蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系和新型溶栓藥物的設(shè)計與研制

蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系

和新型溶栓藥物的設(shè)計與研制分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室宋后燕2005-6-151蛋白質(zhì)分子構(gòu)效關(guān)系的研究遺傳信息傳遞的中心法則基因轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄信息RNA蛋白質(zhì)(表型)遺傳信息決定蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)制翻譯2蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的研究一級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)X射線晶體衍射分析多維核磁共振計算機(jī)模擬3蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)計算機(jī)模擬1.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的模型化：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的計算機(jī)化2.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的幾何優(yōu)化3.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)構(gòu)象分析4.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)搜索5.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)間相互作用(MolecularDocking)范德華作用靜電作用弱非鍵相互作用疏水作用4計算機(jī)描述分子結(jié)構(gòu)的表達(dá)方式碎片碼線性碼拓樸碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為計算機(jī)語言計算機(jī)作結(jié)構(gòu)分析和處理(最簡單、唯一的方式進(jìn)行表達(dá))5拓?fù)浯a利用圖論知識分子結(jié)構(gòu)數(shù)學(xué)圖原子(CHON)：結(jié)點(diǎn)不同原子用不同顏色表結(jié)點(diǎn)化學(xué)鍵：圖中的邊(單鍵、雙鍵、芳香鍵等不同鍵用不同顏色)6蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)模擬蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的查詢：如搜索分子力學(xué)計算分子動力學(xué)計算量子化學(xué)計算編碼方式不足以表達(dá)蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)7連接表：分子中所有原子、

鍵及其空間關(guān)系提供信息原子信息：類型電荷坐標(biāo)鍵信息：類型所連原子糖鏈金屬離子其他特殊結(jié)構(gòu)信息計算機(jī)工作站軟件連接表(PDB數(shù)據(jù)庫)(蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)圖)8蛋白質(zhì)分子模擬時常用算法1、分子力學(xué)方法(MolecularMechanics，MM)計算分子幾何構(gòu)型和能量原子設(shè)為大小不同橡皮球鍵設(shè)為長度彈簧蛋白質(zhì)分子成為間諧振動力學(xué)模型Hook定律計算原子勢能9能量函數(shù)計算：

一系列能量項的加和Etot＝Estr＋Ebend＋Etors＋Evdw＋Eelec＋……Etot

分子總能量Etors

兩面角扭轉(zhuǎn)能量Estr

鍵伸縮能量Evdw

范德華能量Ebend

鍵角扭轉(zhuǎn)能量Eelec

靜電能量102、分子動力學(xué)方法

(MolecularDynamics,MD)以分子力學(xué)為基礎(chǔ)設(shè)定勢能函數(shù)和力場按經(jīng)典牛頓力學(xué)運(yùn)動方程積分搜索蛋白質(zhì)分子系統(tǒng)的運(yùn)動和構(gòu)型空間(基本設(shè)定：無限空間的平均＝系統(tǒng)整體的平均或構(gòu)型空間的積分)常用積分算法：Verlet

積分Becman

算法Leap-Forq

算法11分子動力學(xué)方法用于：模擬多肽、蛋白質(zhì)或低聚糖、寡糖的分子空間構(gòu)型計算晶體(固相)或溶液中(液相)蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)型12分子動力學(xué)用于構(gòu)象搜索時：用勢能函數(shù)的梯度ΔiF

表示Fi隨機(jī)產(chǎn)生初速度以原子的初始坐標(biāo)為起點(diǎn)計算t時刻時原子位置運(yùn)動速度新構(gòu)象給定時間內(nèi)多次迭代分子的優(yōu)勢構(gòu)象13力場和勢函數(shù)必須對每個待模建分子賦予一定力場。分子能量和分子結(jié)構(gòu)之間關(guān)系就是分子力場函數(shù)(勢函數(shù))。分子的能量看作分子內(nèi)各原子的空間坐標(biāo)的函數(shù)，即分子的能量隨分子構(gòu)型的變化而變化。分子力場函數(shù)由經(jīng)驗(yàn)公式計算。143、量子力學(xué)方法

(QuantumMechanic，QM)設(shè)定下列3個近似，計算分子軌道3.1.非相對論的量子力學(xué)(薛定諤方程)3.2.玻爾－奧本海默近似，將核運(yùn)動和電子運(yùn)動分開考慮3.3.軌道近似原子軌道組合后表示分子軌道蛋白質(zhì)分子中特殊結(jié)構(gòu)(金屬元素、糖、脂等)沒有合適力場參數(shù)選用量子力學(xué)計算法進(jìn)行優(yōu)化反應(yīng)過渡態(tài)極化狀態(tài)特殊電子云量子力學(xué)方法計算量和代價很大15分子力場函數(shù)構(gòu)成：1、鍵伸縮能(bond)2、鍵角彎曲能(bondangle)3、兩面角扭曲能(dihedralangel)4、非鍵相互作用(nonbondedinteraction)5、交叉能量項16分子能量和構(gòu)型函數(shù)：1、各種不同原子在不同成鍵狀況下的物理參數(shù)，鍵長、鍵角和兩面角等。2、這些參數(shù)來自實(shí)驗(yàn)或量子化學(xué)計算。17蛋白質(zhì)分子間相互作用：1、成鍵作用2、非成鍵作用18表：蛋白質(zhì)之間的4種非鍵相互作用(水溶液中)非鍵相互作用類型穩(wěn)定化能(kJ·mol–1)1.氫鍵作用中性基團(tuán)作用肽鍵作用8-128-122.靜電作用吸引排斥

42-213.疏水作用4-84.范德華作用419非鍵作用：力場方法計算

成鍵作用：量子化學(xué)計算20蛋白質(zhì)分子對接模建：低精密度構(gòu)象搜索對搜索到的構(gòu)象，用能量函數(shù)打分、分離、篩選對高分構(gòu)象作結(jié)構(gòu)優(yōu)化、能量評價判定分子對接模擬圖21蛋白分子對接：1、實(shí)時圖形對接2、自動對接22實(shí)時圖形對接：1、以對接的蛋白質(zhì)分子晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)2、計算結(jié)合部位各種表面性質(zhì)(靜電、氫鍵、疏水鍵分布)3、計算對接表面性質(zhì)4、按互補(bǔ)匹配原則，對接到結(jié)合部位計算機(jī)工作站分子模擬軟件分子對接容易模擬23自動對接：1、蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)計算和模擬(MS法)2、兩分子蛋白質(zhì)分子表面結(jié)構(gòu)匹配(口袋、凹槽······)3、匹配取向和優(yōu)化參考24實(shí)施例：1、葡激酶分子單體三維結(jié)構(gòu)模擬2、2分子葡激酶分子與微小纖溶酶對接25蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系研究中

運(yùn)用的理論和技術(shù)基礎(chǔ)計算機(jī)分子結(jié)構(gòu)和分子對接模擬晶體結(jié)構(gòu)分析(固相結(jié)構(gòu))核磁共振(液相結(jié)構(gòu))分子動力學(xué)計算：生物傳感器LC/MS、噬菌體展示26t-PA和新型t-PA27組織纖溶酶原激活劑

(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)

人體內(nèi)專一水解纖溶酶原形成纖溶酶，激活纖溶系統(tǒng)。纖溶功能在清除血管內(nèi)纖維蛋白，保持血液循環(huán)起重要作用。28Theroleoft-PAinfibrinolysist-PA

t-PA:PAIPAI-1PlasminogenPlasminPlasmin:Anti-plasmin2-APFibrin

FibrinogenFibrin

ThrombinFibrinDegradationProducts29t-PA分子結(jié)構(gòu)30t-PA的指形區(qū)(F區(qū))t-PA分子1-50位氨基酸與纖維結(jié)合蛋白分子的指形區(qū)結(jié)構(gòu)同源性很高t-PA分子與纖維蛋白的作用不僅和F有關(guān)，和其他結(jié)構(gòu)域也有相互作用部分水解t-PA分子的N端，破壞指形區(qū)，導(dǎo)致t-PA分子失去與纖維蛋白的結(jié)合能力編碼指形區(qū)基因的表達(dá)產(chǎn)物也能競爭性的抑制t-PA與纖維蛋白的結(jié)合缺失指形區(qū)的t-PA(t-PAΔF)，仍具有與纖維蛋白親和力，而且t-PAΔF激活纖溶酶原的速率仍受纖維蛋白加速

31t-PA分子結(jié)構(gòu)32t-PA的表皮生長因子區(qū)(E區(qū))t-PA分子的51～91位氨基酸與人表皮生長因子的同源性很高E區(qū)存在肝細(xì)胞膜受體識別的結(jié)構(gòu)與肝細(xì)胞膜受體結(jié)合，從血液中消除t-PA缺失E區(qū)的t-PA，血液內(nèi)半衰期延長33t-PA分子結(jié)構(gòu)34t-PA的三角區(qū)K1

和K2個三角區(qū)()，氨基酸殘基92～173，180～261組成。Kl

和K2

都與纖溶酶原分子、凝血酶原分子的三角區(qū)有同源性。K2

區(qū)是t-PA分子與纖維蛋白分子結(jié)合部位，比F更為重要。K2

特異的單抗與t-PA結(jié)合后，t-PA失去了與纖維蛋白結(jié)合的能力；含完整的K2

的t-PA酶解片段，對纖維蛋白的親和力。35t-PA分子結(jié)構(gòu)36t-PA的輕鏈由276-527位氨基酸組成，與胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶有很高的同源性含有t-PA的活性中心，即His322、Asp371、Ser478輕鏈具有激活纖溶酶原的活力輕鏈特異的單抗特異地與t-PA的輕鏈結(jié)合，并抑制其活性輕鏈cDNA

表達(dá)產(chǎn)物，也有t-PA活性，t-PA水解纖溶酶原由輕鏈決定t-PA的活性受PAI抑制用DFP處理后的t-PA分子不能再和PAI結(jié)合

PAI和t-PA的結(jié)合位點(diǎn)：K296-R29937

t-PA作為基因工程溶栓藥物的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：非異源蛋白高效溶栓特異性催化血栓中纖溶酶原，溶解血栓中纖維蛋白缺點(diǎn)：

t1/2短4-6min

劑量大50-100mg

血管再栓塞(5-25%)

價格昂貴38t-PA分子結(jié)構(gòu)改造的策略降低t-PA的血漿清除速率；增強(qiáng)纖維蛋白特異性；降低血漿抑制劑PAI對t-PA的抑制作用；增加t-PA分子穩(wěn)定性39實(shí)現(xiàn)

t-PA改造的方法定點(diǎn)突變?nèi)笔蛔內(nèi)诤系鞍?01.Reteplase

t-PA缺失突變的產(chǎn)物缺失突變指形區(qū)，生長因子樣區(qū)和

K1三角區(qū)含野生型t-PAK2三角區(qū)，輕鏈結(jié)構(gòu)域15060例隨機(jī)比較r-PA與rt-PA溶栓治療

AMI(1997)30天內(nèi)死亡率30天內(nèi)腦卒中大出血顱內(nèi)出血R-PA7.43%1.67%0.72%0.91%rt-PA7.22%1.83%0.82%0.88%NSNSNSNS(1)血漿半衰期延長2-20倍，溶栓效率提高3-5倍。(2)r-PA用大腸桿菌表達(dá)，廉價，試用方便，易于推廣，產(chǎn)品已經(jīng)上市，競爭力強(qiáng)。(3)不良反應(yīng)與rt-PA比較無統(tǒng)計學(xué)上差別。41PrimaryStructureofr-PA422.TNK-tPA

野生型t-PA點(diǎn)突變產(chǎn)物(1)K1結(jié)構(gòu)域替換一個氨基酸，形成一個新的糖基化位點(diǎn)。(2)K1結(jié)構(gòu)域替換一個氨基酸，去除一個原有的糖基化位點(diǎn)。(3)輕鏈結(jié)構(gòu)域中替換四個氨基酸。逃逸PAI-I的抑制作用。

TNK-tPA

rt-PA

血漿t1/2(min)173-4

纖維蛋白特異性＋＋＋＋體外溶栓速度＋＋＋體內(nèi)溶栓速度＋＋＋

PAI-1抗性＋＋－再梗塞＋＋＋43PrimaryStructureofTNK-tPA44TNK-tPA

的不良反應(yīng)

死亡率(%)非顱內(nèi)大出血(%)顱內(nèi)出血(%)

TNK-tPA6.2 4.7 0.9(n=8641)

rt-PA6.2 5.9 0.9(n=8488)

453.Lanoteplase(NPA)

野生型t-PA缺失突變體，去除了指形區(qū)，表皮生長因子區(qū)，并修飾了K1

三角區(qū)內(nèi)的糖基化位點(diǎn)。由中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)。

NPArt-PA

半衰期t1/2(min)373-4

冠脈再通率(％)5746

出血等不良反應(yīng)＋＋＋NPA可一次性靜脈用藥464.AFA-UK－－導(dǎo)向溶栓藥物纖維蛋白單抗Fab

片段單鏈UK(快速與血栓結(jié)合)(溶栓作用)血漿

t1/2

顯著延長，溶栓效率比rt-PA和Scu-PA提高9倍。血漿t1/2(min)凝血時間

AFA-UK61.3正常

Scu-PA5.0延長

rt-PA4.3延長47導(dǎo)向溶栓藥物針對不同的需要可以選擇不同的單抗選用抗纖維蛋白單克隆抗體選用抗血小板膜受體

GPIIb/IIIa、GMP-140等的單克隆抗體針對富含凝血酶的新鮮血栓，則可選用抗凝血酶單抗作為導(dǎo)向載體48葡激酶和新型葡激酶49Crystalofr-Sak

50CrystalStructureofr-Sak

513DModelingStructureofmPlg

52MolecularDockingofSakandmPlg53DimerStructureofr-Sak

54ReducingSDS(A)andzymography(B)analysisofstoredwt-Sak55

HydrophobicSideofr-Sak56AllergicreactionofguineapigsafterimmunizedbySak

Groupsn＋

－

%wt-Sak201