第四章基因工程的主要技術(shù)及其原理

原理

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶瓊脂糖凝膠電泳當(dāng)前第1頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脫水—L—半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖

當(dāng)前第2頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)

豬基因組DNA及PCR產(chǎn)物電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液：Ⅰ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液;Ⅱ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品當(dāng)前第3頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)相關(guān)知識(shí)：①影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素、遷移速率由DNA的分子大小、瓊脂糖濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓、電場(chǎng)方向、堿基組成與溫度、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等許多參數(shù)確定。

表瓊脂糖濃度與DNA分離范圍

當(dāng)前第4頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。當(dāng)前第5頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)(4)用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于點(diǎn)樣板上，再加入上樣緩沖液loadingbuffer，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)前第6頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)結(jié)果與分析

圖2基因組DNA1%瓊脂凝膠電泳圖當(dāng)前第7頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)結(jié)果與分析

圖2

PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

(1、2、3、4為PCR產(chǎn)物，M為DL2000Marker)當(dāng)前第8頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳裝置當(dāng)前第9頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟制膠90℃以上熔化，凝膠溫度35-43℃EB當(dāng)前第10頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)1231、孔深2、預(yù)留尺寸3、梳子寬度1+2=膠的厚度3當(dāng)前第11頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)-+加緩沖液當(dāng)前第12頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)拔梳子最好在電泳槽中當(dāng)前第13頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)-+點(diǎn)樣當(dāng)前第14頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)-+電泳紫外當(dāng)前第15頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)﹢﹣﹣﹢當(dāng)前第16頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第17頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第18頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)電泳結(jié)果分析DNA空間結(jié)構(gòu)電壓

EB當(dāng)前第19頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)脈沖電場(chǎng)（PFGE）解決大分子DNA電泳問題當(dāng)前第20頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第21頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)Blotting當(dāng)前第22頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA或者DNA-DNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法當(dāng)前第23頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)(1)Southern印跡雜交法

限制性內(nèi)切酶酶切

檢測(cè)雜交信號(hào)

提取DNA

Southern法可用于檢測(cè)特異的DNA序列片段,進(jìn)行基因定位、分子量測(cè)定等。當(dāng)前第24頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)SouthernBlotPartI:GelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembraneDNACleavedwitharestrictionenzymeSmearofrestrictionfragments80度烘烤1-2h當(dāng)前第25頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)SouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobe當(dāng)前第26頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第27頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)DNAstainedwithethidiumbromideautoradiographofhybridizedmembraneSouthernBlot當(dāng)前第28頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)NorthernBlotprobedwithb-globinUndifferentiatedcells+differentiationfactorNote:MakenorthernjustlikeaSouthern,exceptrunoutRNAsamplesratherthanDNAMeasuresthesteady-statelevelofmRNAtranscriptfromagivengeneSmearofRNAtranscripts當(dāng)前第31頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)

核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗(yàn)核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們?cè)谶M(jìn)化中的關(guān)系，其主要應(yīng)用如下圖所示：當(dāng)前第32頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)核酸雜交及其應(yīng)用示意圖Ⅰ.變性、復(fù)性和雜交。粗細(xì)線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡

Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標(biāo)記當(dāng)前第33頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)

在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術(shù)稱探針技術(shù)(Probe)。

探針技術(shù)在遺傳性疾病診斷上已開始應(yīng)用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細(xì)胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對(duì)有癥狀患者進(jìn)行確診，還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。如從胎兒的羊水可以提取到少量DNA后，再用探針技術(shù)對(duì)此進(jìn)行產(chǎn)前診斷各種遺傳性疾病已在臨床上開展。

雜交和探針技術(shù)是許多分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前第34頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)

當(dāng)前第35頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)MakingaprobeUsetheknownaminoacidsequenceofaproteinSynthesiseashortDNAsequenceinvitroAA:phemettrpglucysasnCodons:UUUC

AUGUGGGAAGUGUCAAUCProbe:AAAGTACACCCTTCACAGTTAG

-P32當(dāng)前第36頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)Ashortsequenceofaproteinisusedtodesignasetofoligonucleotidesforuseasaprobetorecoverthegenethatencodedtheprotein.Oneoftheprobesequencewillbeaperfectmatchforthegene當(dāng)前第37頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)WesternBlot基本原理

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測(cè)。當(dāng)前第38頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色當(dāng)前第39頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。

細(xì)胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0

有機(jī)溶劑提取法對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備當(dāng)前第40頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)蛋白樣品的定量Bradford法

考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）管號(hào)012345678ddH2O807070707070707070蛋白標(biāo)準(zhǔn)液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010當(dāng)前第41頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素當(dāng)前第42頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時(shí)間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份當(dāng)前第43頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212當(dāng)前第44頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第45頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價(jià)格昂貴價(jià)格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機(jī)械強(qiáng)度當(dāng)前第46頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)膜半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。

當(dāng)前第47頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第48頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。當(dāng)前第49頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)封閉脫脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）當(dāng)前第50頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時(shí)，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，37℃一小時(shí)，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。當(dāng)前第51頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)當(dāng)前第52頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)WesternBlot常見問題分析當(dāng)前第53頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊當(dāng)前第54頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適當(dāng)前第55頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫當(dāng)前第56頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度當(dāng)前第57頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)Westernblotissimilarinconcepttonorthern,exceptusepolyacrylamideandrunoutproteinsSouthern,Northern,andWesternanalyses當(dāng)前第58頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)免疫化學(xué)檢測(cè)法當(dāng)前第59頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)Usingantibodiestodetectaclone當(dāng)前第60頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)重組體的轉(zhuǎn)化利用物理方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)化

1.質(zhì)粒的Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(E.coli)2.質(zhì)粒的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

3.質(zhì)粒的高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化

4.顯微注射法轉(zhuǎn)化當(dāng)前第61頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)利用生物方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)染1.細(xì)胞噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2.動(dòng)物病毒DNA的轉(zhuǎn)染3.植物病毒DNA的轉(zhuǎn)染當(dāng)前第62頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5α，于37℃培養(yǎng)過夜(16-20h)；挑一個(gè)單菌落接種于25mL無菌的LB培養(yǎng)液中，37℃中速震蕩培養(yǎng)3h；將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;將細(xì)菌沉淀用5mL預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會(huì)后于4℃4000rpm離心10分鐘；將細(xì)菌沉淀用1mL預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200uL用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20℃保存?zhèn)溆?當(dāng)前第63頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

（1）取2μL連接產(chǎn)物，加入80μL感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰上放置30min。（2）將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)移42℃水浴中，熱擊90s。（3）將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)移至冰上2min（4）加入500-800μLLB液體培養(yǎng)基。（5）37℃，150rpm復(fù)蘇1.5h。（6）取100μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含100μg/mL的Amp）（7）37℃下培養(yǎng)16-24h。當(dāng)前第64頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)TransformingE.coliwithrecombinantDNA當(dāng)前第65頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)GrowthofBacteria當(dāng)前第66頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第67頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)及其應(yīng)用

當(dāng)前第68頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)目錄PCR的概念PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用當(dāng)前第69頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

當(dāng)前第70頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴(kuò)增當(dāng)前第71頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)前第72頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)簡史

PCR的最早設(shè)想：本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。PCR技術(shù)當(dāng)前第73頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)當(dāng)前第74頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)當(dāng)前第75頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)當(dāng)前第76頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)簡史PCR的改進(jìn)與完善：

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的一個(gè)片段，其缺點(diǎn)是：①此酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。PCR技術(shù)當(dāng)前第77頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)②其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，此種酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史當(dāng)前第78頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)94℃55℃37℃當(dāng)前第79頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)簡史1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。PCR技術(shù)當(dāng)前第80頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)TaqDNA聚合酶的特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史當(dāng)前第81頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)當(dāng)前第82頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)72℃94℃55℃PCR循環(huán)當(dāng)前第83頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理

無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對(duì)合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。

當(dāng)前第84頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

當(dāng)前第85頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR反應(yīng)條件PCR過程當(dāng)前第86頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR反應(yīng)條件PCR過程當(dāng)前第87頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR技術(shù)當(dāng)前第88頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR技術(shù)復(fù)習(xí)當(dāng)前第89頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR技術(shù)當(dāng)前第90頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR技術(shù)當(dāng)前第91頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR技術(shù)當(dāng)前第92頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR技術(shù)當(dāng)前第93頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR技術(shù)當(dāng)前第94頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR技術(shù)當(dāng)前第95頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)2PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍當(dāng)前第96頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。當(dāng)前第97頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。當(dāng)前第98頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)3）操作簡便易行PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時(shí),就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。通常的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增,還要用同位索探針進(jìn)行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時(shí)間。當(dāng)前第99頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子當(dāng)前第100頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)4）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)當(dāng)前第101頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。

當(dāng)前第102頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)1反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uBuffer（Mg2+）

1.5mmol/LPCR技術(shù)當(dāng)前第103頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程當(dāng)前第104頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次當(dāng)前第105頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)當(dāng)前第106頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件當(dāng)前第107頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。當(dāng)前第108頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。當(dāng)前第109頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。當(dāng)前第110頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。當(dāng)前第111頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加當(dāng)前第112頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever當(dāng)前第113頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)1）不對(duì)稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型當(dāng)前第114頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)

高濃度引物低濃度引物當(dāng)前第115頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列當(dāng)前第116頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶當(dāng)前第117頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。當(dāng)前第118頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)電泳引物12341234當(dāng)前第119頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對(duì)應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失當(dāng)前第120頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第121頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對(duì)ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測(cè)目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4當(dāng)前第122頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物當(dāng)前第123頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)5）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測(cè)探針信號(hào)可用于基因芯片的制作當(dāng)前第124頁\共有145頁\編于星期六\8點(diǎn)6）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增當(dāng)前第125頁\共有145頁\