第五章基因工程載體

載體類型

基因工程所用的載體都經(jīng)過人工重新構(gòu)建細(xì)菌質(zhì)粒載體噬菌體衍生載體Cosmid載體（粘粒）噬菌體M13衍生載體Phagemid載體酵母質(zhì)粒載體真核病毒載體1當(dāng)前第1頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)克隆載體與表達(dá)載體克隆載體：攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞并使外源DNA大量擴(kuò)增。表達(dá)載體：表達(dá)外源基因編碼的蛋白質(zhì)，載體克隆位點(diǎn)的上游應(yīng)含有啟動(dòng)子，下游含有轉(zhuǎn)錄終止序列。2當(dāng)前第2頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)第一節(jié).質(zhì)粒Plasmid質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞染色體外、能自主復(fù)制的小分子環(huán)狀雙鏈DNA分子。又稱為cccDNA（CovalentlyClosedCircularDNA）。3當(dāng)前第3頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)野生型質(zhì)粒的大小一般在2-200Kb

基因工程常用質(zhì)粒在2-4Kb之間質(zhì)粒并不是細(xì)菌生長所必須的，但可為宿主執(zhí)行一定的遺傳功能，如抗生素的抗性、重金屬離子的抗性、細(xì)菌毒素的分泌等。4當(dāng)前第4頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)質(zhì)粒

(plasmid)5當(dāng)前第5頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)1.質(zhì)粒類型:

嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid) 1-5個(gè)拷貝/細(xì)胞

松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid):

數(shù)十個(gè)/細(xì)胞 質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)有時(shí)與寄主的種類有關(guān)。6當(dāng)前第6頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)2.質(zhì)粒載體必須具備的條件（1）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。7當(dāng)前第7頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)（3）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。8當(dāng)前第8頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)質(zhì)粒性質(zhì)不相容性（不親和性）具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒，不能穩(wěn)定的存在于同一受體細(xì)胞內(nèi)，這種現(xiàn)象稱作質(zhì)粒的不相容性。

9當(dāng)前第9頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)3.質(zhì)粒載體的選擇性標(biāo)記抗菌素抗性新陳代謝特性10當(dāng)前第10頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

抗菌素名稱抗菌素作用方式宿主菌抗性機(jī)理氨芐青霉素（Amp）干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成

編碼-內(nèi)酰胺酶,切割A(yù)mp

-內(nèi)酰胺環(huán)氯霉素（Cml）抑菌劑,與50S結(jié)合,干擾編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶,使氯霉素

蛋白質(zhì)合成乙?；Щ羁敲顾兀↘an）殺菌劑,與70S結(jié)合,mRNA編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,

發(fā)生錯(cuò)讀修飾Kan失活鏈霉素（Sm）殺菌劑,與30S結(jié)合,mRNA編碼特異修飾酶

發(fā)生錯(cuò)讀四環(huán)素（Tet）抑菌劑,與30S結(jié)合，阻止編碼特異蛋白,修飾細(xì)菌膜蛋白合成結(jié)構(gòu),阻止Tet通過細(xì)胞膜11當(dāng)前第11頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因12當(dāng)前第12頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)常用的質(zhì)粒載體

1.

pBR322

2.ｐＢＶ220載體是我國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所自行構(gòu)建的大腸桿菌溫控表達(dá)載體。

3.

pUC系列:如pUC118、pUC119，兩者之間的差別在于多克隆位點(diǎn)不同。13當(dāng)前第13頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)14當(dāng)前第14頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)15當(dāng)前第15頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)16當(dāng)前第16頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)4.融合表達(dá)載體如GST融合表達(dá)系統(tǒng)。載體中含有細(xì)菌的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。當(dāng)基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為GST與目的蛋白的融合體。17當(dāng)前第17頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)融合表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)表達(dá)效率高融合蛋白易純化：抗GST的蛋白質(zhì)作為特異性抗體，用親和層析法從細(xì)胞裂解液中純化出融合蛋白；可從融合蛋白中分離出單一的外源蛋白質(zhì)GST與外源蛋白之間克隆上蛋白酶的切割位點(diǎn)，可用適當(dāng)?shù)拿盖懈睢?/p>

18當(dāng)前第18頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)例如加裝一段編碼Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接頭片斷，該片斷可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割，從Arg后切開。目的蛋白中出現(xiàn)此種序列的可能性極小，因此該方法用途廣泛。19當(dāng)前第19頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)QIAexpress6His表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白質(zhì)的末端帶有6個(gè)組氨酸殘基，對(duì)帶有Ni離子的層析介質(zhì)有高度的親和力，易于純化。6個(gè)組氨酸殘基質(zhì)量小，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，無需切除。6個(gè)組氨酸殘基免疫原性差，重組蛋白可以直接用做抗原。20當(dāng)前第20頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

第二節(jié)噬菌體類

噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文名為Bacteriophage,簡稱phage。噬菌體可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但必須依賴寄主細(xì)胞才能復(fù)制生長。21當(dāng)前第21頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)噬菌體（bacteriophage,phage）噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。病毒的特性：個(gè)體微小，可以通過細(xì)菌濾器沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和核酸組成專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物可分為12個(gè)科22當(dāng)前第22頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)噬菌體的生物學(xué)性狀23當(dāng)前第23頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)噬菌體的生物學(xué)性狀形態(tài)個(gè)體小，需用電子顯微鏡觀察蝌蚪形、微球形和絲形Theblackbarsaresizebarsrepresenting100nm.24當(dāng)前第24頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)25當(dāng)前第25頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)26當(dāng)前第26頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

用作克隆載體的噬菌體有兩類：一類是λ噬菌體，另一類是M13噬菌體。野生型λ噬菌體經(jīng)過改造，已衍生出100多種克隆載體。λ噬菌體載體分為插入型和替換型(置換型)兩類。目前應(yīng)用較廣的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。

27當(dāng)前第27頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)λ噬菌體（lambdaphage)

λ噬菌體是可以感染細(xì)菌的病毒，是大腸桿菌的溫和型噬菌體。由外殼蛋白與一個(gè)48.5kb的雙鏈線狀DNA分子組成。經(jīng)過改造形成的λ噬菌體載體有較高的轉(zhuǎn)化效率。28當(dāng)前第28頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

在λ噬菌體DNA分子雙鏈的5’端，各有一段由12個(gè)核苷酸組成的互補(bǔ)的單鏈凸出序列，即通常所說的黏性末端。在寄主細(xì)胞內(nèi)，會(huì)通過黏性末端的互補(bǔ)作用，形成環(huán)型雙鏈DNA分子。這種由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)。（cos:cohensiveendsite)29當(dāng)前第29頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)3‘CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3’

在黏性末端的12個(gè)堿基中，有10個(gè)是GC。通過堿基配對(duì)線性分子環(huán)化起來，由此形成的雙鏈區(qū)，叫做cos位點(diǎn)。30當(dāng)前第30頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

λ噬菌體基因組含50余個(gè)基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因?qū)Ζ耸删w的生長不是必須的，可以被外源DNA片段取代。

λ噬菌體上有56種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，約300余切點(diǎn)。比如BamHI分別在第5505、22346、27972、34499和41732處有識(shí)別位點(diǎn)。

31當(dāng)前第31頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)λ噬菌體的生長途徑

λ噬菌體有溶原和溶菌兩種生長途徑。溶原生長途徑是指λ噬菌體的DNA整合在宿主染色體上，隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制。以原噬菌體的形式潛伏起來。一旦宿主細(xì)胞處于某種條件下時(shí)，λ噬菌體的DNA脫離染色體，重新進(jìn)入溶菌生長途徑。32當(dāng)前第32頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)溶菌生長是指λ噬菌體在宿主細(xì)胞中黏性末端連接，成為環(huán)形DNA分子，借用宿主細(xì)胞的體系，合成病毒包裝所需的外殼蛋白，新復(fù)制的λDNA與外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。宿主細(xì)胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，釋放出大量子代λ噬菌體顆粒，感染新的細(xì)胞。33當(dāng)前第33頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)34當(dāng)前第34頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)M13噬菌體單鏈DNA,基因組含6407個(gè)堿基.經(jīng)過基因改造后，形成M13mp系列?？扇菁{遠(yuǎn)大于自身基因組的外源DNA,(7倍).M13噬菌體感染細(xì)胞后,不裂解宿主細(xì)胞,但妨礙宿主細(xì)胞的生長,因此可見培養(yǎng)平板上的混濁噬菌斑.35當(dāng)前第35頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)噬斑36當(dāng)前第36頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)單鏈的M13噬菌體（＋）進(jìn)入受體菌后，以自身為模板，復(fù)制出互補(bǔ)鏈（－），成為雙鏈的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制型DNA。復(fù)制型DNA在細(xì)胞內(nèi)可達(dá)200個(gè)拷貝。此時(shí)，（＋）鏈被特異的蛋白質(zhì)阻斷，不再生成新的（－）鏈。只能生成新的（＋）鏈。（＋）鏈DNA被殼蛋白包裝組成病毒顆粒，擠出宿主細(xì)胞。37當(dāng)前第37頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)科斯質(zhì)粒載體（cosmid）

又稱粘粒載體，簡稱粘粒。環(huán)形雙鏈DNA分子，一般為4～6Kb。 該載體含有λDNA的cos序列（不少于280個(gè)bp）和pBR322質(zhì)粒的序列。該載體轉(zhuǎn)化效率高?？扇菁{高達(dá)45kb的外源DNA。以感染方式進(jìn)入宿主細(xì)胞,在宿主體內(nèi)象質(zhì)粒那樣復(fù)制.38當(dāng)前第38頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)粘粒載體可像質(zhì)粒一樣在細(xì)菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳動(dòng)物中繁殖。又能像λDNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。屬松弛型質(zhì)粒，拷貝數(shù)較多。39當(dāng)前第39頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)40當(dāng)前第40頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌與植物接觸時(shí)，這種質(zhì)粒會(huì)引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤，故名Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。Ti質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，200～250Kb之間。Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只是一小部分，約25kb，稱為T-DNA（transferDNA）。41當(dāng)前第41頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)T-DNA兩端各有一個(gè)25bp的正向重復(fù)序列，在不同的Ti質(zhì)粒中是高度保守的，該序列對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的。利用大腸桿菌質(zhì)粒與T-DNA的部分序列重組，構(gòu)建Ti質(zhì)?？寺≥d體，可用于植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。42當(dāng)前第42頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

第三節(jié)酵母細(xì)胞基因工程載體酵母是最簡單的單細(xì)胞真核生物。酵母可對(duì)表達(dá)的多肽鏈進(jìn)行加工和修飾，如二硫鍵的正確形成、糖基化、除去N－端的甲硫氨酸等。43當(dāng)前第43頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)酵母菌的克隆載體YIP酵母整合型質(zhì)粒YRP酵母復(fù)制型質(zhì)粒YEP酵母附加子型載體CIP酵母菌著絲粒型質(zhì)粒44當(dāng)前第44頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)上述質(zhì)粒均可在大腸桿菌和酵母菌中穩(wěn)定存在，即所謂的穿梭質(zhì)粒。這些質(zhì)粒含有兩種可供篩選的選擇性標(biāo)記。45當(dāng)前第45頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)YIp載體URA3乳清苷酸脫羧酶46當(dāng)前第46頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

酵母菌表達(dá)載體

1.選擇性標(biāo)志

當(dāng)使用大腸桿菌做為宿主細(xì)胞時(shí)，多使用抗生素抗性作為篩選標(biāo)志。由于酵母菌對(duì)許多抗生素不敏感，故需要其他的篩選標(biāo)志。

野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1（色氨酸）

這些基因可補(bǔ)償酵母菌細(xì)胞中某一種特定的代謝缺陷（營養(yǎng)缺陷）

47當(dāng)前第47頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)2.啟動(dòng)子含有可被RNA聚合酶II識(shí)別的酵母啟動(dòng)子

GAL、GAL10（半乳糖激酶）

PHO5（堿性磷酸酶）

ADH（醇脫氫酶）

TP1（丙糖磷酸異構(gòu)酶）

PGK（磷酸甘油酸激酶）

GAP（磷酸甘油醛脫氫酶）

SUC（蔗糖酶）48當(dāng)前第48頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)注釋：細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)豐度較高，如PGK（磷酸甘油酸激酶）、GAP（磷酸甘油醛脫氫酶），各占細(xì)胞總蛋白的5%，屬于高含量的蛋白質(zhì)，它們的啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子。49當(dāng)前第49頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)酵母分泌型表達(dá)載體這類載體可以使目的蛋白分泌到細(xì)胞外。載體內(nèi)除含有一般表達(dá)質(zhì)粒的必要成分外，還需有一個(gè)控制蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列。其編碼的多肽鏈叫做信號(hào)肽。信號(hào)肽內(nèi)多含疏水性氨基酸。50當(dāng)前第50頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)第四節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體51當(dāng)前第51頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)病毒侵入動(dòng)物細(xì)胞后，有兩種生長狀態(tài)

①溶細(xì)胞感染病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)合成自身的核酸和結(jié)構(gòu)蛋白，裝配成完整的子代病毒顆粒，釋放到細(xì)胞外，擴(kuò)大感染，宿主細(xì)胞因?yàn)榇x障礙而死亡。②整合性感染病毒核酸整合到宿主細(xì)胞的染色體中，隨細(xì)胞DNA的復(fù)制而擴(kuò)增。52當(dāng)前第52頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)病毒載體：（1）含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效啟動(dòng)子（2）在感染周期中能夠持續(xù)復(fù)制，達(dá)到很高的拷貝數(shù)。（3）控制自己復(fù)制的元件（4）有些載體可高效穩(wěn)定地整合到寄主基 因組上（5）外殼蛋白識(shí)別細(xì)胞受體，可將外源基 因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。53當(dāng)前第53頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)1.SV40病毒載體SV40：猿猴空泡病毒（Simianvacuolating virus40)

環(huán)型雙鏈DNA分子，含5243bp。優(yōu)點(diǎn)：1.感染率高；2.拷貝數(shù)高；3.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 高；缺點(diǎn)：1.宿主范圍窄；2.最終導(dǎo)致感染細(xì)胞死 亡； 3.制備耗時(shí)，成本較高。54當(dāng)前第54頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)SV40病毒載體的改建病毒的部分序列＋質(zhì)粒的部分序列如PSV2包括病毒的復(fù)制起始區(qū)、早期啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子序列、部分t抗原基因

pBR322的復(fù)制起始區(qū)、氨芐青霉素 抗性基因55當(dāng)前第55頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)

病毒-質(zhì)粒載體病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)+大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而成。例如：pC10＝早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)（多瘤病毒）＋質(zhì)粒pBR322的部分區(qū)段這種載體既可在大腸桿菌中復(fù)制，也可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，稱之為穿梭載體。56當(dāng)前第56頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)改造后的病毒優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：1.不需病毒顆粒的包裝過程，故可插入較大長度的DNA片段。2.不引起宿主細(xì)胞的裂解，可建立穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株。3.整合到宿主細(xì)胞的染色體中，重組基因不會(huì)丟失。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低于萬分之一。57當(dāng)前第57頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)受納細(xì)胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴細(xì)胞后，產(chǎn)生感染性病毒顆粒，并使宿主細(xì)胞裂解，這種感染稱為裂解感染，而猿猴細(xì)胞則稱為受納細(xì)胞。58當(dāng)前第58頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)非受納細(xì)胞：SV40感染倉鼠細(xì)胞后，不產(chǎn)生感染顆粒，病毒基因組整合到宿主細(xì)胞染色體上，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化（癌變），這種嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞為SV40病毒的非受納細(xì)胞。59當(dāng)前第59頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒。宿主范圍廣，感染動(dòng)物或人的細(xì)胞。感染效率高，理論上可達(dá)100％。具有強(qiáng)啟動(dòng)子。不引起宿主細(xì)胞的死亡，可以維持許多代存在問題：1.容量小，低于10kb。

2.可能引起細(xì)胞癌變。60當(dāng)前第60頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)腺病毒載體（AV）

線性雙鏈DNA病毒，經(jīng)過改造的腺病毒載體，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。

61當(dāng)前第61頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①基因組大，可插入大片段的外源基因，最多可達(dá)35kb；②可高效的感染不同類型的人體組織細(xì)胞；③進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)不整合進(jìn)宿主的基因組，僅瞬間表達(dá)。缺點(diǎn)①免疫原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；

②幾乎可感染所有的細(xì)胞，缺乏特異性。62當(dāng)前第62頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)腺相關(guān)病毒載體（AAV）：屬于非致病的微小病毒科家族的成員，只有依賴于輔助病毒才能繁殖。特點(diǎn)：基因組小，只有幾個(gè)kb；無致病性；免疫原性弱；裝載外源基因容量小，不超過5kb；制備過程復(fù)雜；63當(dāng)前第63頁\共有70頁\編于星期五\22點(diǎn)痘苗病毒載體：痘苗病毒是動(dòng)物病毒中最大的一種，與天花病毒有密切的親緣關(guān)系。長期被用作預(yù)防天花的疫苗。病毒基因組中有很大的非必需區(qū)（28kb），可以切除，代之以較大的外源基因，或者同時(shí)插入幾個(gè)外源基因，構(gòu)成多價(jià)疫苗。64當(dāng)前第64頁\共有70頁\編于星期五