免疫學技術演示文稿

免疫學技術演示文稿當前第1頁\共有128頁\編于星期五\2點經典的免疫學方法：一、凝集反應（agglutination）細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后形成凝集團塊的反應。1、直接凝集反應2、間接凝集反應3、間接凝集抑制反應當前第2頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第3頁\共有128頁\編于星期五\2點二、沉淀反應（precipitation）血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后出現沉淀物的反應。1、單向免疫擴散（singleimmunodiffusion）2、雙向免疫擴散（doubleimmunodiffusion）3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis）5、免疫濁度測定（immunonephelometry）當前第4頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第5頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第6頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第7頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第8頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第9頁\共有128頁\編于星期五\2點免疫濁度測定：可溶性Ag+Ab，二者比例合適時，在特殊的緩沖液中快速形成一定的AgAb復合物，使反應液出現濁度。透射比濁法散射比濁法速率散射比濁法終點散射比濁法當前第10頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第11頁\共有128頁\編于星期五\2點一定要保持抗體過量，以維持抗原－抗體復合物的相對不溶解性。當前第12頁\共有128頁\編于星期五\2點該方法的分析范圍主要檢測的是血漿、體液中特定蛋白系列。如Ig、補體、血漿蛋白、炎性反應蛋白、一些小分子量的治療性藥物濃度等。當前第13頁\共有128頁\編于星期五\2點第一節(jié)

免疫學檢測常用標記技術當前第14頁\共有128頁\編于星期五\2點免疫標記技術（immunolabellingtechnique）指用熒光素、放射性核素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質（膠體金、鐵蛋白）作為示蹤劑標記抗體或抗原進行的抗原—抗體反應。優(yōu)點：高靈敏度、特異性、快速，能定性、定量、定位測定，易于觀察結果并適合自動化檢測。總體分為：免疫組化：定位檢測組織或細胞中的

Ag/Ab免疫測定：定量檢測液體標本中的

Ag/Ab也可分為：熒光免疫技術，放射免疫技術，酶免疫技術，化學發(fā)光免疫技術及免疫金標記技術等。當前第15頁\共有128頁\編于星期五\2點一、酶免疫技術基本原理：以酶標記抗體（或抗原）用于免疫檢測，通過相應底物被酶解后的顯色反應，對標本中的抗原/抗體進行定量、定位分析。

標記物：酶（催化底物：生物放大作用）特點：靈敏度高、特異性強、準確性好，酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定，檢測方法簡便安全易行，容易與其他技術偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。當前第16頁\共有128頁\編于星期五\2點（一）常用的酶和酶作用底物1、辣根過氧化物酶（HRP）HRP來源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶（糖蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）組成的復合物。HRP常用的底物有：（1）鄰苯二胺（OPD）

OPD顯色后為橙黃色，加入終止液為棕黃色，可溶性產物，應用最早，但配成溶液后穩(wěn)定性差，且有潛在的致癌性，顯色反應需避光。（2）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）

TMB經酶作用呈蘭色，可溶性產物，加酸終止后黃色，穩(wěn)定性好，顯色反應無需避光，無致突變作用。應用最廣泛。但水溶性差。當前第17頁\共有128頁\編于星期五\2點

2、堿性磷酸酶（AP）

AP從大腸桿菌或小牛腸粘膜中提取，菌源性活力小于小腸粘膜活力。AP價格較HRP高，穩(wěn)定性差，但敏感度高，空白值低。可催化對硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黃色的對硝基酚，NaOH終止后黃色可穩(wěn)定存在一段時間（405nm）。當前第18頁\共有128頁\編于星期五\2點

（二）酶免疫技術的分類酶免疫組化

（EIH）

均相酶免疫測定（HEI）

酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定（EIA）

液相酶免疫測定（同RIA）當前第19頁\共有128頁\編于星期五\2點（三）酶免疫測定（EIA）

1、均相酶免疫測定（HEI）特點：僅需將待測樣品、酶標試劑和底物溶液混合，待抗原抗體反應完成即可直接測定結果，整個檢測過程都在均勻的液相中進行。以酶放大免疫測定技術（EMIT）為例：

當前第20頁\共有128頁\編于星期五\2點2、非均相酶免疫測定（1）液相酶免疫測定（液相EIA）：同RIA：抗原、酶標抗原、抗體相繼加入后，使反應達到平衡，再加分離劑。（2）固相酶免疫測定（固相EIA）：AgAb反應在固相載體的表面進行，應用最廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzymelinkedimmunosorbentassay——ELISA）當前第21頁\共有128頁\編于星期五\2點1）

ELISA

基本原理將抗原或抗體結合到固相載體的表面，并保持其免疫活性?？乖蚩贵w與酶連接成酶標抗原或抗體，仍分別保持其免疫活性和酶活性。在固相載體上按照一定的步驟加入待測抗原或抗體及酶標抗體或酶標抗原，洗去未結合的游離物質，加入酶的底物顯色，顏色的深淺與待測物質含量呈相關性。當前第22頁\共有128頁\編于星期五\2點2）固相載體的種類A、塑料制品聚苯乙烯：蛋白質非共價鍵或物理吸附結合到載體表面，可制成小試管、小珠、微量反應板的形式

專用于ELISA的微量反應板——ELISA板（812=96孔）B、微顆粒高分子單體聚合成的微球或顆粒，帶有能與蛋白質結合的功能基團，易于化學偶聯(lián)，結合容量大。反應時可均勻的分散到整個反應溶液中，反應速度快。其中可包裹磁性物質，制成磁化微顆粒，使分離可在磁板中完成，自動化分析。C、膜載體

NC膜（硝酸纖維素膜）、玻璃纖維素膜、尼龍膜等微孔濾膜。非共價鍵吸附Ab/Ag，吸附能力強。廣泛應用于斑點-ELISA等。當前第23頁\共有128頁\編于星期五\2點

3）ELISA方法類型及反應原理A、雙抗體夾心法

此法是檢測大分子抗原的常用方法。上述方法亦可改為雙位點一步法，使用針對抗原分子上兩個不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標抗體。注意鉤狀效應。當前第24頁\共有128頁\編于星期五\2點B、間接法

此法是測定抗體的常用方法?？梢杂靡环N酶標抗抗體檢測多種抗體。當前第25頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第26頁\共有128頁\編于星期五\2點C、競爭結合法

可用于測定小分子抗原或半抗原及抗體。以檢測抗原為例，待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，結合于固相的酶標抗原量與標本中待測抗原含量呈反比。當前第27頁\共有128頁\編于星期五\2點

D、捕獲法——最常用于檢測IgM抗體

包被抗人IgM鏈+待測標本IgM類抗體全被固相抗體捕獲洗滌+特異性抗原（針對待測IgM的相應抗原）與固相上特異性IgM結合+酶標抗體（針對特異性Ag的）+底物顯色顯色表示有特異性IgM。當前第28頁\共有128頁\編于星期五\2點

E、BAS-ELISA

生物素（B）-親和素（A）系統(tǒng)（biotinavidinsystem，BAS）是以生物素和親和素具有的獨特結合特性為基礎，它們的結合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級放大效應。應用生物素親和素放大系統(tǒng)的ELISA，使反應信號放大，檢測靈敏度提高。

當前第29頁\共有128頁\編于星期五\2點1個親和素（鏈霉親和素）可結合四個生物素衍化物1個抗體可結合多個B，與蛋白質-NH2結合形成肽鍵，-NH2越多，標記B越多。

E

BAg?

E—B—A—B—EBAbB

BB

EE—B—A—B—E當前第30頁\共有128頁\編于星期五\2點BAS-ELISA包括：

ABC-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

BA-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

BAB-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

例如：BAB-ELISA（雙抗體夾心法）：

固相Ab+待檢Ag+（Ab-B）+A+B-E+底物顯色當前第31頁\共有128頁\編于星期五\2點ABC-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）當前第32頁\共有128頁\編于星期五\2點（四）酶免疫組化（EIH）原理：以酶標記抗體與用于相應抗原反應，通過底物被酶解顯色以示蹤抗原-抗體結合物存在的部位。酶免疫組化染色標本可在普通光學顯微鏡下觀察，并能長期保存。此外，作為辣根過氧化物酶底物的二氨基聯(lián)苯胺（DAB），其分解產物為不溶性，適于鏡下觀察。當前第33頁\共有128頁\編于星期五\2點1、直接法組織標本待測抗原+酶標記抗體——DAB顯色2、間接法組織標本待測抗原+Ab1+酶標-二抗使用一種酶標抗體可檢測多種抗原。敏感性較直接法高，但低于PAP法。當前第34頁\共有128頁\編于星期五\2點3、生物素-親和素法將親和素（A）與生物素（B）系統(tǒng)應用于酶免疫組化包括：ABC法（直接法、間接法）BAB法（直接法、間接法）BA法（直接法、間接法）當前第35頁\共有128頁\編于星期五\2點3.

1）ABC法直接ABC法:玻片Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-AB*C特點:將BAB法中的A先與B·E結合，制備成復合物ABC間接ABC法：用生物素化的第二抗體與抗原抗體復合物結合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BABCAg-Ab1-Ab2·B-AB*C當前第36頁\共有128頁\編于星期五\2點2）BAB法（橋聯(lián)親合素-標記生物素法—BRAB）直接BAB法:組織切片或細胞涂片Ag+B·AbAg-Ab·BA

Ag-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特點：以游離A分別連接B·Ab和B·E間接BAB法：用生物素化的第二抗體與抗原抗體復合物結合組織切片或細胞涂片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BAAg-Ab1-Ab2·B-AB·EAg-Ab1-Ab2·B-A-B·E當前第37頁\共有128頁\編于星期五\2點3）BA法（標記親合素-生物素法——LAB法）直接BA（或LAB）法玻片Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點：以A·E/SA·E代替BAB法中的A，省卻了加B·E的步驟間接BA（或LAB）法：用生物素化的第二抗體與抗原抗體復合物結合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BA·EAg-Ab1-Ab2·B-A·E當前第38頁\共有128頁\編于星期五\2點

BAS實驗方法及反應層次

方法反應層次

直接法BAAg—(Ab-B)—A*BABAg—(Ab-B)—A—B*ABCAg—(Ab-B)—AB*C

間接法BAAg—Ab1—(Ab2-B)—A*

BABAg—Ab1—(Ab2-B)—A—B*

ABCAg—Ab1—(Ab2-B)—AB*C

Ag抗原；Ab-B生物素化抗體；

A親合素；A*標記親合素；

B生物素；B*標記生物素；

Ab1第一抗體；Ab2第二抗體;Ab2-B生物素化第二抗體當前第39頁\共有128頁\編于星期五\2點4、過氧化物酶-抗過氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidasecomplex，PAP）法和堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（alkalinephosphatase-antialkalinephosphatase，APAAP）法

原理：應用抗酶抗體與酶結合，形成可溶性、穩(wěn)定的酶-抗酶抗體復合物。此法優(yōu)點是：未經化學交聯(lián)反應，故避免了抗體和酶活性降低，并省去酶標記抗體需純化的繁復過程。當前第40頁\共有128頁\編于星期五\2點二、熒光免疫技術（fluoroimmunoassay）原理：以熒光素標記的抗體或抗原，用于相應抗原或抗體的分析鑒定。熒光免疫技術分為：免疫熒光顯微技術（熒光免疫組化）：用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的抗原（或抗體）進行鑒定和定位檢測，可在熒光顯微鏡下直接觀察實驗結果，流式細胞術：進行自動分析檢測熒光免疫測定：用于檢測體液標本中抗原或抗體。當前第41頁\共有128頁\編于星期五\2點（一）常用的熒光色素1、異硫氰酸熒光素（FITC）

橙黃色/黃色粉末，發(fā)出黃綠色熒光。最大吸收峰490—495nm，最大發(fā)射峰520—530nm，含異硫氰基N=C=S。應用最多的熒光素。2、四乙基羅丹明（RB200）

橘紅色粉末，發(fā)出橘紅色或橙色熒光。最大吸收峰570nm，最大發(fā)射峰595—600nm。含磺酸基。與FITC做雙標記或對比染色。3、藻紅蛋白（R-RE）發(fā)出橙色熒光，最大吸收峰565nm，最大發(fā)射峰575nm，可與FITC共用488nm激發(fā)光，可用于流式細胞儀的雙標記。當前第42頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）免疫熒光顯微技術1、方法及原理1）直接法應用特異性熒光抗體直接檢查標本中的相應抗原。2）間接法以特異性抗體（或待測抗體）為第一抗體，以熒光素標記的抗球蛋白抗體（標記的抗抗體）為第二抗體，用于檢測抗原或抗體。當前第43頁\共有128頁\編于星期五\2點3）補體法此法是在間接法的第一步抗原-抗體反應加入補體，使之與抗原-抗體復合物結合；再用熒光素標記的抗補體抗體進行示蹤。4）雙標記法

此法用異硫氰酸熒光素（FITC）及羅丹明（TRITC）分別標記不同抗體，進行同一標本的熒光染色，若有兩種相應抗原存在，可同時見兩種（橙紅、黃綠）熒光。當前第44頁\共有128頁\編于星期五\2點

2、熒光顯微鏡檢查1）染色標本盡可能立即觀察結果。2）鏡下觀察時同一標本區(qū)觀察時間不易過長。3）通風較好的暗室中進行。4）油鏡檢查時用無熒光鏡油，先觀察對照，再看待測標本。

當前第45頁\共有128頁\編于星期五\2點（三）流式細胞術（FCM）FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞表面標志（抗原或受體）進行快速、精確分析和自動檢測，并可對不同類型細胞進行分選和收集。FCM還可對同一細胞的多種參數（如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等）進行多信息分析，故成為當代生命科學研究領域中被廣泛應用的一項新技術。

當前第46頁\共有128頁\編于星期五\2點1、基本概念與原理

FCM是一種分析單個微粒（如細胞、微生物和人工合成微球等）物理和化學特性的技術，其特點是快速、準確、客觀，能定量。FCM的原理：懸浮在液體中的分散細胞單個地依次通過測量區(qū)時產生電信號，從而可快速對大量細胞進行多參數檢測和分析，并可從整個群體中分選出特定的細胞亞群。當前第47頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第48頁\共有128頁\編于星期五\2點2、流式細胞術在免疫細胞研究中的應用1）細胞表型分析表型分析可用于免疫細胞鑒定、計數和功能評價。2）細胞功能檢測（1）細胞功能狀態(tài)和活化信號轉導：包括檢測胞內鈣離子濃度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性狀態(tài)、信息傳遞相關蛋白表達及相互作用等。當前第49頁\共有128頁\編于星期五\2點（2）細胞增殖：應用活細胞染料5’-二醋酸羧基熒光素琥珀酸單胞菌酯（5’-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE）作為標記物，建立了檢測細胞增殖的新技術。原理：CFSE能自動穿過胞膜，與胞內蛋白賴氨酸不可逆結合，并隨細胞分裂而倍減，借助FCM檢測熒光強度，可判斷細胞的增殖狀態(tài)。

當前第50頁\共有128頁\編于星期五\2點（3）細胞分化：借助胞內細胞因子染色（intracelluarcytokinestaining，ICCS），可應用FCM檢測單細胞產生和分泌的CK，從而判斷單一細胞亞群的分化和功能狀態(tài)。原理：應用蛋白轉運抑制劑使胞內合成的CK滯留在高爾基體；應用透膜劑（saponin）使熒光標記抗體可逆性穿透胞膜，以進行胞內染色。當前第51頁\共有128頁\編于星期五\2點（4）細胞毒效應：通過檢測某些效應分子（FasL、穿孔素和顆粒酶等）可判斷細胞毒效應。（5）細胞凋亡：見下文。當前第52頁\共有128頁\編于星期五\2點（四）熒光免疫測定（FIA）1、熒光偏振免疫測定（FPIA）

該法主要用于小分子物質（特別是藥物濃度）測定。原理：熒光素標記的已知抗原+待測抗原+抗體——形成標記抗原抗體復合物，由于其分子量大，旋轉慢，在激發(fā)光照射下，吸收的偏振光多，發(fā)出的偏振熒光強，小分子游離標記抗原旋轉快，其偏振熒光弱。因此，標本中抗原濃度越高，形成的標記抗原抗體復合物越少，發(fā)出的偏振熒光越弱。反之，發(fā)出的偏振熒光越強。當前第53頁\共有128頁\編于星期五\2點

2、時間分辨熒光免疫測定（TR-FIA）原理：應用具有較長熒光壽命的鑭系螯合物（如銪）標記抗原或抗體，并利用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，有效消除非特異性本底熒光的干擾，所得信號完全是鑭系螯合物發(fā)射的特異熒光，從而最大限度提高測定方法的靈敏度和特異性。

當前第54頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第55頁\共有128頁\編于星期五\2點3、酶免疫熒光測定（ELFIA）

原理：應用具有潛在熒光的物質作為酶的底物，經過酶解反應產生高強度熒光，可用熒光測量儀進行定量測定。當前第56頁\共有128頁\編于星期五\2點三、放射免疫技術是以放射性核素作為示蹤劑的標記免疫測定方法，其特點是將核素分析的高靈敏度與抗原-抗體反應的特異性相結合。

廣泛應用于各種微量蛋白質、激素、小分子藥物和腫瘤標志物的定量分析，對相關學科的發(fā)展起到了極大的推動作用。包括放射免疫測定（RIA）和免疫放射測定（IRMA）當前第57頁\共有128頁\編于星期五\2點（一）常用的放射性核素射線：131I、125I、51Cr、60Co射線：14C、3H、32P射線半衰期長，易造成對環(huán)境的污染，比活性差，需液體閃爍儀。一般不用。當前第58頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）放射免疫測定（RIA）

1、RIA基本原理以放射性核素標記的抗原（Ag*）和檢品中待測的未標記抗原（Ag）與固定量特異性抗體競爭結合反應。若Ag*和Ab的量固定，二者結合所形成Ag*-Ab復合物受Ag含量制約。若反應系統(tǒng)中Ag含量高，其對Ab競爭結合能力即強，Ag-Ab復合物生成量增加，Ag*-Ab復合物則相對減少。因此，Ag*Ab復合物形成量與Ag含量間呈一定負相關函數關系。當前第59頁\共有128頁\編于星期五\2點Ag*+AbAg*Ab+Ag*

+

Ag

AgAb+Ag

BFB0T

當前第60頁\共有128頁\編于星期五\2點2、RIA測定方法1）AgAb反應2）B、F的分離加入PR試劑（二抗和PEG混合物，也可制成固相二抗（二抗與顆粒固相物連接）Ag*Ab1+Ab2——Ag*Ab1-Ab23）放射性強度的測定

——計數儀測上清/沉淀cpm，制備標準曲線（B/（B+F），B/F，B/B0）。亦可用計算機處理。當前第61頁\共有128頁\編于星期五\2點（三）免疫放射測定（IRMA）1、單位點IRMA是將待測抗原與過量標記抗體直接反應，然后加入固相的抗原免疫吸附劑與游離的標記抗體結合經離心去除沉淀物，測定上清液放射性強度，從而推算出檢品中待測抗原含量。2、雙位點IRMA測定固相上的cpm數當前第62頁\共有128頁\編于星期五\2點四、化學發(fā)光免疫技術是將發(fā)光技術與免疫反應和計算機技術結合的自動化儀器分析技術，目前已趨替代RIA而成為免疫檢測廣泛采用的分析技術?？捎糜诙囗椫笜说臋z測。可測定內分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標和貧血類等方面的檢測。

當前第63頁\共有128頁\編于星期五\2點（一）化學發(fā)光免疫測定（CLIA）CLIA是以化學發(fā)光劑（如魯米諾、吖啶酯等）標記抗體或抗原，免疫反應完成后，直接引發(fā)化學發(fā)光反應進行檢測。當前第64頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）化學發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）

CLEIA的抗原-抗體反應步驟與酶免疫測定相同，僅酶促反應所用的底物為發(fā)光劑，通過化學發(fā)光反應進行檢測。當前第65頁\共有128頁\編于星期五\2點（三）電化學發(fā)光免疫測定（ECLIA）

ECLIA實際上是在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應。三聯(lián)吡啶釕RU(bpy)32+三丙胺（TPA）.當前第66頁\共有128頁\編于星期五\2點電化學發(fā)光免疫分析示意圖當前第67頁\共有128頁\編于星期五\2點電化學發(fā)光免疫測定示意圖當前第68頁\共有128頁\編于星期五\2點五、免疫金標記技術（immunogoldlabellingtechnique）氯金酸（HAuCl4）在還原劑（枸櫞酸三鈉）作用下被還原成原子金，聚合成特定大小的金顆粒懸液，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)——膠體金。是以膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原-抗體反應。膠體金具有高電子密度，最初主要用于免疫電鏡技術，以后其應用范圍逐步擴展。在免疫組化方面，膠體金標記的抗體可直接用于檢測細胞表面和組織切片中的抗原或受體，并可在普通光學顯微鏡下觀察。在流式細胞術中，膠體金可作為多參細胞分析和分選的有效標記物。當前第69頁\共有128頁\編于星期五\2點常用的方法：1、免疫金（銀）染色法（IGS/IGSS）組織切片（抗原）+特異性抗體+膠體金標記二抗+銀顯影劑，標記物上的金顆粒催化硝酸銀離子還原成銀顆粒，在抗原抗體復合物上形成黑色“銀殼”，使Ag位置放大，從而提高了鏡下的可見度。

當前第70頁\共有128頁\編于星期五\2點用NC膜或微孔濾膜為載體吸附抗原，用膠體金標記抗體代替酶標抗體。2、斑點免疫層析試驗（DICA）當前第71頁\共有128頁\編于星期五\2點六、免疫印跡技術（immunoblotting）

又稱為Western-blotting，是將凝膠電泳的高分辨力與固相免疫測定結合起來的一種方法。由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）、蛋白質轉印和固相膜免疫測定三項技術結合而成。當前第72頁\共有128頁\編于星期五\2點七、免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）

是將免疫學反應和PCR技術相結合而創(chuàng)建的一種新的檢測技術，具有抗原、抗體反應的特異性和PCR技術的高效性?；驹恚河靡欢我阎腄NA分子作為標記物，結合一抗或二抗后去檢測相應抗原或抗體，再用PCR法擴增該DNA分子，擴增產物用瓊脂糖電泳定性，根據該DNA分子的存在與否，確定檢測結果。該方法與ELISA的原理類似，不同的是以DNA分子作為標記物。免疫PCR可采用直接法、間接法和雙抗體夾心法。當前第73頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第74頁\共有128頁\編于星期五\2點八、細胞凋亡檢測技術（一）形態(tài)學檢測

①應用電子顯微鏡或普通光學顯微鏡直接觀察細胞大小、凋亡小體和其他凋亡細胞的形態(tài)學改變；②應用某些可直接、間接產生熒光的染料[如雙苯并咪唑（HO）、碘化丙啶（PI）、AnnexinV等]使細胞著染，借助熒光顯微鏡區(qū)分凋亡細胞、壞死細胞和正常細胞。當前第75頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）生物化學檢測方法

凋亡細胞染色質DNA在核小體單位間連接處斷裂，形成180~200bp整數倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（DNAladder）。（三）免疫學檢測方法

原理：凋亡細胞染色質DNA斷裂而產生的核小體DNA，可與組蛋白結合為復合物。應用抗組蛋白和抗DNA單抗，借助ELISA方法可測定細胞凋亡。該技術優(yōu)點是：①可用于檢測不同培養(yǎng)細胞株或不同動物來源的細胞凋亡；②靈敏度高，且可檢測早期細胞凋亡。當前第76頁\共有128頁\編于星期五\2點（四）分子生物學檢測方法

常用技術為脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL），原理：凋亡細胞的DNA鏈發(fā)生斷裂而暴露3’-OH末端，可借助末端轉移酶（TdT）將脫氧核糖核酸與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA3’-OH末端，從而檢測細胞凋亡。TUNEL法的優(yōu)點是：能對完整的單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色；適用于不同樣本的檢測；靈敏度遠比一般組織化學和生化測定法高。當前第77頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第78頁\共有128頁\編于星期五\2點（五）流式細胞術1、亞“G1”峰檢測法

處于增殖周期的細胞，其在不同周期時相（Go/G1、S、G2/M）的DNA含量為2n~4n。凋亡細胞核內的DNA裂解成小片段，應用胞膜通透劑可使小分子量DNA片段穿過胞膜而丟失，僅剩大片段DNA，這些失去部分DNA的細胞，染色后形成一個DNA含量＜2n（即＜G1期細胞）的分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。該技術的缺點為：不能反映發(fā)生于G1峰后S期和G2期的細胞凋亡；不能區(qū)別死細胞和活細胞。當前第79頁\共有128頁\編于星期五\2點2、HO/PI染色法

原理：HO被活細胞攝取，與DNA結合后在紫外光下呈藍色熒光；PI使死細胞著染，產生紅色熒光。根據兩種熒光所形成的細胞二維直方圖，可分辨正?；罴毎⒌蛲黾毎退兰毎?。3、Annexin法

應用AnnexinV，AnnexinV是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，具有易于結合到磷脂類如PS（磷脂酰絲氨酸）的特性。對PS有高度的親和性。借助FCM可定量分析被標記的凋亡與壞死細胞數。當前第80頁\共有128頁\編于星期五\2點4、caspase活性檢測

caspase（胱天蛋白酶）水平及活性升高乃細胞凋亡的標志，并反映效應細胞的細胞毒活性。應用能透過胞膜的caspase熒光底物，其被酶切后釋放熒光基團，借助FCM檢測所釋放的熒光強度，可推斷caspase活性。該法優(yōu)點為：可在單細胞水平對抗原特異性T細胞細胞毒作用進行可視化和數量化分析。當前第81頁\共有128頁\編于星期五\2點第二節(jié)

免疫分子的檢測當前第82頁\共有128頁\編于星期五\2點一、免疫球蛋白測定檢測IgG、IgA、IgM含量常用單向免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法以及免疫化學自動分析儀。血清中IgE和IgD含量很低，須用RIA、ELISA、RAST等靈敏度較高的方法測定。當前第83頁\共有128頁\編于星期五\2點二、補體測定（一）血清總補體活性測定原理：應用家兔抗SRBC抗體致敏的SRBC作為抗原-抗體復合物，激活待測血清中補體經典途徑，導致SRBC溶解；若待測血清樣品中補體含量減少或某種補體成分缺失，可影響此種溶血反應。通常以50%溶血作為判定反應結果的終點，故稱為50%溶血試驗（50%complementhemolysis，CH50）。根據引起50%溶血所需的最小補體量，計算血清總補體活性。當前第84頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）血清補體旁路途徑活性測定原理：家兔紅細胞（RRBC）可直接激活人B因子，引起補體旁路途徑活化，導致RRBC溶解。（三）補體各成分測定1、免疫溶血法該法可用于C4、C2及B因子測定。以抗體致敏的SRBC作為指示系統(tǒng)進行檢測。2、免疫化學法常用方法有單向免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法、ELISA及RIA等。當前第85頁\共有128頁\編于星期五\2點三、細胞因子及其受體檢測（一）生物學檢測法原理為：根據CK特定的生物學活性，采用相應指示系統(tǒng)（如各種依賴性細胞株或靶細胞），通過與標準品對比，判斷樣品中細胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示?？煞譃榇龠M細胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、細胞毒活性測定法、細胞病變抑制法、趨化活性測定法等。當前第86頁\共有128頁\編于星期五\2點生物學檢測法優(yōu)點：靈敏度高（達pg水平），并能直接顯示CK生物活性。生物學檢測法缺點：多種CK可能具有相同功能，故干擾因素較多；某些抑制因子可降低CK活性；某些細胞同時表達CK受體，其與CK結合將影響生物學活性檢測結果。當前第87頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）免疫學檢測法1、體液中CK的檢測幾乎所有CK均可借助免疫學方法進行檢測。常用方法包括ELISA（雙抗體夾心法或競爭法）、RIA及免疫印跡法等。某些細胞因子含量甚微的樣品（如腦脊液）可用免疫PCR（immuno-PCR）進行檢測，極大地提高檢測靈敏度（可達1012mol/L）。當前第88頁\共有128頁\編于星期五\2點

2、單個細胞分泌CK的檢測（1）反向溶血空斑試驗（reversedhemolyticplaqueassay，RHPA）RHPA是一種體外檢測抗體分泌細胞的試驗。亦可將其用于測定CK分泌細胞。原理：待測CK分泌細胞+抗CK抗體+SPA-SRBC+補體，4種成分與瓊脂糖凝膠混勻，注入小室內；反應后導致SRBC溶解，在CK分泌細胞周圍形成溶血空斑，每個空斑代表一個CK分泌細胞，空斑大小與細胞所分泌CK的量成正比。當前第89頁\共有128頁\編于星期五\2點

（2）酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）

原理：抗CK抗體包被固相載體+待測分泌CK的細胞+結合后洗去細胞+酶標抗CK抗體+底物，顯色反應的深淺測定結合在固相載體上的CK量，并可在光鏡下觀察分泌CK的細胞。當前第90頁\共有128頁\編于星期五\2點當前第91頁\共有128頁\編于星期五\2點3、細胞內CK的檢測采用FCM免疫熒光技術可從單細胞水平檢測不同細胞亞群中的CK，用不同顏色熒光標記的抗CK抗體可在同一細胞內同時測定兩種不同CK。當前第92頁\共有128頁\編于星期五\2點免疫學檢測法優(yōu)點：①特異性強，可測出單一細胞因子含量；②方法簡便，無須細胞培養(yǎng)，便于大量樣品檢測；③實驗流程短，方法易標準化，重復性好免疫學檢測法缺點：①免疫學方法所檢出的細胞因子含量，與該因子生物活性并非必然平行；②不同單抗所識別的細胞因子表位和親和力不同，所測結果可出現差異。當前第93頁\共有128頁\編于星期五\2點（三）分子生物學檢測法應用細胞因子cDNA探針或寡核苷酸探針，經放射性核素（32P或35P）、生物素或地高辛標記，與提取的細胞因子mRNA進行雜交（Northernblot）；亦可在細胞或組織切片上進行原位雜交分析；若同時結合免疫組化技術，還可鑒定表達細胞因子基因的細胞類型。當前第94頁\共有128頁\編于星期五\2點分子生物學檢測法優(yōu)點：特異性高。分子生物學檢測法缺點：僅能檢測CK基因表達情況，不能直接提供CK含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究CK基因表達與調控。當前第95頁\共有128頁\編于星期五\2點四、黏附分子的檢測（一）細胞膜表面AM檢測1、間接免疫熒光法——組織細胞表面AM組織切片標本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG熒光抗體，進行間接免疫熒光染色，借助熒光顯微鏡觀察表達AM的陽性細胞數。2、間接酶免疫組化法——組織細胞表面AM組織切片標本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG酶標抗體，加入酶底物顯色，顯微鏡觀察表達AM的陽性細胞數。3、流式細胞術——內皮、淋巴細胞等表面AM待檢細胞懸液+兩種熒光素標記單抗，在流式細胞儀上可同時檢測胞膜表面兩種不同的AM。當前第96頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）可溶性AM測定1、ELISA雙抗體夾心：最常用于檢測選擇素家族和免疫球蛋白超家族成員。2、其他免疫測定方法：RIA或IRMA、化學發(fā)光免疫測定、時間分辨熒光免疫測定方法等當前第97頁\共有128頁\編于星期五\2點第三節(jié)

免疫細胞的檢測一、免疫細胞的分離與純化（一）白細胞的分離1、自然沉降法2、高分子聚合物加速沉降法當前第98頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）外周血單個核細胞（PBMC）的分離1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F-H）密度梯度離心法2、Percoll密度梯度離心法

（連續(xù)和不連續(xù)）當前第99頁\共有128頁\編于星期五\2點（三）淋巴細胞的純化與亞群分離1、去除紅細胞一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。

2、去除血小板離心洗滌或胎牛血清（FCS）梯度離心法，因FCS可讓單個核細胞通過，而阻止血小板通過。當前第100頁\共有128頁\編于星期五\2點3、去除單核細胞和粒細胞（1）黏附法玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG-10柱，清除發(fā)生黏附的細胞（2）羰基鐵粉吞噬法單核細胞吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細胞吸至管底（3）苯丙氨酸甲酯法苯丙氨酸甲酯具有親溶酶體性質，用該法可溶解含溶酶體的細胞（如單核、粒細胞等）。

當前第101頁\共有128頁\編于星期五\2點

4、淋巴細胞亞群的分離

（1）E花環(huán)分離法T細胞表達SRBC受體，能與SRBC結合形成E花環(huán)，而B細胞則不能。經聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心，可將T、B細胞分離。（2）尼龍棉柱分離法B細胞易黏附于尼龍棉纖維（聚酰胺纖維）表面，而T細胞則不易黏附，借此可將T細胞與B細胞分離。當前第102頁\共有128頁\編于星期五\2點（3）親和板結合分離法（洗淘法）直接結合法：抗體包被塑料平皿或細胞培養(yǎng)瓶（板）+細胞，吸附表達特定抗原的細胞。間接結合法：包被抗小鼠IgG抗體（第二抗體）+與單抗結合的淋巴細胞，被吸附固定而分離。特異性抗原（配體）包被+表達相應受體的細胞，該細胞被分離。當前第103頁\共有128頁\編于星期五\2點優(yōu)點：可同時進行細胞的陽性分選和陰性分選，且所獲細胞量較大。缺點：親和板結合分離法一般適合進行陰性分選。此外，包被的抗體宜采用不含Fc段的（Fab’）2抗體片段，以免發(fā)生非特異性吸附。當前第104頁\共有128頁\編于星期五\2點（4）補體細胞毒分離法抗體+細胞+補體，通過補體依賴的細胞毒作用（CDC）而清除相應細胞，用于細胞陰性分選。

（5）流式細胞術分選法當前第105頁\共有128頁\編于星期五\2點直接法：將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，稱為免疫磁珠（IMB），其可與表達相應膜抗原的細胞結合；應用強磁場分離IMB及其所吸附細胞，從而對特定細胞進行陰性或陽性分選。間接法：用抗小鼠IgG抗體（第二抗體）包被磁性微珠，可與任何已結合鼠源性單克隆抗體（一抗）的細胞發(fā)生反應，從而對細胞進行分離。（6）磁性激活細胞分離器（MACS）分離法

當前第106頁\共有128頁\編于星期五\2點MACS分離法優(yōu)點：所獲細胞純度高（93%~99%），獲率可達90%，活細胞率＞95%；分離效果可與流式細胞術相媲美，但比后者省時且費用低，操作簡單。缺點：陽性分選中，抗體可導致細胞活化或細胞凋亡。當前第107頁\共有128頁\編于星期五\2點（四）單核-吞噬細胞分離和收集1、將PBMC通過Percoll連續(xù)密度梯度離心法或洗淘法（陽性分選）可獲取單核細胞，但所得細胞數量較少。2、斑蝥敷貼法可以從組織滲出液中獲得數量較多且較純的巨噬細胞，亦無需作進一步分離。3、以滅菌巰基乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基（或無菌液體石蠟）注入小鼠腹腔內，引起無菌性炎性滲出，從腹腔沖洗液中可獲得大量巨噬細胞（＞85%）。當前第108頁\共有128頁\編于星期五\2點二、淋巴細胞及其亞群檢測（一）T細胞檢測計數1、間接免疫熒光法

應用抗CD3/CD4/CD8單抗與PBMC結合，再加入熒光素標記的抗小鼠IgG抗體（第二抗體），在熒光顯微鏡下觀察并計數。2、酶免疫組化法1）堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（APAAP）法；2）ABC法（間接法）

細胞涂片+單抗+二抗-B+AB*C+底物顯色3、流式細胞術采用流式細胞儀計數4、免疫金銀染色法（IGSS）當前第109頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）B細胞檢測計數1、膜表面免疫球蛋白（mlg）檢測

細胞涂片+熒光素標記抗Ig抗體（免疫熒光法）/+酶標記抗Ig抗體（酶免疫組化法）2、間接免疫熒光法

細胞+CD19/CD20/CD21/CD22等的單抗+熒光素標記的二抗，鑒定和檢測計數B細胞。3、流式細胞術4、B細胞亞群檢測

采用流式細胞儀，標記CD5單抗和標記CD19單抗，鑒定B1細胞和B2細胞。當前第110頁\共有128頁\編于星期五\2點三、免疫細胞功能測定（一）吞噬細胞功能測定1、中性粒細胞趨化功能測定（1）濾膜滲透法（Boyden小室法）

在上室加入待測細胞，下室加入趨化成分，上下室間被具有一定孔徑和厚度的纖維膜隔開，反應后取纖維膜清洗后進行固定、染色和透明化，在高倍鏡下觀察細胞穿越纖維膜的移動距離，從而判斷其趨化作用。當前第111頁\共有128頁\編于星期五\2點（2）瓊脂糖平板法：在瓊脂糖平板中央孔內加白細胞懸液，兩側孔內分別加趨化因子或對照液，反應后通過固定和染色，觀察細胞定向移動能力。當前第112頁\共有128頁\編于星期五\2點2、中性粒細胞吞噬、殺菌功能測定（1）顯微鏡檢法

白細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合、溫育，取樣制片、固定、染色；在油鏡下觀察多形核白細胞對細菌的吞噬情況，計算其吞噬率（%）和吞噬指數（phagocyticindex）及殺菌率。當前第113頁\共有128頁\編于星期五\2點（2）硝基藍四氮唑（NBT）還原試驗中性粒細胞在吞噬、殺菌過程中，能量消耗驟增，氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代謝活性增強；葡萄糖分解的中間產物6-磷酸葡萄糖在氧化脫氫轉變?yōu)槲焯沁^程中，所釋放的氫被攝入吞噬體的NBT染料接受，使其被還原成藍黑色點狀或塊狀甲臢顆粒，沉積于中性粒細胞胞質內。一般以陽性細胞數超過10%判定為NBT試驗陽性。

當前第114頁\共有128頁\編于星期五\2點3、巨噬細胞吞噬功能測定

巨噬細胞+雞紅細胞（具有清晰可見的胞核）吞噬試驗，計算吞噬率和吞噬指數。4、巨噬細胞胞毒作用測定用-干擾素激活小鼠腹腔巨噬細胞，觀察其對125I-UdR標記的小鼠肥大細胞瘤P815的殺傷活性。

當前第115頁\共有128頁\編于星期五\2點（二）T細胞功能測定1、T細胞增殖（轉化）試驗

T細胞在體外受抗原或絲裂原（PHA、ConA）刺激后，細胞代謝和形態(tài)發(fā)生變化，主要表現為胞內蛋白質和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應，并轉變?yōu)榱馨湍讣毎＃?）形態(tài)學觀察：依據淋巴母細胞轉化的形態(tài)學特征，借助光學顯微鏡進行檢測。優(yōu)點：方法較簡單，無需特殊儀器設備。缺點：依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，準確性較差。當前第116頁\共有128頁\編于星期五\2點（2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）摻入法：

T細胞增殖，其胞內新合成DNA需攝取核苷酸原料，故應用核素標記的核苷酸參與反應，通過測定放射性強度可反映淋巴細胞增殖水平。優(yōu)點：靈敏，可自動操作。缺點：若操作不規(guī)范，可影響實驗結果重復