核酸提取原理及方法

核酸提取原理及方法1前言

核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此，核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作。主要內容核酸簡介基因組DNA提取質粒DNA提取真核細胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳核酸簡介核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3′，5′-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩類。DNA主要儲存遺傳信息。RNA主要傳遞遺傳信息。核酸簡介

如何分離RNA？如何分離DNA？核酸簡介——質粒DNA

質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。

質粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌等細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。核酸簡介基因組DNA提取質粒DNA提取真核細胞總RNA提取基因組DNA提取方法基因組DNA提取的幾種常用方法：CTAB法SDS法其他方法基因組DNA提取——CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來?；蚪MDNA提取——CTAB法

CTAB提取緩沖液的經典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM0.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。基因組DNA提取——CTAB法

CTAB提取緩沖液的改進配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM0.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。CTAB法實驗流程基因組DNA提取——CTAB法植物材料抽提核酸沉淀液氮研磨上層溶液細胞裂解DNA溶液干燥溶解離心洗滌SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。基因組DNA提取——SDS法注：SDS法適用于大部分實驗材料基因組DNA提取。如動物組織、細胞、全血、細菌、酵母等。

SDS提取緩沖液的配方基因組DNA提取——SDS法組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）

NaClSDS終濃度50mM20mM0.4M2%Tris-HCl（pH8.0）：提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA：螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl：提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中?；蚪MDNA提取——SDS法SDS法實驗流程（以動物組織為例）動物組織抽提酒精沉淀液氮研磨或勻漿上層溶液細胞裂解DNA溶液干燥溶解離心洗滌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測小鼠gDNA電泳圖瓊脂糖凝膠電泳：以瓊脂糖凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。基因組DNA提取常見問題DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應DNA降解DNA量少基因組DNA提取常見問題分析DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應DNA中含有蛋白、多糖、多酚類物質

——抽提純化、高鹽洗滌DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應

——重新沉淀DNA中殘留有金屬離子

——重新70%乙醇漂洗基因組DNA提取常見問題分析DNA降解材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染DNA提取量少實驗材料不佳或量少

——

選取新鮮（幼嫩）材料破壁或裂解不充分

——充分研磨、破壁酶、延長裂解時間沉淀不完全

——低溫、延長沉淀時間洗滌使得丟失DNA基因組DNA提取常見問題分析核酸簡介基因組DNA提取質粒DNA提取真核細胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳質粒DNA提取質粒DNA提取的方法：堿裂解法煮沸法質粒DNA提取——堿裂解法原理離心柱型質粒DNA提取試劑盒工作原理離心柱型質粒DNA提取試劑盒采用改進的SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后用低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。質粒DNA提取及檢測——實驗準備1.實驗器材

臺式高速離心機、旋渦混合儀、移液器、定時器、marker筆、電子天平、電泳設備、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。2.實驗耗材無菌2mL/1.5mLEP管、各規(guī)格Tip、一次性手套等。3.實驗試劑

質粒小提試劑盒（離心柱型，YRBIO)

、LB培養(yǎng)基、抗生素、瓊脂糖、DNALoadingBuffer、GoldView核酸染料、

TAE電泳緩沖液等。4.實驗材料

對數(shù)期菌株（pEGFP-N1inDH5α）質粒DNA提取——堿裂解法堿裂解法試劑配方

組分1組分2Ⅰ液25mMTris-HCl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）Ⅱ

液0.2MNaOH1%SDSⅢ

液3MKAc（pH4.2）RNaseA10μg/mlRNaseA洗脫液

EB10mMTris-HCl（pH8.0）1mMEDTA（pH8.0）質粒DNA提取——實驗流程對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液過柱干燥溶解離心洗滌質粒DNA溶液離心詳細實驗步驟請參考說明書！質粒DNA提取——電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA的三種帶型：1.共價閉合環(huán)狀DNA分子：質粒雙鏈沒有斷裂；超螺旋結構；泳動速度最快；2.半開環(huán)質粒DNA分子：質粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；泳動速度最慢；3.線性DNA分子：質粒的兩條鏈均斷裂；泳動速度居中。質粒DNA提取常見問題

RNA殘留

質粒斷裂量少質粒DNA提取常見問題分析RNA殘留

忘記加RNaseA？I液中RNaseA失效？酶量不夠？質粒DNA提取常見問題分析質粒斷裂II液裂解時間過長？裂解時動作過于劇烈？質粒DNA提取常見問題分析量少凝膠是否有問題？菌體量少菌體重懸不徹底裂解不完全菌株老化嚴謹型質粒質粒類型嚴謹型：這些質粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下進行的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下進行的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成才會使質?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質粒pBR322即屬于松弛型質粒，要經過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。核酸簡介基因組DNA提取質粒DNA提取真核細胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳總RNA提取——通用方法異硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）原理：核酸在中性條件下，因磷酸基解離而帶負電荷，這一部分由于水化而溶于水。而在酸性條件下，磷酸基的負電荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的處理下，DNA向疏水性的酚層移動，而RNA由于有-OH的存在有親水性，因此向水層移動。TRIzol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA便分離開。水相層主要為RNA，有機層主要為DNA和蛋白質?？俁NA提取及檢測——實驗準備1.實驗器材

臺式高速冷凍離心機、移液器、定時器、marker筆、酒精噴壺、電子天平、電泳設備、凝膠成像系統(tǒng)（或紫外透射儀）、紫外分光光度計、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。2.實驗耗材

1.5mLEP管（RNasefree）、各規(guī)格Tip（RNasefree）、一次性手套、一次性口罩等。3.實驗試劑

TRIzol總RNA提取試劑（YRBIO)、氯仿、異丙醇、75%乙醇（RNasefree）、DEPCH2O（RNasefree）等。4.實驗材料

新鮮293細胞RNase是導致RNA降解的最主要物質！RNase的來源樣品試劑多次使用的器具裸露的手說話產生的唾沫空氣RNase非常穩(wěn)定，它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。總RNA提取——去除RNase污染玻璃器皿處理：

量筒、試劑瓶等玻璃器皿須200℃烘烤2小時以上。塑料器皿處理：0.1%DEPC水溶液浸泡過夜，再高溫高壓滅菌。試劑處理：氯仿、異丙醇、無水乙醇新開后RNA專用。0.1%DEPC水配制75%的酒精。專用的RNA操作室、專用器械。操作時戴口罩、手套、帽子、穿實驗服?？俁NA提取——樣本準備植物/動物組織樣本：新鮮取材或組織離體后液氮速凍，存于液氮或-80℃。為避免反復凍融，需小份分裝（50~100mg/份）。細胞樣本：新鮮收集待用或加入TRIzol后-80℃凍存細胞沉淀。血液樣本：新鮮血液分離出淋巴細胞，待用或加入TRIzol后-80℃凍存細胞沉淀。真核細胞總RNA提取——實驗步驟293細胞樣品為例收集細胞上層溶液離心洗滌裂解變性異丙醇沉淀

抽提RNA溶液干燥溶解詳細實驗步驟請參考說明書！總RNA提取——完整性檢測293細胞總RNA28S18S5S

由于動物細胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S（約4800nt），18S（約1900nt）和5.8S（約120nt）三種組成，所以電泳后應該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長度與結合EB的數(shù)量成正比，所以28SrRNA條帶的熒光強度一般比18SrRNA條帶的熒光強度強1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因為大的RNA被酶降解的可能更大）。電泳檢測總RNA提取——產量產率與純度檢測1.打開紫外分光光度計設定參數(shù)，具體操作參照儀器說明。2.取少量待測RNA樣品，用TEBuffer稀釋50倍（或100倍）。3.用TEBuffer做空白，在260nm、280nm、310nm處調節(jié)紫外分光光度計的讀數(shù)至零。4.加入待測RNA樣品在三個波長處讀取OD值?？俁NA提取——產量產率與純度檢測5.根據OD值計算RNA的濃度：[SSRNA]=40×(OD260－OD310)×稀釋倍數(shù)6.RNA產量產率計算：RNA的產量=RNA濃度×溶解體積RNA的產率=RNA產量/細胞用量7.根據OD值計算RNA的純度純RNA樣品的OD260/OD280

大約在1.8-2.0之間。RNA提取常見問題RNA降解DNA殘留OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常RNA提取常見問題分析RNA降解外源RNase的污染裂解液質量裂解液用量不足樣品本身富含RNase環(huán)境溫度過高28S18S5SRNA提取常見問題分析DNA殘留樣本量過多吸取到中間層及下層試劑解決辦法：DNA酶（RNasefree）消化，再抽提純化處理。RNA提取常見問題分析OD260/OD280比值偏低蛋白污染/苯酚殘留

——加入氯仿后徹底混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。

——不要吸入中間層及有機相，寧愿多損失些上清。 ——減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。RNA提取常見問題分析

電泳帶型異常上樣量超過3μg電壓超過8V/cm電泳緩沖液陳舊均可能導致28S和18S條帶分不開核酸簡介基因組DNA提取質粒DNA提取真核細胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳DNA的瓊脂糖凝膠電泳1.原理：

DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。而瓊脂糖凝膠具有分子篩作用，不同分子量或分子形狀的核酸，其移動速度有差異。因此，利用這種“電荷”和“分子篩”的雙重效應，達到分離核酸的目的。DNA的瓊脂糖凝膠電泳2.瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍DNA的瓊脂糖凝膠電泳3.DNA染料A:EB

溴化乙錠(EthidiumBromide,EB）可以嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。EB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以直接加到樣品中或膠中；價格低廉。

EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。EB廢液要經過處理才能丟棄。B：新型低毒染料：

如GoldView、SYBR

GreenⅠ、SYBR

Gold等。毒性較低，但價格較昂貴。靈敏度較好，但不如EB。DNA的瓊脂糖凝膠電泳4.瓊脂糖膠液制備（1%，50ml）

4.1