研究黃芪精中黃芪甲苷

研究黃芪精中黃芪甲苷含量測定的新方法發(fā)表人：盧晶晶揚子江藥業(yè)集團有限公司飛躍QC小組YangtzeRiverPharmaceuticalGroup揚子江藥業(yè)集團當(dāng)前第1頁\共有68頁\編于星期四\9點一．產(chǎn)品概況黃芪精是我公司開發(fā)研制的虛癥類OTC產(chǎn)品，為補血養(yǎng)氣，固本止汗之良藥。其療效佳，口感好，攜帶方便。

YangtzeRiverPharmaceuticalGroup揚子江藥業(yè)集團當(dāng)前第2頁\共有68頁\編于星期四\9點二.小組概況

(一)小組簡介

小組名稱飛躍QC小組課題注冊號TZ2005015課題類型創(chuàng)新型小組成員8人成立時間2005.10活動時間2005.10～2006.4課題名稱研究黃芪精中黃芪甲苷含量測定的新方法活動次數(shù)19次出勤率100%制表人：張集盤日期：2006.3.20YangtzeRiverPharmaceuticalGroup揚子江藥業(yè)集團當(dāng)前第3頁\共有68頁\編于星期四\9點(二)QC小組成員一覽表序號姓名性別受教育情況職務(wù)組內(nèi)分工1張集盤男大專標(biāo)準(zhǔn)研究員組長，資料整理2黃新蘭女本科，工程師，質(zhì)量管理工程師QC主管副組長，技術(shù)指導(dǎo)3馬軍男大專標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實施4盧晶晶女本科標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實施，成果匯報5陸莉娟女大專標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實施6祖若玉女大專標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實施7牛萍女碩士，高工，質(zhì)量管理工程師質(zhì)管經(jīng)理技術(shù)指導(dǎo)8季洪英女大專，工程師，質(zhì)量管理工程師質(zhì)管部長技術(shù)指導(dǎo)當(dāng)前第4頁\共有68頁\編于星期四\9點三．選擇課題1.薄層掃描法測定黃芪精中黃芪甲苷含量的缺陷分析基線不穩(wěn)定耗時長易出現(xiàn)鬼峰偏差大缺陷當(dāng)前第5頁\共有68頁\編于星期四\9點1.1.掃描時基線不穩(wěn)定當(dāng)前第6頁\共有68頁\編于星期四\9點1.2.容易出現(xiàn)鬼峰當(dāng)前第7頁\共有68頁\編于星期四\9點1.3.檢測偏差大，方法的準(zhǔn)確性較差當(dāng)前第8頁\共有68頁\編于星期四\9點1.4.薄層板展開耗時長，且一塊薄層板只能點一個批號的供試品，檢測批次很有限，導(dǎo)致出成品檢測報告的周期較長。1.5.按照部頒標(biāo)準(zhǔn)，以薄層掃描法（TLCS）對黃芪精中黃芪甲苷進行含量測定，結(jié)果如下。當(dāng)前第9頁\共有68頁\編于星期四\9點黃芪精按部頒標(biāo)準(zhǔn)含量測定結(jié)果批號含量（mg·ml-1）含量平均值（mg·ml-1）相對平均偏差（%）030301-10.114120.105260.109694.1030401-10.110680.106490.108582.0030501-10.126550.119450.123002.9030601-10.120410.113520.116963.0030702-10.129010.119300.124164.0030801-10.125070.133710.129393.4TLCS法測定本品含量時偏差大，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。當(dāng)前第10頁\共有68頁\編于星期四\9點2.課題確定

研究黃芪精中黃芪甲苷含量測定的新方法可供直接借鑒的方法少黃芪化學(xué)成分復(fù)雜黃芪為君藥黃芪甲苷為主要有效成分當(dāng)前第11頁\共有68頁\編于星期四\9點四.設(shè)定目標(biāo)擬制定黃芪精中黃芪甲苷含量測定的新方法的回收率不低于90%；含量測定結(jié)果的相對平均偏差小于2.0%。當(dāng)前第12頁\共有68頁\編于星期四\9點五．提出并選擇最佳方案1.提出方案（1）HPLC-UV（高效液相色譜-紫外檢測器）法（2）HPLC-RI（高效液相色譜-示差折光檢測器）法（3）HPLC-ELSD（高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器）法當(dāng)前第13頁\共有68頁\編于星期四\9點2.方案的分析、評估與確定序號方案內(nèi)容原理分析評估人方案評估綜合得分方案選定可操作性準(zhǔn)確性經(jīng)濟性1HPLC-UV（高效液相色譜-紫外檢測器）法利用黃芪甲苷在203nm處有末端吸收的原理,建立以乙腈-水（32：68）為流動相的HPLC-UV法張集盤▲▲●44因在203nm處干擾大不選黃新蘭▲●●馬軍●●●盧晶晶●●●陸莉娟▲▲●祖若玉▲●●牛萍▲▲●季洪英▲▲●當(dāng)前第14頁\共有68頁\編于星期四\9點序號方案內(nèi)容原理分析評估人方案評估綜合得分方案選定可操作性準(zhǔn)確性經(jīng)濟性2HPLC-RI（高效液相色譜-示差折光檢測器）法樣品組分折射率與流動相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來時，會引起流動相折射率的變化，該變化與樣品組分的濃度成正比

張集盤●

▲

●32因靈敏度不高不選黃新蘭▲

●

●馬軍●

●

●盧晶晶●

●

●陸莉娟●

▲

●祖若玉▲

●

●牛萍●

●

●季洪英●

●

●當(dāng)前第15頁\共有68頁\編于星期四\9點序號方案內(nèi)容原理分析評估人方案評估綜合得分方案選定可操作性準(zhǔn)確性經(jīng)濟性3HPLC-ELSD

（高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器）法

ELSD可以對所有揮發(fā)性低于流動相的物質(zhì)作出準(zhǔn)確檢測,而與被檢測物質(zhì)的化學(xué)基團關(guān)系不大,響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比張集盤▲■●76因檢測范圍廣、靈敏度高，故選定黃新蘭▲■●馬軍▲■●盧晶晶▲■●陸莉娟▲■●祖若玉▲■●牛萍■■●季洪英■■●備注：可操作性、準(zhǔn)確性、經(jīng)濟性三個指標(biāo)均以1分（●一般）、3分（▲良好）、5分（■顯著）為評分標(biāo)準(zhǔn)，上述綜合得分為QC小組成員所評分?jǐn)?shù)的總和。當(dāng)前第16頁\共有68頁\編于星期四\9點3.確定方案的采用順序（3）HPLC-ELSD（高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器）法（1）HPLC-UV（高效液相色譜-紫外檢測器）法（2）HPLC-RI（高效液相色譜-示差折光檢測器）法PDCA當(dāng)前第17頁\共有68頁\編于星期四\9點六．制定對策

根據(jù)以上選擇的最佳方案制訂對策表對策目標(biāo)措施地點時間負(fù)責(zé)人色譜條件的確定峰形對稱，目標(biāo)峰與相鄰峰分離度不小于1.5，保留時間適中對不同的色譜柱、流動相、流速等進行摸索，盡量與藥典中黃芪藥材含量測定的色譜條件劃一儀器室05.11.21～05.11.28張集盤馬軍供試品前處理方法的選擇有效地提取目標(biāo)物且操作方便摸索科學(xué)、準(zhǔn)確的供試品前處理方法，盡量與藥典中黃芪藥材含量測定的前處理方法劃一儀器室05.12.05～05.12.17張集盤馬軍盧晶晶陸莉娟當(dāng)前第18頁\共有68頁\編于星期四\9點對策目標(biāo)措施地點時間負(fù)責(zé)人線性關(guān)系的確定

相關(guān)系數(shù)大于0.9990配制至少5個系列濃度，選擇適當(dāng)?shù)那€擬和類型進行確定

儀器室

06.01.05～06.01.20

張集盤馬軍盧晶晶精密度試驗

峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2.0%

同一供試品至少連續(xù)進樣5次，考查色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

儀器室

06.02.05～06.02.11

張集盤馬軍祖若玉當(dāng)前第19頁\共有68頁\編于星期四\9點對策目標(biāo)措施地點時間負(fù)責(zé)人重復(fù)性試驗

含量測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2.0%同一批號的供試品同一人同一儀器平行操作6份，考查含量測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

儀器室

06.02.13～06.02.18

張集盤穩(wěn)定性試驗峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2.0%

同一供試品分別在0、2、4……小時進樣分析，考查色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）儀器室

06.02.20～06.02.23

張集盤馬軍盧晶晶祖若玉

當(dāng)前第20頁\共有68頁\編于星期四\9點對策目標(biāo)措施地點時間負(fù)責(zé)人方法回收率試驗

方法回收率不低于90%

同一批號已知含量的供試品加入適量的對照品（或?qū)φ掌啡芤海┢叫胁僮?份，考查方法回收率

儀器室

06.02.25～06.03.10張集盤馬軍陸莉娟

當(dāng)前第21頁\共有68頁\編于星期四\9點七．對策實施實施一：色譜條件的確定1.儀器與試藥Agilent1100高效液相色譜儀；Attech2000蒸發(fā)光散射檢測器；梅特勒AG285電子天平。

黃芪精；天津農(nóng)藥總廠D101型大孔吸附樹脂；甲醇、乙腈為色譜純；95%乙醇為分析純；水為超純水。當(dāng)前第22頁\共有68頁\編于星期四\9點2.對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解，配制成0.1mg?ml-1的對照品溶液。3.供試品溶液的制備精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇10ml使溶解，0.45μm有機系微孔濾膜濾過，即得。當(dāng)前第23頁\共有68頁\編于星期四\9點4.色譜條件的確定當(dāng)前第24頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖1色譜柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）流動相：乙腈-水(40：60)柱溫：40℃流速：1.2ml·min-1min24681012mAu100200300400500600700ADC1A,ADC1CHANNELA(ZJP\HQJ21528.D)1.4057.917當(dāng)前第25頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖2色譜柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）流動相：乙腈-水(40：60)柱溫：40℃流速：1.0ml·min-1當(dāng)前第26頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖3色譜柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）流動相：乙腈-水(40：60)柱溫：40℃流速：0.9ml·min-1當(dāng)前第27頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖4色譜柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）流動相：乙腈-水(40：60)柱溫：40℃流速：0.9ml·min-1當(dāng)前第28頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖5色譜柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）流動相：乙腈-水(32：68)柱溫：40℃流速：1.0ml·min-1當(dāng)前第29頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖6色譜柱：AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）流動相：乙腈-水(32：68)柱溫：40℃流速：1.0ml·min-1當(dāng)前第30頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件篩選圖7色譜柱：DikmaDiamonsilTM（鉆石）C18柱(4.6×250mm,5μm)流動相：乙腈-水(40：60)柱溫：40℃流速：1.0ml·min-1前延峰當(dāng)前第31頁\共有68頁\編于星期四\9點色譜條件選擇情況匯總表色譜柱流動相不同流速（ml·min-1）下的對照品溶液色譜峰分離情況不同流速（ml·min-1）下的供試品溶液色譜峰分離情況0.91.01.20.91.01.2AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）乙腈-水(40：60)峰形對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，保留時間適中峰形對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，保留時間適中DikmaDiamonsilTM（鉆石）C18柱（4.6×250mm，5μm）乙腈-水(40：60)峰形對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR＞10min峰形對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR＞10minAgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）乙腈-水(32：68)峰形對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR＞10min峰形對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR＞10minDikmaDiamonsilTM（鉆石）C18柱（4.6×250mm，5μm）乙腈-水(32：68)峰形較對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR＞10min峰形較對稱；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR＞10min當(dāng)前第32頁\共有68頁\編于星期四\9點因此，可以選擇AgilentXDB-C18柱（4.6×150mm，5μm）、以乙腈-水(32：68)為流動相，流速為1.0ml·min-1進行后續(xù)試驗。當(dāng)前第33頁\共有68頁\編于星期四\9點實施二：供試品前處理方法的選擇1.供試品溶液的制備精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱，以水50ml洗脫，棄去水液，再用A％乙醇30ml洗脫，棄去洗脫液，繼用B％乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。當(dāng)前第34頁\共有68頁\編于星期四\9點2.提取分離條件的確定收集上述水液和各擬棄去的乙醇洗脫液，蒸干，加甲醇適量使溶解，得溶液C按照上述色譜條件分別進樣20μl，記錄色譜峰面積。當(dāng)前第35頁\共有68頁\編于星期四\9點各擬棄去的乙醇洗脫液蒸干，加甲醇適量使溶解，得溶液C水液30%40%50%60%70%80%95%黃芪甲苷峰檢出情況未檢出未檢出檢出量較小檢出量較大檢出量最大未檢出未檢出未檢出當(dāng)前第36頁\共有68頁\編于星期四\9點試驗結(jié)果表明：（1）棄去的水液中目標(biāo)物無損失；（2）當(dāng)A=40，即采用40%乙醇洗脫時，目標(biāo)物有損失；（3）當(dāng)B=60，即繼續(xù)采用60%乙醇洗脫時，則目標(biāo)物洗脫不完全。因此確定A%、B%的最佳值分別為：30%、70%，并以此值確定的提取分離條件進行后續(xù)方法學(xué)的驗證。當(dāng)前第37頁\共有68頁\編于星期四\9點實施三：線性關(guān)系的確定取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至8個系列濃度,分別進樣10μl，測定峰面積，以對照品濃度X(mg?ml-1)的lg值為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y的lg值為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程：

Y=0.1819X+1.9515r=0.9992當(dāng)前第38頁\共有68頁\編于星期四\9點工作曲線評價：結(jié)果表明黃芪甲苷在76.560～255.20μg?ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)前第39頁\共有68頁\編于星期四\9點實施四：精密度試驗取同一供試品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進樣6次，每次10μl，測得黃芪甲苷色譜峰峰面積平均值為978.57883，RSD為0.5%。當(dāng)前第40頁\共有68頁\編于星期四\9點進樣次數(shù)峰面積峰面積平均值RSD（%）1977.09442978.578830.52980.079413975.409004986.095835976.362926976.43140當(dāng)前第41頁\共有68頁\編于星期四\9點評價：精密度良好，達到預(yù)期目標(biāo)。當(dāng)前第42頁\共有68頁\編于星期四\9點實施五：重復(fù)性試驗取同一批號樣品，制備6份供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl，供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積值，以外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算，即得黃芪甲苷的含量。當(dāng)前第43頁\共有68頁\編于星期四\9點重復(fù)性試驗結(jié)果試驗次數(shù)含量（mg?ml-1）含量平均值（mg?ml-1）RSD（%）10.1234380.1223571.20.12196820.1233660.12376830.1238620.12227040.1211760.12373450.1211650.11947860.1209460.123113當(dāng)前第44頁\共有68頁\編于星期四\9點評價：重復(fù)性試驗RSD為1.2%，達到預(yù)期目標(biāo)。當(dāng)前第45頁\共有68頁\編于星期四\9點實施六：穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，于0、2、4、6、12、14h分別精密吸取10μl注入液相色譜儀分析，測得峰面積值，計算RSD。當(dāng)前第46頁\共有68頁\編于星期四\9點穩(wěn)定性試驗結(jié)果進樣時間（h）峰面積峰面積平均值RSD（%）01071.514771069.388771.821064.4517841077.6015661053.73657121098.48413141043.48083當(dāng)前第47頁\共有68頁\編于星期四\9點

評價：上述結(jié)果表明供試品溶液在14h內(nèi)穩(wěn)定性良好。當(dāng)前第48頁\共有68頁\編于星期四\9點實施七：方法回收率試驗

精密吸取已知含量同一批號樣品5ml，6份，分別精密加入已知濃度的對照品溶液5ml，制備溶液，分別進樣10μl，測得峰面積值，計算平均回收率和RSD。當(dāng)前第49頁\共有68頁\編于星期四\9點回收率測定結(jié)果（n=6）取樣量（ml）樣品含量（mg）加入量（mg）測得量（mg）回收率（%）平均值（%）RSD（%）50.8219550.52701.3168893.9196.761.911.3248795.4350.8219550.52701.3455599.351.3418698.6550.8219550.52701.3305796.511.3396498.2350.8219550.52701.3352697.401.3371497.7650.8219550.52701.3218994.861.3219794.8850.8219550.52701.3432198.911.3241195.29當(dāng)前第50頁\共有68頁\編于星期四\9點評價：平均回收率為96.76%，RSD為1.91%，表明方法準(zhǔn)確度良好，可以用于本品的定量分析。當(dāng)前第51頁\共有68頁\編于星期四\9點評價1.初步評價建立了黃芪精中黃芪甲苷含量測定的新方法，方法學(xué)研究符合《中國藥典》2005年版（一部）附錄“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則”。當(dāng)前第52頁\共有68頁\編于星期四\9點2.綜合評價

取本品3批，將兩法的含量測定結(jié)果進行對比。當(dāng)前第53頁\共有68頁\編于星期四\9點批號含量（mg?ml-1）相對平均偏差（%）TLCS法平均值HPLC-ELSD法平均值TLCS法HPLC-ELSD法060313010.133960.1393240.1304560.1352832.60.70.1332480.127400.1381040.139324060314010.152920.1585610.1441870.1512221.91.20.1442410.147310.1578980.158561060315010.148710.1541390.1454340.1496721.80.70.1460540.143720.1530620.154139當(dāng)前第54頁\共有68頁\編于星期四\9點當(dāng)前第55頁\共有68頁\編于星期四\9點評價：采用HPLC-ELSD法測定黃芪精中黃芪甲苷含量比采用TLCS法測定時的相對平均偏差小，測定的結(jié)果較理想。當(dāng)前第56頁\共有68頁\編于星期四\9點八.效果檢查1.效果驗證取不同批號的黃芪精，依法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣10μl，測得峰面積值，并計算黃芪甲苷含量。10批樣品含量測定結(jié)果見下表。當(dāng)前第57頁\共有68頁\編于星期四\9點10批樣品含量測定結(jié)果（n=4）批號含量（mg?ml-1）含量平均值（mg?ml-1）相對平均偏差（%）060102010.1573570.1586401.10.1565360.1602440.160424060120010.1554750.1555660.60.1556130.1539920.157184060202010.1634490.1643911.40.1611400.1659520.167023當(dāng)前第58頁\共有68頁\編于星期四\9點批號含量（mg?ml-1）含量平均值（mg?ml-1）相對平均偏差（%）060203010.1523720.1525030.50.1513820.1527150.153544060204010.1433190.1428430.80.1435370.1405860.143930060204020.1326390.1327960.40.1321470.1335680.132828當(dāng)前第59頁\共有68頁\編于星期四\9點批號含量（mg?ml-1）含量平均值（mg?ml-1）相對平均偏差（