疾病產生的分子基礎

疾病產生的分子基礎1第一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一目錄一、基因結構、表達異常與疾病發(fā)生二、基因結構和表達與疾病的研究策略三、HGP與疾病相關基因的研究四、生物信息學主要研究領域2第二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一一、基因結構、表達異常與疾病人類疾病如白血病、惡性腫瘤、糖尿病、心腦血管、高血壓等的發(fā)生發(fā)展涉及到有關蛋白質及其復合物的結構、功能和相互作用的異常。

人體內蛋白質分子結構和功能的異常是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。第三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一一、基因結構、表達異常與疾病細胞微環(huán)境的變化，包括基因甲基化的變異以及各種特定基因表達的異常都和疾病發(fā)生有關。研究顯示基因表達的異常將導致各種疾病的發(fā)生，尤其是腫瘤形成。第四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一一、基因結構、表達異常與疾病基因或染色體片段，在精子或卵細胞形成過程中，會因某種結構修飾而不能表達，稱為基因印跡。

生物進化中形成的、有規(guī)律而又受控的基因失活是一種重要的調節(jié)方式。

基因印跡的異常會導致多種遺傳性疾病。第五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一6第六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一一、基因結構、表達異常與疾病發(fā)生（二）細胞間信號異常（三）細胞內因素（一）基因的結構改變第七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一基因結構示意圖8第八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一1.基因突變的多種類型

（1）點突變是單個堿基的改變（2）缺失是一個或多個核苷酸的丟失（3）插入是一個或多個核苷酸的增加（4）倒位是一段核苷酸序列方向倒轉（5）基因突變還分為配子突變與體細胞突變（6）動態(tài)突變指串聯重復拷貝數隨世代的傳遞而改變

（一）基因結構改變

定義：DNA一級結構發(fā)生改變，改變了基因結構。第九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一1.基因突變的類型

（1）點突變：在基因一級結構的某個位點上，一種堿基被另一種堿基取代；

轉換（transition）顛換（transversion）第十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一1.基因突變的類型

（2）缺失（delelation）是一個或多個核苷酸的丟失，一個或一段核苷酸序列丟失造成的基因結構改變；

（3）插入（insertion）；第十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一1.基因突變的類型

（4）倒位是一段核苷酸序列方向倒轉：基因內部的DNA序列重組，使一段DNA序列的方向倒轉；（5）配子突變與體細胞突變；（6）動態(tài)突變指串聯重復拷

貝數隨世代的傳遞而改變。第十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一

2.基因突變引起的遺傳效應a.同義突變(consensemutation)b.錯義突變(missensemutation)c.無義突變(nonsensemutation)d.終止密碼子突變或延長突變e.起始密碼子突變(initiationcodonmutation)f.非編碼序列點突變(pointmutationinnoncodingsequence)第十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一同義突變、錯義突變、無義突變、延長突變、起始密碼子突變、非編碼序列點突變14第十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一3.基因突變影響不均一核RNA(hnRNA)的剪接基因突變發(fā)生在hnRNA一級結構特定的剪接位點上，導致hnRNA的剪接錯誤，產生異常的mRNA，產生異常的蛋白產物，改變生物性狀。第十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一血紅蛋白結構血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個α和兩個β鏈）組成的。每條肽鏈都類似于肌紅蛋白的肽鏈，都結合一個血紅素。4.結構基因改變導致蛋白質變化引起疾病血紅蛋白分子一級結構上的輕微差別；正常成年人血紅蛋白中的β鏈的第六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就會導致鐮刀形細胞貧血病的異常血紅蛋白HbS的生成。第十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一血紅蛋白病——鐮刀形細胞貧血癥第十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一第十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一血紅蛋白病類型異常血紅蛋白：珠蛋白結構(質)變異，導致貧血。

地中海貧血：珠蛋白合成(量)減少，又稱珠蛋白合成障礙性貧血。

第十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一基因突變類型異常Hb氨基酸變化臨床特征

錯義突變

HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不穩(wěn)定Hb病

HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)鐮刀型細胞貧血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA)不穩(wěn)定Hb病

無義突變

HbMckeesRocksβ145Tyr→終止(UAU→UAA)不穩(wěn)定Hb病

終止密碼突變

HbConstantSpringα142UAA→CAAα-地貧(延長：142Gln173UAA)

密碼子缺失

HbGunHillβ91～95缺失不穩(wěn)定Hb病

密碼子插入

HbGradyα118與119間插入3個氨基酸無明顯癥狀

移碼突變

HbTakβ147UAA→ACUAA不穩(wěn)定Hb病

158UAA(Thr)第二十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一

5.常見單基因?。杭膊∶Q發(fā)病頻率(‰)遺傳方式致病基因典型癥狀血友病A0.1X連鎖凝血因子Ⅷ不規(guī)則出血血友病B0.03X連鎖凝血因子Ⅸ不規(guī)則出血杜氏肌營養(yǎng)不良0.3X連鎖肌營養(yǎng)因子肌萎縮貝氏肌營養(yǎng)不良0.05X連鎖肌營養(yǎng)因子肌萎縮脆性X綜合征0.5X連鎖FMR1智力障礙舞蹈病0.5常染色體顯性舞蹈病因子癡呆神經纖維0.4常染色體顯性NF-1,2癌變珠蛋白生成障礙性貧血0.05常染色體隱性珠蛋白基因簇貧血鐮刀細胞貧血0.1常染色體隱性β珠蛋白基因貧血,局部缺血苯丙酮酸尿0.1常染色體隱性苯丙氨酸羥基化酶無苯丙酮酸代謝能力囊性纖維化0.4常染色體隱性CFTR進行性肺損傷及其他

第二十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一囊性纖維化病第二十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一囊性纖維化病

囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)蛋白(CFTCR)的基因突變所致，產生缺陷型蛋白，致使氯離子的轉運障礙，黏液在呼吸道黏膜內淤滯，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反復感染，導致患者呼吸衰竭而死亡。第二十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一GenetherapyofCF

將重組CFTCR基因cDNA-病毒載體，用涂布鼻腔、或噴霧吸入氣管及肺部等方法，轉入患者呼吸道上皮細胞中，獲得正常CFTCR基因的表達，糾正Cl＋轉運缺陷，減少黏液分泌。第二十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（二）細胞間信號異常

導致基因表達變化引起疾病人體各細胞間通過激素、神經遞質、旁分泌信號等保持細胞間的聯系，調節(jié)彼此的代謝?；虮磉_也受到細胞間信號的調控。甲胎蛋白（AFP）接受異常的細胞增殖信號成為肝癌發(fā)生的重要因素。第二十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（三）細胞內因素導致基因表達異常引起疾病第二十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一二、基因結構和表達與疾病的研究策略1．通過結構分析確定基因變異PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接測序法、TaqMan探針法SNP分型、SNaPshot分型法、MassArray分型法2．基因表達水平分析差異顯示、基因表達芯片、RNA-seq分析3．通過功能學研究確定致病基因轉基因技術、基因敲除、RNAi技術、基因誘導超表達第二十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一1．通過結構分析確定基因變異PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接測序法、TaqMan探針法SNP分型、SNaPshot法、MassArray法28第二十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（1）單鏈構象多態(tài)性

(PCR-SSCP)PCR產物變性后，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動速率，單個堿基的差別，就可以產生立體構象的不同，造成泳動速率的不同，產生不同的泳動帶。29第二十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一PCR產物用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在瓊脂糖凝膠電泳上分辨。不同等位基因經切割后產生不同長度的DNA片段條帶。（2）限制性片段長度多態(tài)性

(PCR-RFLP)30第三十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一RFLPRestrictionFragmentLengthPolyhmorphism第三十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（3）直接測序法Sanger法雙脫氧核苷酸，ddNTP及熒光標記的四個堿基，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，獲得DNA堿基序列。32第三十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一33第三十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（4）TaqMan探針法SNP分型針對染色體上的不同SNP位點分別設計PCR引物和TaqMan探針，進行實時熒光PCR擴增。探針的5’-端和3’-端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。存在PCR產物時，產生適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點分析。34第三十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（5）

SNaPshot法測序酶、四種熒光標記ddNTP、5’-端不同長度延伸引物和PCR產物模板，引物延伸一個堿基即終止，經檢測后，根據峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。通常用于10-30個SNP位點分析35第三十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一(6)MassArray法MassEXTEND單堿基延伸反應，緊挨SNP位點設計一段探針，在反應體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點處延伸一個堿基即終止。根據SNP位點的不同，探針將結合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質譜儀即可檢測出這種分子量差異，從而實現SNP分型的目的。36第三十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一2．基因表達水平分析

差異顯示、基因表達芯片、RNA-seq分析37第三十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（1）差異顯示技術(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)在不同的生長時期、在個體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對疾病的反應以及不同的環(huán)境下調控基因的表達是不同的，這就是基因的差別表達（differentialexpression）。第三十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一原理：利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴設計。根據mRNA結構分析知道，polyA尾巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：根據這12種排列組合，設計12種不同的引物。這些引物由11~12個T及兩個其它的堿基組成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。第三十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一5’端引物：5’端為10個堿基（10-mer）組成的隨機引物。每一個隨機引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點也可能在mRNA的不同位點上。用3’錨定引物和5’隨機引物進行擴增，可獲得50~100條100~500bp的DNA擴增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5’隨機引物。第四十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一第四十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（2）表達芯片基因表達譜芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探針，固化在芯片上；將待測樣品（處理組）與對照樣品的mRNA以兩種不同的熒光分子進行標記，然后同時與芯片進行雜交，通過分析兩種樣品與探針雜交的熒光強度的比值，來檢測基因表達水平的變化。42第四十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一43第四十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一44第四十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一(3)RNA-SeqRNA-seq即轉錄組測序技術，就是把mRNA,

smallRNA,

andNONcodingRNA等或者其中一些用高通量測序技術把它們的序列測出來，分析它們的表達水平。45第四十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一3．通過功能學研究確定致病基因

轉基因技術、基因敲除、RNAi技術、基因誘導超表達46第四十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（1）轉基因技術

指在生物基因組中帶有插入或整合入的外源基因，生物個體能將它傳給后代，并表達出該基因的生物活性物質，從而使受體生物獲得新的性狀。第四十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一①顯微注射法：在顯微鏡下，直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。48第四十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一②反轉錄病毒轉染法：把含有重組的逆轉錄病毒載體病毒顆粒去感染卵裂期胚胎，于是攜帶外源基因的逆轉錄DNA可以在感染過程中，整合到宿主細胞的染色體上。49第四十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一③體細胞核移植，把體細胞核移入去核卵母細胞中，使其發(fā)生再程序化并發(fā)育為新的胚胎，這個胚胎最終發(fā)育為動物個體。也叫克隆動物。50第五十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一（2）基因敲除技術定義：通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。①應用DNA同源重組原理進行基因敲除。②利用隨機插入突變進行基因敲除③RNA干擾也可以引起基因敲除第五十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一①利用基因同源重組進行基因敲除同源重組(homologousrecombination)，又稱基因重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。52第五十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一②利用隨機插入突變進行基因敲除——基因捕獲法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞。第五十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一③WhatisRNAi?RNA干擾（RNAinterference，RNAi）內源性或外源性雙鏈RNA介導的細胞內mRNA發(fā)生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表型的缺失現象。第五十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一轉錄后基因表達抑制現象的發(fā)現＋CHSGene矮牽?；?Jorgensen,R,1990)第五十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一RNA干擾(RNAinterference,RNAi)RNAi是將一段雙鏈的RNA序列導入機體或細胞中,機體或細胞中與之有同源序列的基因表達將會受到抑制,甚至表達受到完全抑制第五十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期一基因敲除技術與諾貝爾獎三位在基因敲除技術方面進行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就的科學家分享了諾貝爾生理或醫(yī)學獎，他們是美國鹽湖城猶他州大學的MarieCapecchi教授、美國北卡羅來納州大學的Oliversmithies教授以及英國加蒂夫大學的MartinEvans教授