免疫比濁法檢測免疫球蛋白

免疫比濁法檢測免疫球蛋白免疫學(xué)系當(dāng)前第1頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，產(chǎn)生一定大小的復(fù)合物，形成光的折射或吸收，測定這種折射或吸收后的透射光或散射光作為計(jì)算單位。當(dāng)前第2頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)免疫比濁法分類當(dāng)一束光線通過溶液受到光散射和光吸收兩個因素的影響而使光的強(qiáng)度減弱透射比濁法:在光源的光路方向（00）測量透射光強(qiáng)度和被檢測溶液微粒濃度關(guān)系的方法。散射比濁法:在光源的光路方向（50-960）角的方向上測量透射光強(qiáng)度和被檢測溶液中微粒濃度關(guān)系的方法。當(dāng)前第3頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)

透射比濁法和散射比濁法光路檢測器A檢測器B

IC

I0

Iθ

Iθ透射比濁法散射比濁法當(dāng)前第4頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)（一）基本原理是個極其簡單的方法。在抗原過量情況下，與待測樣品中相應(yīng)的Ig發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，形成可溶性復(fù)合物，使反應(yīng)介質(zhì)的濁度發(fā)生改變。測量方法利用分光光度計(jì)測量被吸收的量。讀數(shù)以吸收單位（A）或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待測物中Ig含量可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。待測樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射光呈反比。反應(yīng)在PEG的作用下，加速復(fù)合物的形成。

免疫透射比濁法當(dāng)前第5頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)透射比濁法測定原理光源誘導(dǎo)劑當(dāng)前第6頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)樣品光電計(jì)濾光片光源透射比濁法測定原理當(dāng)前第7頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)透射比濁法的缺陷：(1)溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大，分子太小則阻擋不了光線的通過。(2)溶液中的抗原－抗體復(fù)合物的數(shù)量要足夠多。如果數(shù)量太小，溶液濁度變化太小，對光通量影響不大。(3)透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測仍需抗原－抗體溫育反應(yīng)時(shí)間，檢測時(shí)間較長。

光通量是每單位時(shí)間到達(dá)、離開或通過曲面的光能數(shù)量

當(dāng)前第8頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)

原理散射比濁法在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與IC的含量呈正比。當(dāng)前第9頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)散射比濁法測定原理增加散透率:660nm測定散射光聚集形成

誘導(dǎo)劑當(dāng)前第10頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)散射光測定檢測器(LED)光電計(jì)樣品100%0%時(shí)間散射光強(qiáng)度當(dāng)前第11頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)

速率散射比濁法

（一）基本原理

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是測定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動態(tài)過程。

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所謂速率，是在單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度。將各單位時(shí)間內(nèi)形成復(fù)合物的速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態(tài)的速率比濁分析。

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當(dāng)儀器測定到某一時(shí)間內(nèi)形成速率下降時(shí)，即出現(xiàn)速率峰，該峰值的高低，即代表所測抗原的量。當(dāng)前第12頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)CONCENTRATIONRATE在速率峰基礎(chǔ)上完成的標(biāo)準(zhǔn)曲線當(dāng)前第13頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)方法評價(jià)：

敏感度高快速(不必達(dá)平衡）抗原抗體結(jié)合的動態(tài)測定，理論上測定不受本底散射信號的影響可檢測微量樣品當(dāng)前第14頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)原理2.終點(diǎn)散射比濁法讓抗原抗體作用一定時(shí)間，使其反應(yīng)達(dá)到平衡后，測定其IC形成的量。IC的濁度不再受時(shí)間的影響，但反應(yīng)IC聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前，進(jìn)行濁度測定。當(dāng)前第15頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)散射比濁法的缺陷(1)因?yàn)槭且淮涡詼y定光吸收值，沒有考慮每一個待測樣本的吸收和散射效果，可測定結(jié)果不準(zhǔn)確(2)測定的仍是抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，不適合快速檢測。(3)終點(diǎn)法存在反應(yīng)本底，測定樣本的含量越低本底比例越大，故在微量測定時(shí)，本底的干擾是影響準(zhǔn)確測定的重要因素。

當(dāng)前第16頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)影響免疫比濁測定的因素1、抗原抗體比例2、抗體的質(zhì)量抗體的特異性、效價(jià)、親和力3、反應(yīng)的溶液4、增濁劑的使用當(dāng)前第17頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)1、透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。2、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點(diǎn)比較當(dāng)前第18頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)免疫濁度法測定中應(yīng)注意的問題

1、偽濁度的影響

偽濁度形成原因很復(fù)雜，主要是抗血清含有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應(yīng)時(shí)間掌握不當(dāng)；樣品本身的濁度處理不當(dāng)；試劑的污染和變質(zhì)；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。

2、非特異性散射光的影響

免疫濁度法經(jīng)常受內(nèi)源性光散射的干擾，為避免這些非特異性光散射的影響，應(yīng)用透射比濁法時(shí)需保證抗體組分在3％以下，散射比濁法需保證在0.5％以下。

當(dāng)前第19頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用聚乙二醇的生理特性

聚乙二醇是中性、無毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即PEG具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學(xué)體積，并且沒有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時(shí)，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識別。當(dāng)前第20頁\共有23頁\編于星期五\2點(diǎn)材料1.免疫球蛋白試劑A,M,G2.免疫球蛋白試劑A,M,G校準(zhǔn)品，蒸餾水3.微量加