細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)

第7章花藥和花粉培養(yǎng)當前第1頁\共有43頁\編于星期四\21點主要內(nèi)容7.1花藥培養(yǎng)7.2花粉培養(yǎng)7.3花藥和花粉培養(yǎng)中的白化苗問題7.4操作實例當前第2頁\共有43頁\編于星期四\21點植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史

Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）

Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）

80年代后期到90年代期間，花培技術迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。

90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。當前第3頁\共有43頁\編于星期四\21點花粉和花藥的區(qū)別兩者的異同點1.培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。2.花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培3.花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；能觀察雄核發(fā)育的全過程，單倍體產(chǎn)量高。但技術更復雜。當前第4頁\共有43頁\編于星期四\21點花粉和花藥的培養(yǎng)作用1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。供體植株小孢子（n）花粉植株（n）加倍純合植株DH（2n）花培雄核發(fā)育自然加倍人工一年內(nèi)獲得純系當前第5頁\共有43頁\編于星期四\21點（2）提高了目標基因型的選擇效率

例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb區(qū)分開。ABAbaBabABAABBAABbAaBBAaBbAbAABbAAbbAaBbAabbaBAaBBAaBbaaBbaaBbabAaBbAabbaaBbaabb當前第6頁\共有43頁\編于星期四\21點（3）誘變育種中的作用植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

當前第7頁\共有43頁\編于星期四\21點花藥離體培養(yǎng)的過程：

當前第8頁\共有43頁\編于星期四\21點7.1花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)：是指把發(fā)育到一定階段的花藥接種在適宜培養(yǎng)基上，使其中的花粉發(fā)育成單倍體植株的過程?；ㄋ幣囵B(yǎng)過程的主要環(huán)節(jié)：1、選取花粉單核期的花蕾和幼穗；2、進行適當?shù)念A處理；3、對外植體進行表面消毒；4、無菌條件下取出花藥接種到合適的培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)；5、花粉胚或花粉愈傷組織發(fā)育到適宜階段后，轉入植株再生培養(yǎng)基形成花粉植株；6、在試管苗階段或移栽成活以后進行花粉植株的染色體加倍；7、煉苗，移入土壤栽培。當前第9頁\共有43頁\編于星期四\21點一、材料的選擇花藥外植體的選擇是否合適，直接關系到培養(yǎng)能否功。當前第10頁\共有43頁\編于星期四\21點1.供體植株的基因型材料的遺傳背景對花藥培養(yǎng)的影響很大，不同植物甚至不同品種之間對花藥培養(yǎng)的反應都有差異，因此選擇合適的品種常是培養(yǎng)能否成功的關鍵因素。如水稻中粳稻比秈稻容易培養(yǎng)。當前第11頁\共有43頁\編于星期四\21點2.供體植株的生理狀態(tài)供體植物生理對誘導頻率有直接影響。如多年生植物中，幼年植物比老齡植物的花藥誘導頻率高；草本植物中生長健壯的花藥誘導頻率較高；煙草開花早期的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株；供體植株的生長條件對花粉發(fā)育及其對離體培養(yǎng)的反應也有重要影響。當前第12頁\共有43頁\編于星期四\21點3.花粉的發(fā)育時期不同植物的花粉對離體培養(yǎng)有其特定的最敏感發(fā)育時期，因此，選擇發(fā)育到合適時期的花粉是提高花粉植株誘導頻率的重要因素。例如煙草和水稻的花粉從單核早期至雙核期都可接受誘導；小麥和玉米處于單核期的花粉培養(yǎng)效果最好；而天竺葵則從四分體的花粉得到最佳效果。對于大多數(shù)植物來說，單核期的花粉比較容易培養(yǎng)。當前第13頁\共有43頁\編于星期四\21點發(fā)育時期物種減數(shù)分裂時期草莓、番茄種四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米不同物種誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期當前第14頁\共有43頁\編于星期四\21點檢查花粉的發(fā)育時期的方法：染色法：如用醋酸洋紅等染色制片，然后在顯微鏡下觀察。水稻單核靠邊期鑒定當前第15頁\共有43頁\編于星期四\21點二、預處理在花藥接種之前，先對其進行預處理可以提高誘導率。預處理方法：1.低溫預處理：一般可將帶有葉鞘的穗子（如稻、麥類）或花蕾（如煙草、油菜等）用紗布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中預處理。2.高溫預培養(yǎng)：在花藥分離后，把培養(yǎng)物放置在較高溫度條件下培養(yǎng)一段時間，然后再轉移到常溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3.甘露醇預處理將大麥的花藥用過濾除菌的0.3mol/L甘露醇溶液預培養(yǎng)3-5天，然后轉移到過濾除菌的FHG液體培養(yǎng)基上漂浮培養(yǎng)，其中的小孢子散落到培養(yǎng)液中形成大量的花粉胚。4.其他方法：離心預處理、乙烯利預處理、PEG預處理及磁場預處理當前第16頁\共有43頁\編于星期四\21點三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成對花藥培養(yǎng)的成功率有明顯的影響。1.植物生長物質：不同植物甚至不同品種之間對生長物質的需求都有可能不同。2.碳源：大部分培養(yǎng)基中使用的碳源都是以蔗糖來提供的，同時它還起著調節(jié)培養(yǎng)基滲透勢的作用，不同植物及不同培養(yǎng)階段對蔗糖濃度的要求不同。3.其他成分：基本培養(yǎng)基中各無機成分對花藥的離體培養(yǎng)中愈傷組織的產(chǎn)生有較大的影響。當前第17頁\共有43頁\編于星期四\21點四、培養(yǎng)方式1.液體培養(yǎng)優(yōu)點：可以用過濾法除菌，其中生物活性物質不會因常規(guī)的高壓滅菌而破壞，因此比在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果更好。缺點:液體培養(yǎng)容易造成培養(yǎng)物通氣不良，特別是隨著愈傷組織重量的增加，容易沉到培養(yǎng)基底部，由于供養(yǎng)較差，可能會對愈傷組織的分化能力產(chǎn)生嚴重的影響。當前第18頁\共有43頁\編于星期四\21點2.雙層培養(yǎng)：固體-液體雙層培養(yǎng)基制作的方法是先在35mm×10mm的小培養(yǎng)皿中鋪1-1.5mL瓊脂培養(yǎng)基，待固化后在其表面再加0.5mL液體培養(yǎng)基，然后將花藥接種在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。雙層培養(yǎng)的優(yōu)點是花藥在培養(yǎng)早期可以從活性高的液體培養(yǎng)基汲取營養(yǎng)，花粉胚長大后不會沉沒。可以在通氣良好的條件下分化成植株。當前第19頁\共有43頁\編于星期四\21點3.花藥-花粉分步培養(yǎng)：先將花藥接種在液體培養(yǎng)基（含F(xiàn)icoll）上進行漂浮培養(yǎng)，花粉可以從花藥中自然釋放出來，散落在液體培養(yǎng)基中。及時用吸管將花粉從液體培養(yǎng)基中取出，植板于瓊脂培養(yǎng)基上，使其處于良好的通氣環(huán)境中，可使花粉植株的誘導率大大的提高。當前第20頁\共有43頁\編于星期四\21點4.條件培養(yǎng)利用條件培養(yǎng)基，即預先培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基進行花藥培養(yǎng)，可使花藥培養(yǎng)效率大大提高。當前第21頁\共有43頁\編于星期四\21點五、培養(yǎng)條件1.溫度：離體花藥對溫度的敏感性比較高。2光照：不同植物對光照的要求不同。當前第22頁\共有43頁\編于星期四\21點六、花粉植株的倍性及染色加倍花藥植株的倍性：花藥培養(yǎng)中，由花粉發(fā)育成的花粉植株并不像所期望的那樣全是單倍體，其中不但有二倍體還有多倍體和非整倍體?；ǚ壑仓曛谐霈F(xiàn)自然加倍主要是由于核內(nèi)有絲分裂造成的，核內(nèi)有絲分裂與接種花粉的時期、培養(yǎng)基中植物生長物質的種類和水平、花粉植株的發(fā)生方式及愈傷組織繼代培養(yǎng)時間的長短有直接關系。當前第23頁\共有43頁\編于星期四\21點倍性鑒定的方法有：1、染色體直接計數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。

2、間接鑒定（1）掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀）主要測定葉片單個細胞中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細胞形態(tài)學鑒定法單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關性。（3）植株形態(tài)學鑒定法葉片保衛(wèi)細胞大小、單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結實。當前第24頁\共有43頁\編于星期四\21點（4）雜交鑒定法自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。（5）分子標記鑒定包括生化標記（如同工酶標記）和分子標記（如RFLP、RAPD、AFLP等）當前第25頁\共有43頁\編于星期四\21點染色體加倍單倍體植株不能正常結實，只有經(jīng)過染色體加倍、育性才能恢復，而且在遺傳上是純合的，為了獲得更多的二倍體植株，除了有意識的利用上述自發(fā)的核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生二倍體外，還需要通過人工方法使單倍體植株染色體加倍，成為純合二倍體。當前第26頁\共有43頁\編于星期四\21點染色體加倍（一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株的莖段進行培養(yǎng)，誘導愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植株。（二）化學試劑誘變有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素誘導（1）浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）生長錐處理秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。（3）培養(yǎng)基處理將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。2、除草劑誘導（毒性小，引起植株的變異幾率?。┊斍暗?7頁\共有43頁\編于星期四\21點當前第28頁\共有43頁\編于星期四\21點當前第29頁\共有43頁\編于星期四\21點水稻花藥栽培當前第30頁\共有43頁\編于星期四\21點水稻花藥栽培當前第31頁\共有43頁\編于星期四\21點7.2花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)：即小孢子培養(yǎng)，是將花粉粒從花藥中分離出來進行培養(yǎng)技術，花粉培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)一樣都是獲得植物單倍體的有效方法。當前第32頁\共有43頁\編于星期四\21點一、材料的選擇和預處理和花藥培養(yǎng)類似，供體植株的基因型和栽培條件、花粉的發(fā)育時期和預處理等，對花粉培養(yǎng)能否成功有著重要的影響。影響因素：1.不同植物及同一植物不同基因型材料在同樣的實驗條件下，花粉培養(yǎng)的誘導頻率差異很大。2.供體植物的生理狀態(tài)對花粉的胚胎發(fā)生也有很大的影響。一般從發(fā)育健壯的植株上取花粉進行培養(yǎng)效果較好。3.花粉培養(yǎng)還受供體植株生長條件的影響，如溫度、光照等因素。選擇合適的花粉發(fā)育時期是提高植株花粉誘導頻率的重要因素。不同作物適宜的花粉發(fā)育時期不同。和花藥培養(yǎng)一樣，適當?shù)念A處理可以提高花粉培養(yǎng)的成功率。當前第33頁\共有43頁\編于星期四\21點二、花粉的分離所得花粉需滿足以下條件：1.花粉的成活率較高2.發(fā)育整齊3.要達到一定數(shù)量4.無菌、無雜質分離的方法有：1.擠壓法2.散落法3.器械法（1）小型攪拌器（2）超速旋切機如果需要，可以把以上三種方法分離所得的花粉進一步用密度梯度離心純化當前第34頁\共有43頁\編于星期四\21點二、花粉的培養(yǎng)方法1.培養(yǎng)基和花藥培養(yǎng)類似，花粉培養(yǎng)中多使用過濾除菌液體培養(yǎng)基，其中的銨態(tài)氮濃度一般比較低，通常加入一些有機氮源。一般情況下，對于花粉胚狀體發(fā)生所需的植物生長物質，不同種類、濃度效果不同，不同供體材料的反應也不一致。當前第35頁\共有43頁\編于星期四\21點二、花粉的培養(yǎng)方法2.培養(yǎng)方法當前第36頁\共有43頁\編于星期四\21點7.2花藥和花粉培養(yǎng)中的白化苗問題植株白化苗現(xiàn)象當前第37頁\共有43頁\編于星期四\21點一、白化苗產(chǎn)生的因素1.外因1）光照條件的影響2）

溫度條件的影響

3）其他環(huán)境因素的影響2.內(nèi)因1）葉綠素等光合色素合成酶基因的突變2）質體分化和葉綠體發(fā)育相關基因突變3）其他內(nèi)源因素一些非光合系統(tǒng)蛋白的編碼基因突變、葉綠體蛋白轉運受阻和核-基質組之間的相互作用及不親和性都可能引起百花現(xiàn)象的發(fā)生。當前第38頁\共有43頁\編于星期四\21點二、白化苗的控制通過對花粉發(fā)育時期、預處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調控。當前第39頁\共有43頁\編于星期四\21點二、白化苗的控制通過對