PCR實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化管理與質(zhì)量控制-課件

PCR實(shí)驗(yàn)室

標(biāo)準(zhǔn)化管理與質(zhì)量控制1PPT課件

PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化管理第一部分2PPT課件

一.PCR實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化管理

依據(jù)：按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號

3PPT課件1.PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置工作區(qū)組成(每區(qū)不同顏色隔離衣)

試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、

PCR擴(kuò)增區(qū)、

PCR產(chǎn)物分析區(qū)、標(biāo)本接收及工作區(qū)組成其設(shè)備、儀器等物品專用4PPT課件2.PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的管理

注意：唯一流向制度問題

物品的專用與移動(dòng)問題5PPT課件3.PCR實(shí)驗(yàn)室的人員配置相對固定的專業(yè)人員（學(xué)歷與職稱）培訓(xùn)與上崗證PCR檢測干擾因素較多，結(jié)果分析復(fù)雜，其應(yīng)用需要與臨床充分溝通。PCR實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)掌握相關(guān)學(xué)科知識及應(yīng)用能力（實(shí)驗(yàn)技能、分析能力、溝通能力）6PPT課件

4.儀器設(shè)備的管理(1)建檔管理：

a.儀器設(shè)備的一般情況

b.儀器設(shè)備的相關(guān)文件

c.儀器設(shè)備的損壞，故障，修理記錄

d.有問題的儀器設(shè)備停用標(biāo)識

e.儀器設(shè)備的報(bào)廢處理(2)儀器設(shè)備的分區(qū)專用(3)儀器設(shè)備的校準(zhǔn)和檢定(4)進(jìn)行定期的維護(hù)和保養(yǎng)7PPT課件5.實(shí)驗(yàn)材料的購買和管理(1)PCR檢測試劑選用:

經(jīng)有關(guān)機(jī)構(gòu)檢定批準(zhǔn)上市的商品化試劑盒，商品試劑三證齊全（生產(chǎn)許可證、產(chǎn)品注冊證、經(jīng)營許可證）。(2)Tip頭選購：必須使用有濾蕊的PCR專用Tip頭8PPT課件b.內(nèi)包裝檢查：內(nèi)包裝是否有破損，泄漏，內(nèi)容物是否齊全，是否有相應(yīng)的使用說明書等。a.外包裝檢查：包裝應(yīng)完整無損無污，標(biāo)識清楚:廠家名稱，品名，批準(zhǔn)文號，生產(chǎn)日期，有效期等。(3)試劑及耗材的驗(yàn)收：c.性能檢查9PPT課件a.PCR檢測試劑分區(qū)放置：核酸提取液，陰、陽性對照、定量標(biāo)準(zhǔn)及其它標(biāo)本處理用試劑存于樣品處理區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑存于試劑配制區(qū)。b.PCR檢驗(yàn)試劑存放于-20℃冰箱。c.無菌處理前的耗材存放于試劑準(zhǔn)備區(qū)，根據(jù)日常工作量，定期定量處理后放至樣品處理區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。(4)試劑及耗材的貯存：10PPT課件

體系建立后，如有必要更換試劑品牌，實(shí)驗(yàn)室主任須向科技術(shù)負(fù)責(zé)人提交書面報(bào)告說明更改理由；經(jīng)科技術(shù)委員會討論，科技術(shù)負(fù)責(zé)人簽字批準(zhǔn)方可更換。(5)實(shí)驗(yàn)室不能隨意更改檢測體系11PPT課件6.PCR檢測的標(biāo)本管理(1)標(biāo)本接收接收標(biāo)本時(shí)應(yīng)核對標(biāo)本與檢驗(yàn)申請單的一致性，對標(biāo)本狀態(tài)進(jìn)行登記記錄，并在登記本上簽字。檢驗(yàn)申請有不清晰情況時(shí)，應(yīng)即時(shí)與臨床科室或相關(guān)人員聯(lián)系核實(shí)，并做好記錄。12PPT課件(2)標(biāo)本的唯一性標(biāo)識

標(biāo)識由三部分構(gòu)成-----檢測項(xiàng)目、標(biāo)本采集日期、該檢測批次的標(biāo)本序號，三部分間無間隔符號，例如：HBV020601a1（項(xiàng)目年月日序號）。

標(biāo)本的唯一性標(biāo)識須字跡清晰明了，不得隨意作任何涂改；必須時(shí)，在舊標(biāo)識上劃雙線更改，更改后應(yīng)保持舊標(biāo)識可辨識13PPT課件(3)標(biāo)本廢棄處理

廢棄樣本經(jīng)確認(rèn)后，保持容器完整，置于廢棄標(biāo)本處，經(jīng)密閉收集，統(tǒng)一焚燒處理,并有記錄。14PPT課件7.PCR試驗(yàn)記錄的管理

（1）記錄方法

a.接受標(biāo)本記錄：以書面形式記錄病人信息、樣本信息、是否保存，同時(shí)對樣本作標(biāo)識，記錄人簽名；檢驗(yàn)時(shí)，將標(biāo)識的樣本帶入樣本處理間處理。

b.PCR擴(kuò)增檢測記錄：檢測結(jié)果以清楚的唯一標(biāo)識保存于PCR擴(kuò)增儀的電腦的指定文件夾內(nèi)，并定期進(jìn)行備份與整理。15PPT課件c.保存的文件夾及文件標(biāo)識號：d.電子保存的軟件備份要求：每一個(gè)月進(jìn)行一次電子報(bào)告的軟件備份；安排在每月的最后一個(gè)工作日完成。16PPT課件(2)記錄保存a.電子數(shù)據(jù)的保存:

將病例資料、樣品資料、檢測結(jié)果錄入報(bào)告系統(tǒng)，產(chǎn)生報(bào)告，同時(shí)保存記錄，記錄人簽名b.書面記錄的保存:

書面記錄（病例資料和結(jié)果記錄）裝訂保存于報(bào)告系統(tǒng)旁的抽屜里，每月進(jìn)行整理，所有記錄保存兩年，兩年后交科室統(tǒng)一建檔封存，封存記錄的開啟須經(jīng)科主任同意并委派檔案管理人在場。17PPT課件(3)記錄的保密：

a.“data”由系統(tǒng)設(shè)置密碼保護(hù)；b.結(jié)果資料在報(bào)告系統(tǒng)設(shè)置密碼保護(hù)；c.在用的及保存的文字記錄須隨時(shí)在實(shí)驗(yàn)室工作人員的監(jiān)管下，脫離本室人員視線監(jiān)管的須存放在上鎖的抽屜或文件柜內(nèi)，鑰匙由該工作人員保管。d.記錄不能涂改，需修改時(shí)可用紅筆在修改內(nèi)容上加雙斜杠并在備注欄中說明、簽字18PPT課件8.PCR檢測結(jié)果的報(bào)告(1)報(bào)告的要求檢測報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、客觀(2)報(bào)告的形式各醫(yī)院自定(3)報(bào)告單的發(fā)放與管理（憑？取單）電話報(bào)告？(5)化驗(yàn)單需郵寄和E-mail形式發(fā)放的管理19PPT課件9.抱怨的內(nèi)部處理(1)抱怨的接受：醫(yī)生、病人、其他人

執(zhí)行者在接受抱怨時(shí)，應(yīng)記錄抱怨者姓名、地址、聯(lián)系方式、抱怨內(nèi)容（必要時(shí)首先穩(wěn)定抱怨者情緒）。20PPT課件(2)抱怨的處理（投訴）a.能當(dāng)時(shí)處理的抱怨及時(shí)解決，記錄。b.不能當(dāng)即答復(fù)的,按逐級授權(quán),匯報(bào)解決。c.抱怨的處理以病人滿意為目的，但必須以遵重科學(xué)，遵重事實(shí)為原則，在不違背科學(xué)原則，醫(yī)療行為規(guī)范的基礎(chǔ)上，爭取抱怨者最大程度的理解。21PPT課件10.傳染性防護(hù)(1)來自所有病人的血液和體液都被認(rèn)為是具有傳染性。標(biāo)本采集、運(yùn)送過程中，應(yīng)保持容器完好，無泄漏。(2)處理血液和體液的工作人員都應(yīng)戴上手套，穿防護(hù)服，戴帽子、口罩。(3)在標(biāo)本處理過程中，手或其它部位的皮膚在接觸血液或其它體液后必須立即徹底清洗。22PPT課件

臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制第二部分23PPT課件為什么特別強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制？？容易污染－假陽性處理不當(dāng)－假陰性24PPT課件假陽性問題：標(biāo)本、試劑及實(shí)驗(yàn)場地的污染試劑盒的質(zhì)量問題

UNG酶是一種選擇，但不可因此而高枕無憂加強(qiáng)管理最為重要選擇優(yōu)質(zhì)試劑盒25PPT課件假陰性的問題：原因：

1.標(biāo)本處理等操作過程問題

2.標(biāo)本中存在抑制劑

3.由于基因突變所致解決的辦法：

1.稀釋標(biāo)本

2.點(diǎn)突變的檢測

3.結(jié)合其他方法分析

4.加強(qiáng)與臨床聯(lián)系與對話26PPT課件臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制為什么強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制？目前國內(nèi)所用核酸定量監(jiān)測方法，受模板濃度、PCR反應(yīng)體系的批間差異影響較大。因此，必須進(jìn)行方法學(xué)的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以此來規(guī)范PCR實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控工作

室間質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制27PPT課件臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制測定前的質(zhì)量控制操作實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)量控制

質(zhì)量控制統(tǒng)計(jì)學(xué)處理28PPT課件測定前質(zhì)量控制標(biāo)本采集和留取實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理理想的試劑和操作方法

人員培訓(xùn)

29PPT課件操作實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)量控制標(biāo)本核酸提取質(zhì)量控制靶核酸提取的質(zhì)量和效率臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制物和干擾物質(zhì)擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測質(zhì)控

30PPT課件質(zhì)控管設(shè)計(jì)

已知弱陽性樣本質(zhì)控已知陰性樣本質(zhì)控試劑空白質(zhì)控31PPT課件已知弱陽性樣本質(zhì)控監(jiān)測整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程有效性32PPT課件陰性血清樣本質(zhì)控監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；

由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染；擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。

33PPT課件試劑空白管質(zhì)控監(jiān)測擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性。監(jiān)測反應(yīng)液加樣區(qū)及加樣過程是否發(fā)生污染。如想鑒別實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染，可將一個(gè)或多個(gè)空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)30～60分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管為陰性，則說明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。34PPT課件統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法

Levey-Jennings質(zhì)控圖方法

Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法

35PPT課件高、低值質(zhì)控血清的制備

將常規(guī)檢測的血清標(biāo)本按高、低值分類后進(jìn)行混合分裝（每管一個(gè)檢測單位），凍存于-20℃冰箱備用。購買36PPT課件檢測結(jié)果質(zhì)量監(jiān)控按常規(guī)方法每天插入一份高、低值質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清進(jìn)行定量檢測（包括標(biāo)本預(yù)處理、DNA提取等步驟）連續(xù)20天后分別計(jì)算出高、低值血清的均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV）制作L-J動(dòng)態(tài)質(zhì)控圖高值質(zhì)控血清以強(qiáng)陽性血清為宜低值質(zhì)控血清以臨界值血清為宜37PPT課件結(jié)果38PPT課件結(jié)果39PPT課件標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距和斜率質(zhì)控以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率做質(zhì)控圖以標(biāo)準(zhǔn)曲線截距做質(zhì)控圖用同批號試劑同批號標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)檢測20個(gè)批次40PPT課件試劑a標(biāo)記探針熒光強(qiáng)度及背景熒光41PPT課件試劑b標(biāo)記探針熒光強(qiáng)度及背景熒光42PPT課件試劑c標(biāo)記探針熒光強(qiáng)度及背景熒光43PPT課件試劑a質(zhì)量結(jié)果我們選擇試劑盒a用于常規(guī)HBVDNA熒光定量檢測，并用該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與截距對試劑批間差異實(shí)施質(zhì)量監(jiān)控，其結(jié)果見圖2和圖3。44PPT課件標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距的批間差

同批號試劑批間不同批號試劑批間 斜率 截距 斜率截距均值3.724 45.808 3.67144.474標(biāo)準(zhǔn)差0.1160.7850.0450.952變異系數(shù)3.106 1.714 1.2292.14045PPT課件試劑a質(zhì)量穩(wěn)定性同批號試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距的批間變異（即試劑盒批內(nèi)）為3.106%和1.714%。不同批號試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距的均值、標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.671、0.045和44.474、0.952，其批間變異（既試劑盒批間）為1.229%和2.14%。46PPT課件HBVDNA定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率質(zhì)控圖47PPT課件HBVDNA定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線截距質(zhì)控圖48PPT課件優(yōu)點(diǎn)采用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與截距以及熒光背景的噪音和熒光曲線的陡度對其實(shí)施動(dòng)態(tài)質(zhì)量監(jiān)控，具有簡捷、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)利用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距對定量PCR進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，可有效控制因試劑分裝質(zhì)量(反應(yīng)液/酶加入量)及酶活性而引發(fā)的失控49PPT課件50PPT課件四.臨床PCR試劑盒的選用PCR或RT-PCR試劑盒的組成PCR試劑盒的分類影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素PCR試劑盒質(zhì)量指標(biāo)PCR試劑盒的選用原則51PPT課件1、PCR或RT-PCR試劑盒的組成核酸提取試劑標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品核酸擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴(kuò)增試劑產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動(dòng)分析儀的PCR方法因其核酸擴(kuò)增和檢測同時(shí)完成，故無專門的產(chǎn)物檢測試劑）52PPT課件2、PCR試劑盒的分類定性測定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交、熒光PCR（分子信標(biāo)和TaqMan等）定量測定：熒光定量PCR、PCR-ELISA定量等。53PPT課件3、影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素內(nèi)在因素:

原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)外在因素：試劑盒的運(yùn)輸和貯存54PPT