的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察當(dāng)前第18頁(yè)\共有19頁(yè)\編于星期四\10點(diǎn)2.藥