植物源農(nóng)藥殺蟲與抑制幾丁質(zhì)酶活性的測定

植物源農(nóng)藥殺蟲與抑制幾丁質(zhì)酶活性的測定【摘要】目的研究青蒿葉、桉樹葉、紅樹植物白骨壤葉乙醇提取物對大蠟螟蟲的毒殺作用以及對蟲體幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用。方法采用室內(nèi)藥液噴蟲法測定3種植物乙醇提取物的殺蟲活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果青蒿、桉樹、紅樹植物白骨壤葉乙醇提取物對大蠟螟24h的校正死亡率分別為(69.00±3.87)%，(53.47±11.63)%，(18.60±6.70)%。對大蠟螟幾丁質(zhì)酶的抑制率分別為(20.33±1.42)%，(20.59±1.72)%，(13.56±1.58)%。結(jié)論青蒿葉與桉樹葉植物乙醇提取物的殺蟲活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性顯著高于紅樹植物白骨壤葉乙醇提取物(P0.05)?！娟P(guān)鍵詞】植物源農(nóng)藥;大蠟螟;殺蟲活性;幾丁質(zhì)酶Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfsutherndleaves,eualyptusleavesandangrveavienniaarinaleavesethanlextratsntheinsetiidalativityandhitinaseinhibitryativityagainstGalleriaellnella.ethdsTheinsetiidalativityandhitinaseinhibitryativityfthethreeplantethanlextratseretestedfrindrntattxiitybyusingsprinklingethd.ResultsTheresultsshedthatafter24htreatent,therreteddeathratisfsuthernd,eualyptusandangrveavienniaarinaleavesethanlextratere(69.00±3.87)%,(53.47±11.63)%,(18.60±6.70)%andtheinhibitinratisfhitinaseere(20.33±1.42)%,(20.59±1.72)%,(13.56±1.58)%,respetively.nlusinTheinsetiidalativityandhitinaseinhibitryativityfsutherndandeualyptusleavesethanlextraterehigherthanangrveavienniaarinaleavesethanlextratarkedly.Keyrds：BtanialPestiides;Galleriaellnella;Insetiidalativity;hitinase21世紀(jì)全球農(nóng)業(yè)開展的一個重要趨勢是更加注重農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量平安性,倡導(dǎo)平安優(yōu)質(zhì)綠色食品[1，2]，從天然植物中提取殺蟲活性物質(zhì)防治農(nóng)林害蟲,已成為研究熱點,并對現(xiàn)代農(nóng)藥研究具有重要意義。幾丁質(zhì)酶(hitinase)可以水解昆蟲體壁和中腸中的幾丁質(zhì)，在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中扮演重要角色。幾丁質(zhì)酶抑制劑通過抑制幾丁質(zhì)酶活性干擾昆蟲正常變態(tài)發(fā)育過程而到達(dá)殺蟲的目的。由于動植物機體不含幾丁質(zhì)，故以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的新型生物農(nóng)藥具有平安無害的優(yōu)點[3，4]。目前已挑選出近十種不同來源的幾丁質(zhì)酶抑制劑,包括糖類與肽類幾丁質(zhì)酶抑制劑[4]。而有關(guān)青蒿葉、桉樹葉、紅樹植物白骨壤葉來源的幾丁質(zhì)酶抑制劑未見報道。大蠟螟(Galleriaellnella)屬螟蛾科蠟螟亞科,是養(yǎng)蜂業(yè)的主要害蟲。由于大蠟螟易于人工飼養(yǎng)，在農(nóng)藥學(xué)上可作為生測試蟲[5]。本研究以大蠟螟為測試對象，研究青蒿葉、桉樹、紅樹植物白骨壤葉乙醇提取物對它的毒殺作用以及對蟲體幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用，為開發(fā)新型平安植物源農(nóng)藥提供參考。1材料大蠟螟蟲(廣西甘蔗研究所提供)。青蒿葉、桉樹葉、紅樹植物白骨壤葉采自廣西藥用植物園、廣西防城港等地。2方法2.1植物源農(nóng)藥提取物的制備稱取10g青蒿葉、桉樹葉、紅樹植物白骨壤葉枯燥粉末，參加20l50%乙醇，超聲萃取20in，過濾，濾液減壓蒸餾，搜集膏狀物并稱重，用95%的乙醇溶解，配制成濃度為100g/l的植物提取物母液備用。2.2殺蟲實驗選擇蟲齡與蟲體大小根本一致的試蟲20只，置于墊有中性濾紙的90保濕玻璃培養(yǎng)皿中,將植物提取物母液稀釋為1.5%的濃度(內(nèi)含1%的吐溫80)，作為供試藥液。采用小型噴霧器噴霧法對準(zhǔn)蟲噴霧,每皿噴藥液約1l。對照組用95%的乙醇代替供試藥液，將培養(yǎng)皿放置于26℃的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h(晝夜比16∶8)。24h后檢查死蟲數(shù)，計算死亡率與校正死亡率。死亡率(%)=(死亡的蟲子/蟲子總數(shù))×100%，校正死亡率(%)=[(死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)]×100%。測定活蟲體幾丁質(zhì)酶活力，計算酶活抑制率。每處理設(shè)3個重復(fù)。2.3蟲體蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍(lán)G-250法測定大蠟螟蟲勻漿液中蛋白質(zhì)含量[6]。2.4N-乙酰氨基葡萄糖復(fù)原糖的測定3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定[6]。2.5幾丁質(zhì)酶液的提取與活性測定取1g蟲體，冰浴研磨勻漿,制成10%勻漿液，離心(3500r/in)20in取上清用于酶活的測定。取0.5l上清液參加ll磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.6)，0.5l1.5%膠體幾丁質(zhì)，于37℃水浴振蕩酶反響30in，立即沸水浴10in終止酶反響后離心(4000r/in)5in后取上清液0.5l，采用DNS法測定酶反響過程中產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖復(fù)原糖的量。酶活力單位(U)以在上述反響條件下,每1in產(chǎn)生1μlN-乙酰氨基葡萄糖復(fù)原糖所需的酶量計算。酶比活力以單位蟲體蛋白質(zhì)的酶活力表示。3結(jié)果與分析3.1植物源農(nóng)藥提取物的殺蟲活性見表1。由表1可知，3種植物源農(nóng)藥提取物均表現(xiàn)出一定的殺蟲活性。其中青蒿葉與桉樹葉乙醇提取物對大蠟螟的校正死亡率較高，兩者之間無顯著性差異(P0.05)。校正死亡率最低的為紅樹植物白骨壤葉乙醇提取物，與青蒿葉、桉樹葉乙醇提取物相比差異到達(dá)顯著程度(P0.05)。表1植物源農(nóng)藥提取物的殺蟲活性表中同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示在P0.05程度上有顯著差異3.2大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性的測定根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.04131X–0.03356，R2=0.9992)求出大蠟螟蟲勻漿液中蛋白質(zhì)含量為33.7ug/g鮮重。N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.264X-0.0193，R2=0.9933，K=1.264。通過測定D540并計算大蠟螟單位蟲體蛋白的幾丁質(zhì)酶比活力。見表2。表2大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性測定轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.幾丁質(zhì)酶在昆蟲生長的每一階段都必須維持在一定的程度,過量或缺乏都將對昆蟲造成致命的影響。通過調(diào)節(jié)昆蟲表皮和圍食膜中幾丁質(zhì)酶的活性是很好的害蟲防治策略。本研究中測得正常大蠟螟幾丁質(zhì)酶平均比活力為99.2U/g蛋白。這一測定值代表了沒有經(jīng)過藥液處理的大蠟螟蟲體幾丁質(zhì)酶活總體程度。3.3植物源農(nóng)藥提取物對大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性的抑制由表3可知，3種植物源農(nóng)藥乙醇提取物對大蠟螟幾丁質(zhì)酶活力均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中青蒿葉與桉樹葉乙醇提取物對大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性抑制作用最強，兩者之間無顯著性差異(P0.05)。而對幾丁質(zhì)酶活性抑制作用最弱的為紅樹植物白骨壤葉乙醇提取物，與青蒿葉、桉樹葉乙醇提取物相比差異到達(dá)顯著程度(P0.05)。表3不同植物提取物對大蠟螟幾丁質(zhì)酶的抑制作用表中同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示在P0.05程度上有顯著差異以上3種植物源農(nóng)藥乙醇提取物對大蠟螟幾丁質(zhì)酶活力的抑制作用類型與機理以及對大蠟螟幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)的影響等方面還需深化研究。4討論青蒿別名黃花蒿、臭蒿,一年生草本植物，為菊科篙屬植物，研究報道證明青蒿除具有抗菌活性外,還具有殺蟲活性。姚安慶等[7]研究了黃花篙的乙醇、氟仿、石油浸提物對菜粉蝶幼蟲的拒食作用、觸殺作用，結(jié)果說明黃花篙乙醇浸提物的活性較好，48h拒食率為72.11%。aggi等[8]報道黃花篙地上局部的乙醇提取物對南部灰翅夜蛾的取食抑制率為87%。李云壽等[9]報道青蒿乙醇提取物對菜青蟲5齡幼蟲24h校正死亡率為63.33%。本研究中青蒿葉乙醇提取物對大蠟螟24h的校正死亡率為(69.0±3.87)%。說明青蒿葉乙醇提取物有較好的殺螟蟲活性。桉樹植物系屬桃金娘科喬木，是廣西引種最廣泛的樹種之一。有研究發(fā)現(xiàn)桉樹葉的水提劑、乙醇提取物對釘螺具有較好的殺滅作用[10]。本研究中桉樹葉乙醇提取物對大蠟螟24h的校正死亡率為(53.47±11.63)%，具有較好的殺螟活性。紅樹植物是生長在熱帶和亞熱帶海岸潮間帶的一種特殊的常綠植物群落，由于其所處的特殊生態(tài)環(huán)境，會產(chǎn)生許多其他陸生植物所不具備的特殊次生物質(zhì)，鄧業(yè)成等[11]報道采用葉片殘毒法測定了16種紅樹植物甲醇提取物對柑橘紅蜘蛛的殺螨活性，其中白骨壤枝葉甲醇提取物對柑橘紅蜘蛛卵的校正死亡率達(dá)(83.29±2.73)%。而本研究中白骨壤葉乙醇提取物對螟蟲的校正死亡率為(18.6±6.70)%，殺螟蟲活性較低。這可能與所采用的溶劑不同、試蟲不同等因素有關(guān)。青蒿葉、桉樹葉、紅樹植物白骨壤葉3種植物源農(nóng)藥乙醇提取物對大蠟螟的殺蟲活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性相一致。說明幾丁質(zhì)酶可能是以上3種植物源農(nóng)藥的作用靶標(biāo)酶。青蒿葉與桉樹葉乙醇提取物具有較高的殺蟲活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性,可作為以幾丁質(zhì)酶為新靶點的生物農(nóng)藥。由于以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的新型生物農(nóng)藥具有對人、畜無害的優(yōu)點，因此圍繞幾丁質(zhì)酶設(shè)計開發(fā)新型農(nóng)藥品種,其運用前景極為廣闊。而關(guān)于這幾種植物殺蟲活性成分的活性跟蹤、提娶別離和挑選以及高活性的殺蟲植物的直接利用方法,還有待于進(jìn)一步的研究。【參考文獻(xiàn)】[1]錢允輝,張雪峰，王志強.常用蔬菜農(nóng)藥殘留速測方法的應(yīng)用效果研究[J].中國測試技術(shù),2022,32(3):122.[2]陳志杰,張淑蓮,梁銀麗,等.設(shè)施蔬菜病蟲綠色防治技術(shù)初探[J].西北植物學(xué)報,2022,23(8):1452.[3]張福麗,王志英,王占斌,等.昆蟲幾丁質(zhì)酶及其在植物害蟲防治中的應(yīng)用前景[J].農(nóng)藥市場信息，2022，22(20):1.[4]謝潔，周澤揚.幾丁質(zhì)酶抑制化合物研究進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