免疫組織化學及滅菌參數(F值和F0值)

免疫組織化學的基本知識1免疫組織化學的概念：

免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑

(熒光素、酶、金屬離子、同位素)

顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。

2免疫組化實驗所用的抗體有哪些？

免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。

3免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，細胞標本包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。

其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。

4石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？

石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。

常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01

mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

5免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

6抗體交叉反應的原因：

指抗體除與其相應的抗原發(fā)生特異性反應外還與其它抗原發(fā)生反應。產生的原因有以下幾個方面：

1.

抗原特異性指用于免疫動物的抗原性物質中含有多種抗原分子，它引起動物產生針對多種抗原分子特異性的相應抗體。任何其它物質只要含有一種或多種與上述物質相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應。

2.

共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。

3.

決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結構大致相同，由于空間構象關系，某一決定簇的相應抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應。當然抗原一抗體之間構象相似時的結合力小于吻合時的結合力。

免疫細胞化學技術

一、免疫細胞化學技術的概述

*免疫細胞化學(immunocytochemistry,

ICC)

-是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑

(熒光素、酶、金屬離子、同位素)

顯色來確定細胞內抗原的成分(主要是多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為～。

(一)

對抗原和抗體的要求

*具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。

-對抗體的要求：純度高、比活性強；

*高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。

-對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩(wěn)定無變化。

(二)

抗原

(antigen,

Ag)

*抗原的概念：凡是在機體內引起體液免疫和(或)細胞免疫反應的物質，稱為抗原?？乖哂袃蓚€方面的特性：

-免疫原性：引起機體產生抗體和(或)致敏淋細胞的特性；

-免疫反應性：抗原能與相應的抗體及致敏淋巴細胞發(fā)生特異的結合或反應的特性。

*根據抗原是否顯示免疫原性分為：

-完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復雜的化學組成。

*免疫原性最強的是蛋白質抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質及多糖形成復合物才具有良好的免疫原性。

-半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。

*半抗原必需與載體結合，才能獲得免疫原性。

載

體

*通常是具有高度免疫原性的大分子物質，具有將免疫原性傳遞給耦聯的半抗原能力。

-常用的載體有鑰孔血藍蛋白(keyhole

limpet

hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine

serum

albumin,

BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。

-用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗原結合到載體上。結合比例為5kDa結合5～25個分子的小肽。

（三）抗體

(antibody,

Ab)

1、抗體的概念：

*機體受到抗原刺激后，由漿細胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結合的球蛋白，被稱為抗體。

-抗體主要存在于血清內；

-抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。

-免疫球蛋白根據重鏈的結構及抗原特異性不同分為五種，既IgG、

IgD、IgE、

IgA、IgM。

2、免疫組化實驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。

*單克隆抗體：是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備的。

-特異性強、抗體產量高。

*多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。

-特異性低，會產生抗體的交叉反應。

-多克隆抗體廣泛應用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。

-抗原與抗體的結合，要求量保持一定比例，當抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。

3、抗體的制備——多克隆抗體的制備

*動物的選擇

*佐劑(adjuvant)

*免疫方法

*免疫劑量

*抗體效價的測定

*放血或定期抽血

免疫組化常見問題及解決方法當免疫組化染色沒有出現預期結果時，應系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。

對照/標本無染色

①

確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②

確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。

③

對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④

檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。

⑤

檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現在大多數試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。

⑥

檢查標本的儲存條件，最好用已知陽性的標本來同時做陽性對照。

⑦

檢查色原/底物溶液，最簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效。

⑧

檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。

⑨

檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。

弱陽性

如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應考慮：

①

標本的固定方式，不當的固定方式或固定時溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數量和質量。

②

不適當的抗原修復方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。

③

抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。

④

切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。

⑤

孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。

如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。

非特異性染色

①

是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是，并不是每一種組織均需要進行此步驟，但對于內源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為：

滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

飽和處理內源性生物素：消除內源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內源性生物素，使之不再有剩余的結合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。

②

是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關蛋白，如牛血清白蛋白也常應用。另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要。最近有些國內的實驗室應用5%脫脂奶粉替代血清進行抗原封閉，效果也不錯。

③

所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。

④

一抗的使用濃度是否過高。

⑤

清洗是否充分。應嚴格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l

Tris—HCl，0.15mol/l

NaCl已適用于多數染色方法，溶液內加入吐溫20，效果更佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。

⑥

DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間和配制方式可以產生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實驗結果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現用現配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。

⑦

標本染色過程中是否曾經干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。

⑧

檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應。

抗體的保存

抗體儲存容器應由不吸附蛋白質的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100Mg/L），就應另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。

絕大多數已稀釋的抗體應存在4℃-8℃條件下，以免凍融對抗體蛋白產生有害效應。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應保存于-20℃條件下，并避免反復凍融。冷凍的抗體溶液應置于室溫中緩慢地解凍，應絕對避免用高溫快速解凍。

被細菌污染的抗體常會出現假陽性結果，應將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。

保存稀釋后的單抗應加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數稀釋抗體可進行冷凍保存，少數抗體可能會丟失抗原活性。大多數單抗，只要蛋白濃度適當，可在4℃下保存數月。石蠟切片免疫組化染色步驟載玻片的處理：

抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001

APES、ZLI-9003

HistogripTM或ZLI-9005

Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：

1.1

APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。

1.2

HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。

1.3

Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。

2、常用酶消化：

2.1

胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。

2.2

胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen

IV（IV型膠原）等。

2.3

g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。m皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10

3、抗原熱修復：

可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復?？乖瓱嵝迯涂蛇x用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064

±枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0

0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。

3.1

石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

3.2

石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

3.3

石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

4、免疫組化染色步驟：

（以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）

1）石蠟切片脫蠟至水。

2)3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。

3)

蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，(如需采用抗原修復，可在此步后進行)。

4)

5~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。

5)PBS沖洗，5分鐘×3次。

6)滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。

7)PBS沖洗，5分鐘×3次。

8)滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。

9)

PBS沖洗，5分鐘×3次。

10)

顯色劑顯色（DAB或AEC）。

11)自來水充分沖洗，復染，封片。

冰凍切片免疫組化染色步驟

室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2免疫組化實驗過程中的要點和技巧1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。

有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。

Bouin

S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。

PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。

2．組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。

3．切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。

4．烤片：60℃

30分鐘或37℃

過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。

5．蠟塊及切片的保存：最好在4℃保存

6．脫片問題：

Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES

1：50

丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進行下一步。

7．滅活內源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。

8．暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉

10．抗體稀釋：應遵循“現用現配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用。

11．背景高：在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰

Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。

12．返藍：在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。

13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

14．在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。免疫組織化學方法及常見問題解答按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。免疫組化ABC法步驟1、4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.01MKPBS清洗5min×3后；2、加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30%過氧化氫）30min，以消除內源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3；3、加入配好的0.3%TritonX100（30%TritonX100+0.01MKPBS100ml）30min，以增加細胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4、加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+疊氮納0.08g）稀釋的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗體，0.01MKPBS洗5min×3；5、加入0.01MKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；6、加入ABC復合物之類的抗體，室溫孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸餾水迅速沖三次；7、加入顯色液，進行免疫組織化學顯色，時間一般不超過30min，可不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MKPBS終止反應；8、梯度酒精脫水之后，封片，拍照。免疫組化SP法步驟：SP（streptavidin-perosidase）法，即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法。一般的sp法步驟啊，具體如下：1、烤片，68℃，20分鐘，2、常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I20min?二甲苯II20min?100%酒精10min?100%酒精10min?95%酒精5min?80%酒精5min?70%酒精5min3、阻斷滅活內源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS沖洗3X5min；4、抗原修復：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。5、正常羊血清工作液封閉，37℃10min，傾去勿洗。6、滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗3X5min；7、滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗3×5min；8、DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。免疫組化方法中關鍵環(huán)節(jié)及其原理解述一、酶免疫組化的關鍵環(huán)節(jié)1、標本固定：固定的目的是①防止標本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③固定的標本易于保存。2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min，但當天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。4、抗原修復：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實驗室一般用微波修復中火6min*4次，效果不錯。注意微波修復后自然冷卻30min左右（只要你覺得修復液的溫度達室溫即可）。5、細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。在免疫組織化學（>10um厚切片）和免疫細胞化學中一般用TritonX-100作為細胞通透劑，在膜上打孔。6、滅活內源性過氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應結果容易收到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內源性POD一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右，而0。3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10~30min；用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現用現配，配好后4度避光保存。不過，現在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內源性生物素的干擾，推薦使用。7、血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫或37度10-30min。8、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間：一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。9、抗體稀釋液：其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。正因為這種原因，我一直用國產的專用抗體稀釋液，一段時間在更換新抗體稀釋液時實驗結果出現了陰性結果（提示可能一抗沒有結合），最后從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后，發(fā)現是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應不佳，終而出現假陰性結果。10、切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）11、DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗；DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。12、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用蘇木素復染（胞核染料）。注意蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘，胞漿蛋白可以適當時間長一點，而胞核蛋白則要短。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。13、封片：為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。二、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。2、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。具體條件還要摸索。5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。3、在什么情況下使用Triton-X100（1）TritonX-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學（>10um厚切片）和免疫細胞化學中一般用TritonX-100作為細胞通透劑，在膜上打孔。（2）其作用原理：TritonX-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。（3）TritonX-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。4、封閉血清的選擇原則是什么？（1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結果的假陽性！（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合，會造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。5、抗體孵育條件的比較？（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復溫？（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；（2）另一方面，使抗原抗體結合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現象。7、DAB顯色時間如何把握？（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。8、免疫組化結果如何分析？（1）陽性著色細胞計數法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用imagej進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分數相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。9、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。（2）修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復，我們一般用6min*4次，效果不錯。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？（1）縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。（2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。（3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；（4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；（5）縮短DAB孵育時間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等；（6）適當增加PBS沖洗次數和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；（7）防止標本染色過程中出現干片，這容易增強非特異性著色。13、蘇木素復染時間的把握？（1）蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。（3）如果分化的顏色過淺，可以復置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗方式選擇、次數和時間的選擇？（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。（5）常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。15、脫片產生的原因和如何防止脫片？（1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。（6）修復的問題：抗原修復的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。（7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。16、背景染色較深的原因有哪些？（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。（4）組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。（5）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4？C冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。17、蘇木素復染后氨水返藍這一步如何做、濃度多少、時間多長？答：返藍可以用堿性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度溫水、冷水藍化均可。一般藍化5~10min。淡氨水有人用50ml自來水+三四滴的氫氧化銨。滅菌參數（F值和F0值）D值：（考察對時間的關系）在一定溫度下，殺滅90%微生物所需的滅菌時間。殺滅微生物符合一級動力學方程，即有或式中，：滅菌時間為t時殘存的微生物數；：原有微生物數；k：滅菌常數D值隨微生物的種類、環(huán)境和滅菌溫度變化而異。Z值：（考察對溫度的敏感性）降低一個lgD值所需升高的溫度，即滅菌時間減少到原來的1/10所需升高的溫度或相同滅菌時間內，殺滅99%的微生物所需提高的溫度。即F值：在一定滅菌溫度（T）下給定的Z值所產生的滅菌效果與在參比溫度（T0）下給定的Z值所產生的滅菌效果相同時所相當的時間。常用于干熱滅菌F0值：在一定滅菌溫度（T）、Z值為10℃所產生的滅菌效果與121℃、Z值為10℃產生的滅菌效果相同時所相當的時間（min）。物理F0值數學表達式：F0=△t∑10T-121/Z生物F0值數學表達式：F0=D121℃×(lgN0-lgNt)為滅菌后預計達到的微生物殘存數，即染菌度概率。F0值F0值僅限于熱壓滅菌，生物F0值相當于121℃熱壓滅菌時，殺滅容器中全部微生物所需要的時間。F0值體現了滅菌溫度與時間對滅菌效果的統(tǒng)一，數值更為精確、實用。為了確保滅菌效果，應適當增加安全系數，一般增加理論值的50%。鍵詞：罐頭，殺菌，F值，D值，Z值一、實際殺菌F值指某一殺菌條件下的總的殺菌效果。通常是把不同溫度下的殺菌時間折算成121℃的殺菌時間，即相當于121℃的殺菌時間，用F實表示。特別注意：它不是指工人實際操作所花時間，它是一個理論上折算過的時間。為了幫助大家理解和記憶，請看下面的例題。例：蘑菇罐頭110℃殺菌10min，115℃殺菌20min，121℃殺菌30min。工人實際殺菌操作時間等于(或大于)60min，實際殺菌F值并不等于60min。F實=10×L1+20×L2+30×L3，L我們把它理解為不同溫度下的時間折算系數。L1肯定小于L2，二者均小于1。由于121℃就不存在折算問題，因此，L3就是1，F實肯定小于60min。由此可見，實際殺菌F值不是工廠殺菌過程的總時間之和。再例：蘑菇罐頭100℃殺菌90分鐘，120℃殺菌10分鐘，哪個殺菌強度大？折算成相當于121℃的殺菌時間，再比較！即：90×L100和10×L120比較，只要找到折算系數就好比較了。二、安全殺菌F值在某一恒定溫度（12l℃）下殺滅一定數量的微生物或者芽孢所需的加熱時間。它被作為判別某一殺菌條件合理性的標準值，也稱標準F值，用F安表示。F安表示滿足罐頭腐敗率要求所需的殺菌時間（121℃），例如，某罐頭F安=30min，通常表示罐頭要求在121℃殺菌30min。每種罐頭要求的標準殺菌時間（通常121℃為標準溫度），就象其它食品標準一樣，拿來作為參照，判斷是否合格、是否滿足要求。同時也是確定殺菌公式中恒溫時間τ2的主要依據。F實和F安的配合應用，F實等于或略大于F安，殺菌合理。F實小于F安，殺菌不足，未達到標準，要腐敗，必須延長殺菌時間。F實遠大于F安，殺菌過度，超標準殺菌，影響色香味形、營養(yǎng)價值，要求縮短殺菌時間。通過這種比較和反復的調整，就可找到合適的恒溫時間τ2。三、安全殺菌F值的計算A確定殺菌溫度t罐頭pH值大于4.6，一般采用121℃殺菌，極少數低于115℃殺菌。罐頭pH值小于4.6，一般100℃殺菌，極少數低于85℃殺菌。實踐中可用pH計檢測，根據經驗也可以粗略地估計，比如，甜橙汁是酸性，肉是偏中性。也可加檸檬酸適當降低某些罐頭pH值。B選擇對象菌腐敗的微生物頭目，殺菌的重點對象；耐熱性強、不易殺滅，罐頭中經常出現、危害最大。只要殺滅它，其它腐敗菌、致病菌、酶也被殺滅或失活。經過微生物檢測，選定了罐頭殺菌的對象菌，知道了罐頭食品中所污染的對象菌的菌數及對象菌的耐熱性參數D值，就可按下面微生物熱力致死速率曲線的公式計算安全殺菌F值。F安=D（lga-lgb）下面以121℃標準溫度講解，因為高溫殺菌情況更具代表性、人們更為關注。F安通常指t溫度（121℃）下標準殺菌時間、要求的殺菌時間。D值通常指t溫度（121℃）下殺滅90%的微生物所需殺菌時間，是微生物耐熱的特征參數，D值越大耐熱性越強，常在右下角標明具體試驗溫度。由微生物實驗獲取D值，常見的D值可查閱本教材或相關手冊。為了幫助同學們理解和記憶，請看例題。例：已知蘑菇罐頭對象菌D121=4min，欲在121℃下把對象菌殺滅99.9%，問需多長殺菌時間？如果使對象菌減少為原來的0.01%，問需多長殺菌時間？第一個D值，殺滅90%；第二個D值，殺滅9%（10%中的90%）；第三個D值，殺滅0.9%（1%中的90%）；第四個D值，殺滅0.09%（0.1%中的90%）。答案：12min，16mina每罐對象菌數/單位體積原始活菌數。b殘存活菌數/罐頭的允許腐敗率。當殘存活菌數小于1時，它與罐頭的腐敗率是相等的。殘存活菌數為1%，表示每個罐頭中有1%個活菌，這是不合乎邏輯的。但從概率的角度理解，100個罐頭中有1個罐頭存在一個活菌，要腐敗，即腐敗率就是1%。同理，殘存活菌數為1‰，從概率的角度理解，表示1000個罐頭中有1個罐頭存在一個活菌，要腐敗，即腐敗率就是1‰。F安的計算典型例子：某廠生產425g蘑菇罐