基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)第四章 DNA的生物合成

第四章DNABiosynthesisDNA的生物合成本章主要內(nèi)容★

DNA復(fù)制的基本特性★

DNA復(fù)制的反應(yīng)體系★

DNA復(fù)制過(guò)程★

DNA損傷、突變和修復(fù)★逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶DNARNAprotein復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄RNA復(fù)制3DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)的載體遺傳分子生物學(xué)中心法則第一節(jié)

DNA復(fù)制的基本特性

BasicCharactersofDNAReplication復(fù)制(replication)

——指在生物體內(nèi)以親代DNA分子兩條鏈為模板，合成兩個(gè)子代DNA分子的過(guò)程DNA復(fù)制的基本特性

半保留復(fù)制

半不連續(xù)復(fù)制雙向復(fù)制特定的復(fù)制起點(diǎn)需要引物一、半保留復(fù)制

(semiconservativereplication)DNA復(fù)制時(shí)，親代DNA雙螺旋解開(kāi)成為兩條單鏈，各自作為模板，按照堿基配對(duì)規(guī)律合成一條與模板相互補(bǔ)的新鏈，形成兩個(gè)子代DNA分子。每一個(gè)子代DNA分子中都保留有一條來(lái)自親代的鏈。這種DNA復(fù)制的方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。含15N-DNA的細(xì)菌第一代細(xì)菌第二代細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基輕DNA沉降的位置重DNA沉降的位置中等密度DNA沉降的位置DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證明TGCACGTDNA的半保留復(fù)制ACGTAGCTGCACGTACGTAGCTGCACGTACGTAGCTGCACGTACGTAGC二、DNA復(fù)制的方向和方式模板DNA的閱讀方向是3’→5’新鏈的延伸方向是5’→3’PC3’5’ThedirectionofnewstrandPPPPPP3’5’GCTATTtemplatePGPAPTPAPAOH12MechanismofDNAreplicationDNA復(fù)制時(shí)堿基的配對(duì)規(guī)律：A=TG≡CDNA的復(fù)制泡及復(fù)制叉原核生物的DNA為環(huán)狀，復(fù)制時(shí)要在特定的復(fù)制起始點(diǎn)上開(kāi)始解鏈，形成“復(fù)制泡”，并向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉。復(fù)制叉復(fù)制叉親代的DNA復(fù)制叉的形成兩個(gè)子代的DNA分子三、半不連續(xù)復(fù)制領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)

岡崎片段(Okazakifragment)

領(lǐng)頭鏈隨從鏈岡崎片段復(fù)制的保真性新鏈的延伸過(guò)程嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)的規(guī)律，即A＝T，G≡CDNA聚合酶對(duì)堿基的選擇能力，能選擇與親代模板鏈正確配對(duì)的堿基進(jìn)入子鏈相應(yīng)的位置

校讀修正錯(cuò)配堿基，通過(guò)DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性，在堿基發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，及時(shí)切除并更換上正確堿基第二節(jié)

DNA復(fù)制的反應(yīng)體系ReactionSystemforDNAReplicationDNA復(fù)制的反應(yīng)體系組成有：①模板(template)，DNA的兩條單鏈均作為模板②主要的復(fù)制酶，DNAdependentDNApolymeraseorDDDP,DNApol④引物(primer)，是一段短的特殊RNA③底物(substrate)，dNTP⑤其他的酶和蛋白質(zhì)因子，包括拓樸異構(gòu)酶、解螺旋酶、DNA單鏈結(jié)合蛋白、引物酶、DNA連接酶等一、DNA聚合酶DNAdependentDNApolymerase，DDDP，或DNApol功能：5’→3’聚合活性外切活性5’→3’外切活性3’→5’外切活性3’5’5’3’5’→3’外切活性3’5’5’3’3’5’5’3’3’→5’外切活性3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’(一)原核生物DNA聚合酶Ecoli中的DNA聚合酶，已知有三種，分別為DNApolI，DNApolII，DNApolIII5’→3’聚合活性外切活性5’→3’外切活性3’→5’外切活性切除引物校讀作用DNA聚合酶I的校讀作用3′5′3′5′DNApolI的3′→5′外切活性錯(cuò)配堿基AGAGCTTAAGCGTGCGGTATGTCTCGAATTCGCACGCCAC種類(lèi)DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ分子組成單一多肽鏈不清10種亞基的不對(duì)稱(chēng)二聚體生物學(xué)活性（1）5′→3′聚合活性聚合活性低有聚合活性高（2）3′→5′外切酶活性有有有（3）5′→3′外切酶活性有無(wú)無(wú)功能①校讀作用無(wú)其他酶時(shí)發(fā)揮作用①主要的復(fù)制酶②修復(fù)填補(bǔ)②校讀作用E．coli中三種DNA聚合酶的比較DNApolⅢ的不對(duì)稱(chēng)異源二聚體結(jié)構(gòu)γ復(fù)合物核心酶核心酶DNA聚合酶種類(lèi)生物學(xué)功能DNA聚合酶α有引物酶活性，參與復(fù)制的引發(fā)過(guò)程DNA聚合酶β主要參與DNA的修復(fù)過(guò)程DNA聚合酶γ參與線(xiàn)粒體中DNA的復(fù)制DNA聚合酶δ是最主要的復(fù)制酶，參與鏈的延伸DNA聚合酶ε參與修復(fù)過(guò)程(二)真核生物DNA聚合酶二、DNA解螺旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、

單鏈DNA結(jié)合蛋白(一)DNA解螺旋酶(helicase)

每解開(kāi)一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP功能：使DNA雙鏈解開(kāi)成為單鏈現(xiàn)知為DnaB蛋白(二)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)功能：使DNA超螺旋旋松，理順超螺旋，便于DNA解鏈既能水解、又能連接磷酸二酯鍵特點(diǎn)：3233TopoisomeraseICutonlyonestrandofDNA,noATPneeded拓?fù)洚悩?gòu)酶ITopoisomeraseII34CuttwostrandsofDNA,ATPneeded拓?fù)洚悩?gòu)酶II

E.coli

的拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ亞型topoⅠDNAgyrase(topoⅡ)topoⅢtopoⅣ功能切斷DNA雙鏈中的一股，松弛后再封閉切斷DNA的雙股鏈，松弛后再封閉是否需要ATP不需要需要(三)DNA單鏈結(jié)合蛋白(DNAsinglestrandbindingprotein,DBPorSSB)功能：與解開(kāi)的DNA單鏈結(jié)合，穩(wěn)定并保護(hù)DNA單鏈

*防止單鏈重新形成雙螺旋，保持模板的單鏈狀態(tài)以便于復(fù)制*防止單鏈模板被核酸酶水解意義：三、引物酶和引發(fā)體(primase,primosome)引物酶，即DnaG蛋白，催化引物的生成引發(fā)體，由oriC，DnaA、DnaB、DnaC及DnaG組成

引物為一段短的RNA片段為什么需要引物？DNA聚合酶不能催化游離的dNTP聚合四、DNA連接酶(DNAligase)功能催化DNA分子中兩段相鄰單鏈片段的連接，但不能連接單獨(dú)存在的DNA單鏈DNA連接酶催化的反應(yīng)是耗能的，在真核生物中利用ATP供能，而在原核生物中則消NAD+DNA連接酶的作用真核生物原核生物第三節(jié)

DNA復(fù)制過(guò)程DNAReplicationProcess生物體在細(xì)胞分裂之前要完成DNA復(fù)制。DNA復(fù)制是一個(gè)連續(xù)酶促反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程，大致分為復(fù)制的起始復(fù)制的延伸復(fù)制的終止

一、原核生物DNA復(fù)制的基本過(guò)程(一)復(fù)制的起始原核生物DNA復(fù)制起始以形成引發(fā)體(primosome)，催化引物(primer)的生成為標(biāo)志。1.DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶松解超螺旋，解螺旋酶使DNA雙鏈解開(kāi)SSB3535DnaBDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶DnaADnaC

復(fù)制是在一個(gè)特定的起始點(diǎn)上開(kāi)始，Ecoli的復(fù)制起始點(diǎn)oriC有特殊的堿基組成，四個(gè)9核苷酸組成的一致性序列TTATCCACA能被DnaA所識(shí)別及結(jié)合，在DanC的幫助下，解螺旋酶DnaB結(jié)合到該區(qū)，使DNA局部解鏈。GGATCCTGgnTATTAAAAAGAA[GATCTnTTTATTTAGAGATCTGTTnTATT101150200nTTtAAGATCAAnnnnnTggnAAGGATCncTAnCTGTGAATGATCGGTGA201250TtnAnCAgAGTTATCCAC]AntnGAnnGcnn-GATGTGATCTCTTATTAGGATCGnnntnnnnTGTGGATAAgnngGATCCnnTCCTGGnCCGTATAAGCTGGGATCAnAATGngGGnTTATACACAgCtCAAAAncgnACaaCGGTTaTTCTTTGGATAACTACCGGTTGATCCAAGCTT50151100151E.coli的oriC結(jié)構(gòu)。剪頭所示為四個(gè)9核苷酸序列，黑括弧內(nèi)所示為245個(gè)堿基組成的最小復(fù)制起始區(qū)。GATC為BglII內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。SSB3535DnaBDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶DnaCDnaA含有解螺旋酶(DnaB)、DnaA、DnaC、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱(chēng)為引發(fā)體。

2.引發(fā)體的組裝及引物的形成3535引物酶在引發(fā)體引物酶的作用下，催化合成一段短的RNA作為引物

(二)復(fù)制的延伸當(dāng)引物合成后，DNA聚合酶可在引物的3’-OH基礎(chǔ)上逐步催化脫氧核苷酸的聚合，以3’-5’磷酸二酯鍵相連，使新鏈不斷向前延伸。3535DNApolIII本質(zhì)：

3’-5’磷酸二酯鍵的不斷生成DNA復(fù)制的延伸過(guò)程領(lǐng)頭鏈的合成(DNApolIII)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(DNAgyrase)隨從鏈的合成RNA引物RNA引物引物酶隨從鏈的合成(DNApolIII)解螺旋酶復(fù)制叉的前進(jìn)方向(三)復(fù)制的終止從一個(gè)親代DNA分子到兩個(gè)子代DNA分子的合成結(jié)束細(xì)菌的環(huán)狀DNA從兩個(gè)復(fù)制叉向前復(fù)制延伸，在同一個(gè)終止點(diǎn)上結(jié)束兩個(gè)復(fù)制叉上的延伸速度可以是不同的E.coli的復(fù)制起始點(diǎn)在82位點(diǎn)，終止點(diǎn)在32位點(diǎn)E.Coli基因組結(jié)構(gòu)復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制終止點(diǎn)82位點(diǎn)32位點(diǎn)

在復(fù)制的終止階段，要切除引物，并填補(bǔ)引物切除后留下的空隙。對(duì)于E.coliDNA的復(fù)制，主要由DNApolI發(fā)揮這一作用。最后，由DNA連接酶將不連續(xù)的片段進(jìn)行連接，從而成為完整的DNA分子。二、滾環(huán)復(fù)制一些簡(jiǎn)單的環(huán)狀DNA如質(zhì)粒、病毒DNA或F因子經(jīng)接合作用轉(zhuǎn)移DNA時(shí)，采用滾環(huán)復(fù)制(rollingcyclereplication)滾環(huán)復(fù)制時(shí)，親代雙鏈DNA的一條鏈在復(fù)制起點(diǎn)處被切開(kāi)，5'端游離出來(lái)。DNApolⅢ可以將脫氧核苷酸聚合在3'-OH端。外環(huán)的5’-端不斷向外側(cè)伸展，作為模板指導(dǎo)另一條鏈的合成延伸DNA的滾環(huán)復(fù)制三、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)真核生物DNA復(fù)制也比原核生物的復(fù)制過(guò)程復(fù)雜得多，在細(xì)胞的S期完成DNA復(fù)制真核生物DNA復(fù)制為多點(diǎn)雙向復(fù)制，有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，形成多個(gè)復(fù)制子真核生物的DNA復(fù)制與核小體裝配同步進(jìn)行真核生物的DNA末端有端粒結(jié)構(gòu)，由端粒酶催化形成真核生物的DNA復(fù)制叉及其復(fù)制過(guò)程

真核生物DNA的多點(diǎn)雙向復(fù)制

兩個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)之間的一段序列為一個(gè)復(fù)制單位，也稱(chēng)復(fù)制子四、端粒DNA及端粒酶由特殊DNA即短的GC豐富區(qū)重復(fù)序列(repeatsofshort,GC-richsequences)及蛋白質(zhì)組成，覆蓋在染色體兩個(gè)末端的龐大結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為端粒端粒的概念對(duì)維持染色體DNA的穩(wěn)定，防止DNA鏈的縮短有重要意義

端粒的功能端粒的特征序列端粒的重復(fù)序列有種屬特異性，在四膜蟲(chóng)為T(mén)TGGGG/AACCCC；在脊椎動(dòng)物包括人為T(mén)TAGGG/AATCCC

端粒酶(telomerase)是一種由RNA及蛋白質(zhì)組成的復(fù)合酶以端粒酶中的RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而延伸末端的DNA

人的端粒酶(telomerase)組成端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

第四節(jié)

DNA損傷、突變和修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepairDNA突變(DNAmutation)或基因突變是指DNA分子中有堿基的改變，也稱(chēng)DNA損傷(DNADamage)DNA堿基的改變可發(fā)在復(fù)制過(guò)程中，或在某些理化因素作用下引起DNA突變一、引起DNA損傷的因素1.物理因素，如紫外線(xiàn)，輻射等紫外線(xiàn)可使DNA分子中相鄰的兩個(gè)嘧啶堿基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)形成嘧啶二聚體Turnto672.化學(xué)因素

包括一些藥物、化學(xué)試劑、食品添加劑、工業(yè)排出廢物、汽車(chē)排放廢氣、某些農(nóng)藥等

亞硝酸鹽或亞硝胺類(lèi)可使堿基發(fā)生突變，如胞嘧啶脫氨突變?yōu)槟蜞奏さ骖?lèi)烷化劑能使堿基或核糖被烷基化

苯并比類(lèi)使DNA中嘌呤堿基產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)

Ames試驗(yàn)是一種回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，用于新化學(xué)品、藥物遺傳毒性的初篩利用組氨酸依賴(lài)性鼠沙門(mén)氏菌為檢測(cè)菌株，受試物如有誘變性，可使回復(fù)突變菌落明顯增加，并有劑量依賴(lài)性3.生物因素某些病毒或噬菌體的感染，可導(dǎo)致基因的突變，與某些腫瘤或癌癥的發(fā)生密切相關(guān)乙肝病毒為噬肝細(xì)胞的部分雙鏈DNA病毒，可整合至宿主染色體DNA，其整合及表達(dá)產(chǎn)物均可引起宿主細(xì)胞基因突變及表達(dá)失常乙肝病毒感染人群發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)度為非感染人群的100倍以上

二、基因突變類(lèi)型1.點(diǎn)突變2.缺失、插入及框移突變3.重排DNA分子上的堿基發(fā)生錯(cuò)配稱(chēng)為點(diǎn)突變，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換包括多個(gè)堿基或一段核苷酸序列的缺失、插入，常導(dǎo)致翻譯的讀碼框架改變，稱(chēng)框移突變DNA分子中的某個(gè)片段從一位置轉(zhuǎn)到另一個(gè)位置，或不同DNA分子間DNA片段的轉(zhuǎn)移及重新組合

三、DNA損傷的修復(fù)即通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列酶系統(tǒng)的作用，消除DNA分子上的突變部位，使其恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)主要類(lèi)型光修復(fù)(lightrepair)切除修復(fù)(excisionrepair)重組修復(fù)(recombinationalrepair)SOS修復(fù)(SOSrepair)1.光修復(fù)(lightrepair)300～600nm范圍內(nèi)的光波可激活細(xì)胞內(nèi)的光修復(fù)酶(photolyase)，該酶能特異地識(shí)別共價(jià)交聯(lián)的嘧啶二聚體，斷裂兩個(gè)嘧啶環(huán)間形成的共價(jià)鍵，使二聚體解聚，恢復(fù)DNA原來(lái)的結(jié)構(gòu)Goto612.切除修復(fù)(excisionrepair)

(1)堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair，BER)

切除修復(fù)可分為堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)等方式，其基本過(guò)程包括識(shí)別、切除、修補(bǔ)和連接指切除和替換由內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)作用產(chǎn)生的DNA堿基損傷，DNA糖基化酶(DNAglycosylase)參與此過(guò)程DNA堿基切除修復(fù)(2)核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair,NER)原核細(xì)胞中，由UvrA、UvrB和UvrC蛋白形成ABC切除核苷酸酶復(fù)合物，在損傷點(diǎn)5′端第8個(gè)磷酸二酯鍵和3′端第15個(gè)磷酸二酯鍵切除包括損傷部位在內(nèi)的一段堿基，留下缺口由DNA聚合酶I和DNA連接酶來(lái)修補(bǔ)原核生物核苷酸的切除修復(fù)3.重組修復(fù)(recombinationalrepair)

當(dāng)DNA分子損傷來(lái)不及修復(fù)完善時(shí)所采用的修復(fù)機(jī)制人類(lèi)這種切除核苷酸酶活性由8～10個(gè)蛋白協(xié)同完成著色性干皮病基因(xereodermapigmentosumpomplementarygroup，XP)產(chǎn)物為XPA～XPG，ERCC系列有切除核苷酸酶活性XP產(chǎn)