生物信息學(xué)第五章核酸序列分析

生物信息學(xué)第五章核酸序列分析第一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日基因結(jié)構(gòu)及功能的預(yù)測和分析PromoterEnhancerTerminatorRegulatoryelementGCboxCAATboxTATAboxPribnowbox-35regionExonExonIntronORF5`3`TGGATATTATAGCTAGAGCGGATAStem-loop第二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日一、核苷酸頻率分析(單鏈)核苷酸頻率：對于一個給定的基因組，最簡單的計算就是統(tǒng)計DNA序列中各類核苷酸出現(xiàn)的頻率。對于隨機分布的DNA序列來說，每種核苷酸的出現(xiàn)是均勻分布的，即出現(xiàn)頻率各為0.25。而真實基因組的核苷酸分布則是非均勻的，如酵母基因組核苷酸出現(xiàn)頻率如下左表。單雙鏈的區(qū)別：同時計算DNA的正反兩條鏈，根據(jù)堿基配對原則，A和T、G和C的出現(xiàn)頻率應(yīng)該是相同的。但實際上A和T、G和C的出現(xiàn)頻率不同，但是卻非常接近，如酵母單鏈核苷酸出現(xiàn)頻率如下右表。核苷酸頻率A0.325T0.325G0.175C0.175核苷酸頻率A0.344T0.343G0.157C0.155(單鏈)核苷酸頻率同時計算DNA的正反兩條鏈核苷酸頻率第三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日例：(單鏈)核苷酸頻率核苷酸頻率ATGC第四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日核苷酸關(guān)聯(lián)性分析-雙聯(lián)核苷酸頻率：不同基因組中兩個連續(xù)核苷酸出現(xiàn)的頻率也是不相同的4種核苷酸可以組合成16種兩聯(lián)核苷酸核苷酸對頻率AA0.1193400681800AC0.0520605330203AG0.0558517890546AT0.0975313373925CA0.0583060967492CC0.0325646199051CG0.0283909584052CT0.0558517890546GA0.0557622179282GC0.0348050746970GG0.0325646199051GT0.0520605330203TA0.0915019798308TC0.0557622179282TG0.0583060967492TT0.1193400681800酵母基因組兩聯(lián)核苷酸頻率表設(shè)：Pij代表兩聯(lián)核苷酸(i,j)的出現(xiàn)頻率；Pi代表核苷酸i的出現(xiàn)頻率則：Sij=Pij/(PiPj)，

Sij反應(yīng)了核苷酸i和j的關(guān)聯(lián)關(guān)系，若Sij=1，則在兩個連續(xù)的位置上，核苷酸i和j的出現(xiàn)是相對獨立的。若Sij>1，則兩個連續(xù)位置上，核苷酸i和j的出現(xiàn)是相關(guān)的。如：酵母基因組P(A)=0.3248，P(AA)=0.1193，則S(AA)=0.1193/(0.32482×0.32482)=1.131>1，這表明在兩個連續(xù)位置上“A”的出現(xiàn)不是獨立的，而是相關(guān)的。第五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日三聯(lián)核苷酸頻率–基因密碼子常常需要對三聯(lián)核苷酸進(jìn)行統(tǒng)計分析，這實際上是分析密碼子的使用偏性。密碼子用法：在基因中，同義密碼子用法（如出現(xiàn)頻率等）并不是完全一致的，不同物種、不同個體的密碼子用法存在差異。蛋白三級結(jié)構(gòu)、功能與密碼子用法有關(guān)。通過聚類分析(clusterAnAlysis)，發(fā)現(xiàn)具有相似三級結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因大致聚在同一類中，對于同一類型的基因，由物種引起的同義密碼子使用偏性的差異較小。AAACAAGAATAAAACCACGACTACAAGCAGGAGTAGAATCATGATTATACACCAGCATCAACCCCCGCCTCCACGCCGGCGTCGACTCCTGCTTCTAGACGAGGATGAAGCCGCGGCTGCAGGCGGGGGTGGAGTCGTGGTTGTATACTAGTATTAATCCTCGTCTTCATGCTGGTGTTGATTCTTGTTTTT6第六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日密碼子的簡并(degenerAcy)：氨基酸都對應(yīng)2種以上密碼子(M，W除外)，最多有6種對應(yīng)的密碼子。氨基酸有20~21種，三聯(lián)核苷酸有43=64種。氨基酸密碼子IATT,ATC,ATALCTT,CTC,CTA,CTG,TTA,TTGVGTT,GTC,GTA,GTGFTTT,TTCMATGCTGT,TGCAGCT,GCC,GCA,GCGGGGT,GGC,GGA,GGGPCCT,CCC,CCA,CCGTACT,ACC,ACA,ACGSTCT,TCC,TCA,TCG,AGT,AGCYTAT,TACWTGGQCAA,CAGNAAT,AACHCAT,CACEGAA,GAGDGAT,GACKAAA,AAGRCGT,CGC,CGA,CGG,AGA,AGG*TAA,TAG,TGA20種氨基酸的密碼子表二、密碼子偏好性分析密碼子使用偏好(CodonusAgebiAs)：不同生物常常偏好使用編碼同一個氨基酸的多個密碼子中的一個；偏好的產(chǎn)生是一個分子進(jìn)化的爭論熱點，一般認(rèn)為密碼子偏好反映了變異偏好和自然選擇的平衡，在生長快的微生物中，如大腸桿菌和酵母，偏好反映了該物種tRNA的組成；偏好的密碼子往往翻譯更快更精確，研究tRNA進(jìn)化較少。第七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日異常起始密碼子GUGUUGAUAAcinetobactercalcoaceticus，乙酸鈣不動桿菌Alcaligeneseutrophus，真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Bacillusamyloliquefaciens，解淀粉芽孢桿菌Bacillusbrevis，短芽孢桿菌Agrobacteriumrhizogenes，發(fā)根土壤桿菌Bacilluscereus，蠟樣芽孢桿菌Clostridiumacetobutylicum，丙酮丁醇梭菌Escherichiacoli，大腸埃希氏菌Strephylococcusaureus，金黃色葡萄球菌Escherichiacoli，大腸埃希氏菌第八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Sequence=“ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTCGAGGC”Translation(StandardGeneticCode)=“MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQKLEDVFAGKNTDLE”Translation(PlantMitochondrialCode)=“MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKTEIAQKLEDVFAGKNTDLE”Translation(VertebrateMitochondrialCode)=“MSLLTEVETTVLSIIPSGPLKAEIAQKLEDVFAGKNTDLE”例第九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日密碼子使用偏好性分析工具（在線）：CodonUsageDatabaseCodonUsageAnalyzerCodonW第十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日密碼子分析數(shù)據(jù)庫：CodonUsageDatabasehttp://www.kazusa.or.jp/codon/查詢物種名稱第十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日CodonUsageDatabase查詢結(jié)果第十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日CodonUsageAnalyzer/codon/cgi-bin/codon.cgi第十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日GC含量(GCcontent)：是基因組的基本參數(shù)，即DNA分子或基因組中GC堿基對所占的比例，通常用百分比表示，如15~75%。物種的GC含量存在兩頭少中間多的正態(tài)分布情況。GC含量可用分光計測量，DNA的解鏈溫度(解鏈時260nm光的吸收率猛增)，因GC間為3個氫鍵，因此，(超)嗜熱菌GC含量高(GC-rich)。GC含量被用于分類學(xué)，也對PCR重要，一般基因內(nèi)GC含量高于基因組，外顯子高于內(nèi)含子(原因不明)。三、GC含量分析第十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTATotalbases=437A=98[A]=22.43%C=141[C]=32.27%T=66[T]=15.10%G=132[G]=30.21%A+T=164[A+T]=37.53%C+G=273[C+G]=62.47%第十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日第十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日ORF(Openreadframe)：開放閱讀框是基因序列中的一段無終止序列打斷的堿基序列，可編碼相應(yīng)的蛋白。ORF的識別是證明一個新的DNA序列為特定的蛋白質(zhì)編碼基因的部分或全部的先決條件。例如，對于序列ATTCGATCGCAA，一種可能的密碼子閱讀順序為ATT、CGA、TCG、CAA，另外兩種可能的密碼子閱讀順序分別為A、TTC、GAT、CGC、AA和AT、TCG、ATC、GCA、A。這三種順序被稱為開放閱讀框。實現(xiàn)方法：①掃描給定的DNA序列，在3個不同的閱讀框中尋找較長的ORF。②當(dāng)遇到終止密碼子后，回頭尋找起始密碼子，以確定完整的編碼區(qū)域。四、開放閱讀框分析第十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日基因開放閱讀框/基因結(jié)構(gòu)分析識別工具Getorfhttp://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/getorf.htmlEMBOSS通用Plotorfhttp://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/plotorf.htmlEMBOSS通用ORFFinder/gorf/gorf.htmlNCBI通用BestORF/all.htmSoftberry真核GENSCAN/GENSCAN.htmlMIT脊椎、擬南芥、玉米GeneFinder/tools/genefinder/Zhanglab人、小鼠、擬南芥、酵母FGENESH/all.htmSoftberry真核GeneMark/GeneMark/GIT原核GLIMMER/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi/software/glimmer

Maryland原核FgeneSB/all.htmSoftberry細(xì)菌FgeneSV/all.htmSoftberry病毒Generation/generation/ORNL原核FGENESH+/all.htmSoftberry原核GenomeScan

/genomescan.html

MIT脊椎、擬南芥、玉米GeneWise

http://www.ebi.ac.uk/Wise2/EBI人、蠕蟲GRAIL/grailexp/ORNL人、小鼠、擬南芥、果蠅第十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日例：胰島素由A、B兩個肽鏈組成。人胰島素(InsulinHuman)A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共16種51個氨基酸組成。

Accession：NM_000207“AGCCCTCCAGGACAGGCTGCATCAGAAGAGGCCATCAAGCAGATCACTGTCCTTCTGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCAAAA”第十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日第二十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日ORFFinder

是一個圖形的序列分析工具，分析并找到序列的ORF區(qū)(開放讀碼框架)，這個工具使用標(biāo)準(zhǔn)的或其它特殊的遺傳密碼子列出所有可能的ORF區(qū)，并推出氨基酸序列。第二十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日點擊結(jié)果出現(xiàn)六個圖形，這是根據(jù)六種不同的編碼方式得到的（包括正反鏈）。右邊出現(xiàn)各個預(yù)測的ORF區(qū)的長度與編碼方式。點其中一個就可以看該區(qū)域的序列，并且有推導(dǎo)的氨基酸序列。一般來講，長的ORF區(qū)基本上都是正確的，有可能編碼基因。第二十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日五、啟動子分析原核生物真核生物TTGACATATAATAmRNA＋1－10－35PyAPyTATAATGC區(qū)CAAT區(qū)mRNA＋1－40－25－110增強子上游啟動子元件，UPE核心啟動子元件轉(zhuǎn)錄起始位點第二十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日啟動子預(yù)測：1、CpGProD(CpG

Island

Promoter

Detection)

，

預(yù)測哺乳動物

CpG

島相關(guān)啟動子序列的程序。http://pbil.univlyonl.fr/software/cpgprod_query.html

2、Dragon

Promoter

Finder

啟動子預(yù)測工具，適用于預(yù)測脊椎動物啟動子，支持多種序列格式。

.sg/promoter/promoter1_5/DPF.hm3、McPromoter，麻省理工大學(xué)開發(fā)的真核生物

(

主要是脊椎動物

/

果蠅

)DNA

轉(zhuǎn)錄起始位點預(yù)測工具，其目標(biāo)是盡量精確地預(yù)測

RNA

轉(zhuǎn)錄酶

II

的啟示轉(zhuǎn)錄位點，需要提供一個

Email

來接收預(yù)測結(jié)果，可以特異的選擇脊椎動物或是果蠅。

/generegulation/McPromoter/4、

PromoterScan，啟動子區(qū)預(yù)測工具，其預(yù)測基于比較所提交的序列與真核生物

RNA

聚合酶

II

啟動子序列同源性。/molbio/proscan/5、TESS,

Transcription

Element

Search

System

是一款預(yù)測啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的工具，通過所提交的序列與

TRANSFAC,

JASPAR,

IMD,

CBIL-GibbsMat

數(shù)據(jù)庫相比對，獲得啟動子上可能存在結(jié)合位點。/cgi-bin/tess/tess?RQ=SEA-FR-Query

第二十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日推薦：

丹麥技術(shù)大學(xué)的生物序列分析中心http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/第二十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日啟動子預(yù)測是一個復(fù)雜的，十分有技術(shù)含量的工作，需要大量的推斷和演算，還需要用實驗去驗證。因此對于啟動子的預(yù)測，一個、兩個軟件或者算法都是不全面的，需要綜合去考慮。另一個很好用的啟動子預(yù)測網(wǎng)站/seq_tools/promoter.html利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測真核及原核生物啟動子第二十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日例：Humanobeseprotein(ob)geneU43589第二十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日對于分析的結(jié)果要結(jié)合起始密碼子前的非編碼區(qū)序列進(jìn)行綜合分析，啟動子區(qū)存在CAAGbox，TATAbox，-10，-35等特征區(qū)第二十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日PromoterpredictionpracticalexerciseRegulationofHumanobeseproteingenePracticalexerciseEnriqueBlanco-eblanco@imim.esAbstract:Inthisexercise,thepreviouslyannotatedpromoterregionoftheLeptingene（瘦素，obeseproteingene（肥胖基因）)willbeusedtotestdifferentmethodsforpredictingregulatoryelements.Firstofall,amatrixwillbeconstructedfromarealcollectionofsites.Secondly,theTRANSFACdatabasewillbeaccessedtoextractrealmatricesandthen,thepromotersequencewillbescannedsearchingforpromotermotifs.Finally,duetothenumberoffalsepositivesthatwillbeobtained,aphylogeneticapproach（系統(tǒng)發(fā)育樹）willbesuggested.Bothhumanandmousehomologueswillbealignedtoelucidate（解釋）thecoordinatesoftheactualbindingsites.

自學(xué)，不做要求第二十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日A.DescriptionofthegeneStep1.Retrieve（檢索）theannotationandthesequenceofthegene(EMBLdatabase)

GotoEMBLdatabaseatEBI

mRNAsequence:TypeU43653inNucleotidesequences

Ontop,clickovertheEMBL:HS436531entryHavealookatthedescription:IDs,references,attributes,sequencesSearchtheFeatureofCodingSequence(FTCDS).ClickoverandchecktheORFcorrectness:thebeginningandtheendofthesequencecorrespondrespectivelytotheStartandStopcodons?Accession：U43653/nuccore/1226243?report=fasta第三十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Step2.LearnmoreabouttheLeptingeneUsingagenomebrowserGobacktotheinitialscreenthatcontainedtheresultofyourfirstquery.Ontheleft,youwillfindtheDisplayOptionsbox.SelecttheFastaSeqsviewandpressthebuttonApplyDisplayOptions

OpentheUCSCgenomebrowser

SelectthealignmentprogramBlat(humangenome)PastetheFastasequenceoftheLeptingeneandsubmitthequeryBrowsethefirsthitinthelistofmatches

第三十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Havealookatthedifferentdisplayingoptions.Werecommendtozoomout10xtheinitialpicturetoexplorethegenomiclandscapearoundthegene.Forinstance,tryto:obtaintheRefSeqgenesequence

checkthepresenceofaCpGislandinthepromoterexaminethemRNAssupportingthegeneannotationevaluatetheconservationbetweenorthologues（同源）RefSeqgenesequenceCpGislandmRNAs第三十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日ParameterControlit第三十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Task1:Whatdoyouhavetodoifyouwanttoseethecomputationallypredictedtranscriptionfactorbindingsites?

Task2:TrytolocatethesequenceinothergenomesusingBLAT(e.g.mouse)GotoLocusLinkdatabaseatNCBI

TypeU43653inQuery

ClickontheentryLEP(leptin)

Identifymainfieldsintheentry:functionaldescription,NMandNPannotationsevaluatetheconservation第三十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日CLICK第三十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Step3.PROMOTERinformation:sequenceandexperimentalannotation

Thistrackdescribesthelocationoftranscriptionstartsites(TSS)throughoutthehumangenomealongwithaconfidencemeasureforeachTSSbasedonexperimentalevidence.

第三十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日實際上，我們query的序列（U43653）是mRNA，不是DNA，因為mRNA是已經(jīng)轉(zhuǎn)錄并剪接過的序列，無法從mRNA上預(yù)測出啟動子區(qū)，要預(yù)測啟動子需要的是DNA（基因組或者染色體序列），前面的演示是希望通過mRNA序列定位到染色體上，從而找到真正的基因組DNA序列，為啟動子的預(yù)測提供基礎(chǔ)。點擊進(jìn)入details頁面第三十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日……………………DNAmRNA第三十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日定位啟動子區(qū)（TSS+TPBS）HumanChromosome7：127880000-127882000SCAN第三十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日第四十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日第四十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日>chr7:127880000-127882000TTATTGAGACAGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGTAGTGCAATGGTCTGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCACTTCCCAGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCTCAAGTAGCTGGGATTACAGACACTCACCACCACACCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGAGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAAATCCTGACCTCAGGTGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCTTGAGCTACCACGCCTGGCTGGGTTGGTTCTCAATGGAGTGGTTTGTTTTTGGAGCTGCTCTGCGCAGTGGGGACCAGAATAGGCCTGGGTTCCTAGCCCATTGCTATTCCTTACCAGCTGTGGATTCTAAGGAAAGTCATTTAACCTCGCTGGACCTTAGATTCCTCATCCCTGAAGCCCAAGGGTAAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAAACCAACCCATCATGTAAAGCGGGGAACTACAAACGATACAGGTGAAACATGCCTACCACACCACTCACAGGCTATGATGACAAAAACGTGGCTACATCTGGGACCACCCCCCAACCCCCACTTTGTACGTAGGAAATACGGAGTTGAGGATGGAGACCCACAGTATGTCCAGAGTGTCCCCAAAGGCCACAGTGCCCGCCTGGAGCCCTCCAGAGAGCGTGCACTCCCTGGGGTGCCAGCCAGAGACAACTTGCCCTGAGGCTTGGAACTCGATTCTCCGCGTGCCAGAGAAGGGGTGGGACTTCAGAACCCCCAACCCCGCAATCTGGGTCGGGGAGCCTGGCGCACTGCGGGCCGCTCCCTCTAACCCTGGGCTTCCCTGGCGTCCAGGGCCGTCGGGGCCGAGTCCCGATTCGCTCCCACCCCGAAGCCGCGCCAGGACCAACGAGGGCGCAGCCGTATGCCCCAGCCCGCTCCGCGGAGCCCCTCACAGCCACCCCCgCCCCGACCGCGCCCCGCGCGGCTCGAAGCACCTTCCCAAGGGGCTGGTCCTTGCGCCATAGTCGCGCCGGAGCCTCTGGAGGGACATCAAGGATTTCTCGCTCCTACCAGCCACCCCCAAATTTTTGGGAGGTACCCAAGGGTGCGCGCGTGGCTCCTGGCGCGCCGAGGCCCTCCCTCGAGGCCCCGCGAGGTGCACACTGCGGGCCCAGGGCTAGCAGCCGCCCGGCACGTCGCTACCCTGAGGGGCGGGGCGGGAGCTGGCGCTAGAAATGCGCCGGGGCCTGCGGGGCAGTTGCGCAAGTTGTGATCGGGCCGCTATAAGAGGGGCGGGCAGGCATGGAGCCCCGTAgGAATCGCAGCGCCAGCGGTTGCAAGGTAAGGCCCCGGCGCGCTCCTTCCTCCTTCTCTGCTGGTCTTTCTTGGCAGGCCACAGGGCCCCACACAACTCTGGATCCCGGGGAAACTGAGTCAGGAGGGATGCAGGGCGGATGGCTTAGTTCTGGACTATGATAGCTTTGTACCGAGTTCTAGCCAGATAGAAGGTTACCGGGAGCTGGGGAGCGTTGGATTTGCTGCTGGGCTGTGCCGGTGCCCAGAAGGCAGGACCTTGCAGAACCAGCCAGGTCCCTGGGAGACTGTCAGACCCACCAACCTGGTGGCATTCGCAGAGCTGAGATGCATTGGAAATTGCCTTGGGCACATCCCCAAAGATCAGGATGTCCCACCCCAGTCTGAAGGAGATAAAGTTGGGGGTAGGAGAGACGCAGATGCAAGTGATCAGTCTCAGTCCCAGACATTGCCTTGCTCTGCGGGTAGGAATTCAGGATTCATTTTCCAGGGAAGTTCCTGACCTCTGAATGAGAGGGGCTGTGTAAGGCCAATGCCTGGGAGGAAGGCAAGGATGAGTAGAGGTGGGGGGAAACAAGTGTCAGGAAGACTCAAAATCTTCCAGAGAAATTGTGCAGGGTCTTACCAGATCTGTCCTCAAAGCCATGCAAATTGCCTTCTTTGCAATG

>gb|U43589.1|HSU43589:1922-2922Humanobeseprotein(ob)gene,partialpromotersequence

/seq_tools/promoter.html第四十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日>chr7:127880000-127882000TTATTGAGACAGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGTAGTGCAATGGTCTGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCACTTCCCAGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCTCAAGTAGCTGGGATTACAGACACTCACCACCACACCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGAGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAAATCCTGACCTCAGGTGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCTTGAGCTACCACGCCTGGCTGGGTTGGTTCTCAATGGAGTGGTTTGTTTTTGGAGCTGCTCTGCGCAGTGGGGACCAGAATAGGCCTGGGTTCCTAGCCCATTGCTATTCCTTACCAGCTGTGGATTCTAAGGAAAGTCATTTAACCTCGCTGGACCTTAGATTCCTCATCCCTGAAGCCCAAGGGTAAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAAACCAACCCATCATGTAAAGCGGGGAACTACAAACGATACAGGTGAAACATGCCTACCACACCACTCACAGGCTATGATGACAAAAACGTGGCTACATCTGGGACCACCCCCCAACCCCCACTTTGTACGTAGGAAATACGGAGTTGAGGATGGAGACCCACAGTATGTCCAGAGTGTCCCCAAAGGCCACAGTGCCCGCCTGGAGCCCTCCAGAGAGCGTGCACTCCCTGGGGTGCCAGCCAGAGACAACTTGCCCTGAGGCTTGGAACTCGATTCTCCGCGTGCCAGAGAAGGGGTGGGACTTCAGAACCCCCAACCCCGCAATCTGGGTCGGGGAGCCTGGCGCACTGCGGGCCGCTCCCTCTAACCCTGGGCTTCCCTGGCGTCCAGGGCCGTCGGGGCCGAGTCCCGATTCGCTCCCACCCCGAAGCCGCGCCAGGACCAACGAGGGCGCAGCCGTATGCCCCAGCCCGCTCCGCGGAGCCCCTCACAGCCACCCCCgCCCCGACCGCGCCCCGCGCGGCTCGAAGCACCTTCCCAAGGGGCTGGTCCTTGCGCCATAGTCGCGCCGGAGCCTCTGGAGGGACATCAAGGATTTCTCGCTCCTACCAGCCACCCCCAAATTTTTGGGAGGTACCCAAGGGTGCGCGCGTGGCTCCTGGCGCGCCGAGGCCCTCCCTCGAGGCCCCGCGAGGTGCACACTGCGGGCCCAGGGCTAGCAGCCGCCCGGCACGTCGCTACCCTGAGGGGCGGGGCGGGAGCTGGCGCTAGAAATGCGCCGGGGCCTGCGGGGCAGTTGCGCAAGTTGTGATCGGGCCGCTATAAGAGGGGCGGGCAGGCATGGAGCCCCGTAgGAATCGCAGCGCCAGCGGTTGCAAGGTAAGGCCCCGGCGCGCTCCTTCCTCCTTCTCTGCTGGTCTTTCTTGGCAGGCCACAGGGCCCCACACAACTCTGGATCCCGGGGAAACTGAGTCAGGAGGGATGCAGGGCGGATGGCTTAGTTCTGGACTATGATAGCTTTGTACCGAGTTCTAGCCAGATAGAAGGTTACCGGGAGCTGGGGAGCGTTGGATTTGCTGCTGGGCTGTGCCGGTGCCCAGAAGGCAGGACCTTGCAGAACCAGCCAGGTCCCTGGGAGACTGTCAGACCCACCAACCTGGTGGCATTCGCAGAGCTGAGATGCATTGGAAATTGCCTTGGGCACATCCCCAAAGATCAGGATGTCCCACCCCAGTCTGAAGGAGATAAAGTTGGGGGTAGGAGAGACGCAGATGCAAGTGATCAGTCTCAGTCCCAGACATTGCCTTGCTCTGCGGGTAGGAATTCAGGATTCATTTTCCAGGGAAGTTCCTGACCTCTGAATGAGAGGGGCTGTGTAAGGCCAATGCCTGGGAGGAAGGCAAGGATGAGTAGAGGTGGGGGGAAACAAGTGTCAGGAAGACTCAAAATCTTCCAGAGAAATTGTGCAGGGTCTTACCAGATCTGTCCTCAAAGCCATGCAAATTGCCTTCTTTGCAATG

第四十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日B.BuildingrepresentationsofbindingsitesStep4.AccessingTransfacdatabaseGotoTRANSFACdatabase

Note:TRANSFACisfreeforusersfromnon-profitorganizationsbutrequiresaregistrationInTRANSFAC6.0:chooseSearchactionSelectthetableofFactor

EnterthefactornameTBP(tatabindingprotein)SetFactorName(FA)assearchingfieldandsubmitthequerySelect(T00794):youwillfindadescriptionofthefactorinhuman(Ontheleft)Findthesefields:(BS)forbindingsites,(MX)formatricesSelectoneofthesitesforinspectionB-E,requirearegistration.第四十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Step5.BuildingamodelfromasetofactualsitesThisisacollectionofrealTBPsitesextractedfromTRANSFAC.ObservethedifferentcharacteristicsandtheconservationofthecoreOpentheCLUSTALWwebserveratEBIPastethecollectionof23TBPsitesSwitchontheboxes:ALIGNMENT=fastCOLORALIGNMENT=yesOUTPUTFORMAT=alnwo/numbersPresstheRunbuttonOpentheWebLogowebserver

PastetheCLUSTALalignmentintothecorrespondingboxActivateDNA/RNAintheSequencetypeboxSubmitthequery(Createlogo)toobtainarepresentationforthecollectionofTBPsitesasthefollowing.Noticethehighligthedcoreofthebindingsite(TATAAAA)第四十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Figure2.Graphicalrepresentationofthealignmentof23realTATAbindingsitesStep6.ObtainingtheTRANSFACpositionweightmatricesGotoTRANSFACdatabase

InTRANSFAC6.0:chooseSearchactionSelectthetableofMatrix

EnterthefactornameTATA

SetFactorName(FA)assearchingfieldandsubmitthequeryTherearetwoentries:M00252andM00216SelectM00252matrixRepeattheproceduretorecovertheSP1(M00008)andc/EBP(M00159)matricesConservethewindowscontainingthethreematricesAlternativesolution:

PROMOisadatabaseofpre-computedmatricesthatallowsyoutoselectthespeciesorgroupofspeciesfromwhichanewweightmatrixwillbeconstructedforagivenfactor,usingTRANSFACbindingsites.第四十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日C.Computationalpredictionofregulatoryelements(bindingsites)Step7.SearchingfortheannotatedregulatoryelementswithcurrentmatricesOpenRSAtoolswebserver

Ontheleftframe,clickonPatternmatching-patser(matrices)

PastetheHumanobeseproteingenepromoter(1000bps)SelecttransfacasMatrixFormatandpastetheTransfacTATAmatrix(includingmatrixheader)SetOrigintostart(ofthesequence)andpressGO

Checktheresults:oneofthesetwoputativeTATAsitesistherealone(usetheannotations)Toobtainagraphicalrepresentationofpredictions,pressfeaturemap

SetasDisplaylimitsfrom0to1000andpressGO

RepeattheprocedureusingtheSP1andcEBPmatrices,tryingtofindtherealsitesintothepredictions.Noticetheamountoffalsepositivespredictedonlyusingonematrix第四十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Step8.AbinitiopromoterpredictionGotoTRANSFACapplications

ChoosetheprogramMatchtoscanpromotersequencessearchingforsitesusingthecompletelibraryofTRANSFACmatricesPastetheHumanobeseproteingenepromoterinthetextareaSetcut-offs:0.75(matrixsimilarity)and0.85(coresimilarity)

SubmitthequeryFindtherealannotations(e.g.TBPandCEBP)inthistextoutput.NoticethehugenumberoffalsepositivepredictionsFigure3.GraphicalrepresentationofpredictedbindingsitesusingMATCH+TRANSFACinthepromotersequenceU43589(allofthepredictionsarenotshown)第四十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日D.Comparativepromoterprediction(human/mouse)Step9.Human-MousecomparisonsWehaveobtainedthehomologousgenepromoter(FASTA,1000bpsupstreamtheTSS)inmouse[Entry:U36238]

Now,thesearetheannotations(promoterelements)inbothsequences(humanandmouse)Thisisagraphicalcomparisonofbothpromoterannotations.ObservethephylogeneticfootprintingorconservationintheregulatoryelementsStep10.Locatingshortconservedregulatoryelements

ConnecttoBlast2Sequenceswebserver

Pastebothsequences[humanpromoterandmousepromoter]inthecorrespondingtextboxesTodetectshortconservedstretchesofDNA,setthefollowingparameters:Mismatch=-5Gapextension=0NoticethatsomeshortverywellconservedHSPs(blastfragments)attheendofthesequence.Checktheannotationstoverifywhethertheycorrespondtorealbindingsitesornot第四十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Now,abinitiopromoterpredictionserchescanbeperformedagainbutonlyonthoseinterestingregions,usingRSAtoolsorTRANSFACWhenmorethan2genomesareavailable,amultiplelocalalignmentcanbeperformedwithprogramssuchasMEMEorAlignaceFigure5.GraphicalcomparisonofblastnalignmentofhumanpromoterU43589anditshomologueU36238inmouse第五十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日E.ResultsHereyoucanfindthesolutionstoeveryexercise:Geneannotation:EMBLrecordGeneannotation:EMBLrecord(plaintext)FASTAsequenceoftheentryU43653Geneannotation:LocuslinkPromoterannotation:PubMedrecordPromoterannotation:NCBIentryU43589TBPsiteMultiplealignmentofTBPsTBPsequencelogoTATAboxmatrixSP1matrixcEBPmatrixPutativeTATAboxes(text)PutativeSP1sites(text)PutativecEBPsites(text)PutativeTATAboxes(plot)PutativeSP1sites(plot)PutativecEBPsites(plot)Match-TRANSFACpredictionPromoterannotation:NCBIentryU36238(mouse)Blast2seqalignment第五十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日六、CpG島分析CpG島(CpGisland)：CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CpG島主要位于基因啟動子（promotor）和第一外顯子區(qū)域，約有60%以上基因的啟動子含有CpG島。許多基因的啟動子（promotor）或“起始”區(qū)域周圍都含有CpG島，CpG島的C容易被甲基化形成T，從而經(jīng)常被抑制。啟動子區(qū)的高甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是人類腫瘤所具有的共同特征之一，而且這種高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的又一個機制。第五十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日CpG_MI:IdentifyingFunctionalCpGIslandusingMutualInformation8/cpgmi/TATAATATAATATATGACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGATATATATATATATTATATATTTTTATACATTATATATATAAACTATATAACAATATAACATATTATGTGTATAATATATATTACATATAGTATAAAATATATTATATTATATTATATTATATTATATTATATTATATTAGACTGTATTACTAACAAAATTATAAACAGAAACCCCAGCAAAAATATCCTATGTATATTTGAAATTTTAGGTCAAAAATAAAATAATTTAATGTGCAGCAATTAA第五十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日CpGIsland分析CpGIsland/cpgislands2/cpg.aspxWebCpGfinder/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoterWebCpGPlot/CpGReport/Isochorehttp://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.htmlWeb生物軟件網(wǎng)/國產(chǎn)軟件第五十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日七、外顯子和內(nèi)含子分析外顯子：結(jié)構(gòu)基因中編碼蛋白質(zhì)的序列稱為外顯子。內(nèi)含子：結(jié)構(gòu)基因中不編碼蛋白質(zhì)的序列稱為內(nèi)含子。外顯子和內(nèi)含子存在于真核生物中，原核生物多以間隔序列出現(xiàn)。外顯子和內(nèi)含子的角色可以相互轉(zhuǎn)化。Exon1Exon3IIIIExon25`UTR3`UTRSplicingExon1Exon3Exon2Exon1Exon3Exon2Exon1Exon2Exon3Exon2Exon1Exon3第五十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日原理：外顯子和內(nèi)含子的預(yù)測是基于RNA的剪切原理進(jìn)行的。RNAsplice的保守序列是“GU-----AG”，即內(nèi)含子的5`端是GU，3`端是AG。當(dāng)然其附近的序列也是有規(guī)律的，但沒那么保守。第五十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日方法：1、Augustus：功能強大(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)，需要Linux操作系統(tǒng)，并且要下載安裝。2、SplicePort：功能較全面（/）3、GeneSplicer：針對Plasmodiumfalciparum、A.thaliana、human、Drosophila、andrice4、NetGene2只針對human、C.elegans、A.thaliana5、MaxEntScan：只針對human第五十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日第五十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日剪接連接點（splicingjunctions)是指在切斷和重接位點處的兩旁的順序。在內(nèi)含子左側(cè)的連接點稱為供體（donor)。在內(nèi)含子右側(cè)的稱為受體（acceptor)。第五十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Genescan工具/GENSCAN.html結(jié)果返回到郵箱（可選）提交序列提交序列文件運行GENSCAN選擇物種顯示氨基酸或CDS序列序列名稱（可選）是否顯示非最優(yōu)外顯子第六十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日基因、外顯子及類型正鏈、負(fù)鏈預(yù)測單元起始、終止及長度相位編碼區(qū)打分值可信概率、得分值GENSCAN輸出結(jié)果：文本第六十一頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日GENSCAN輸出結(jié)果：圖形exon1exon5exon4exon3exon2第六十二頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日提交待分析序列提交同源蛋白質(zhì)序列運行GenomeScanGenomescan工具/genomescan.html第六十三頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日GenomeScan輸出結(jié)果：文本預(yù)測外顯子位置、可信度等信息同源比對信息預(yù)測結(jié)果氨基酸序列第六十四頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日GenomeScan輸出結(jié)果：圖形第六十五頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日外顯子、內(nèi)含子剪切位點識別：NetGene2http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/提交序列選擇物種第六十六頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日NetGene2輸出結(jié)果供體位點受體位點可信度第六十七頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日mRNA剪切位點識別：SpideyNCBI開發(fā)的在線預(yù)測程序用于mRNA序列同基因組序列比對分析第六十八頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日序列在線提交形式：界面中有兩個窗口：上方窗口用于輸入基因組序列（直接粘貼序列或用GenbankID/AC號）下方窗口用于輸入cDNA/mRNA序列（直接粘貼序列或用GenbankID/AC號）可同時輸入多條cDNA/mRNA序列與同一條基因組序列進(jìn)行分析Spidey序列提交頁面輸入基因組序列或序列數(shù)據(jù)庫號輸入mRNA.txt文檔中的6條序列判斷用于分析的序列間的差異，并調(diào)整比對參數(shù)不受默認(rèn)內(nèi)含子長度限制，默認(rèn)長度：內(nèi)部內(nèi)含子為35kb,末端內(nèi)含子為100kb比對閾值選擇物種輸出格式第六十九頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日Spidey輸出結(jié)果外顯子對應(yīng)于基因組上的起始/結(jié)束位置外顯子對應(yīng)于mRNA/cDNA上的起始/結(jié)束位置外顯子長度一致性百分比錯配和gap序列聯(lián)配結(jié)果外顯子序號第一條藍(lán)色序列為基因組序列，橘黃色為外顯子供體、受體位點第七十頁，共八十四頁，編輯于2023年，星期日分析mRNA/cDNA的外顯子組成GeneSeqer/cgi-bin/gs.cgiWeb/LinuxSpidey/spideyWebPROT_MAP/berry.phtml?topic=prot_map&group=programs&subgroup=xmapWebSim4http://gamay.univ