12微生物檢驗(yàn)標(biāo)本采集、檢測與報(bào)告分析-

微生物檢驗(yàn)標(biāo)本采集、檢測與報(bào)告分析

三亞市人民醫(yī)院感控科

主任技師程黛麗

201108131本文著者程黛麗：主任技師，在職研究生工作單位：海南省三亞市人民醫(yī)院通訊地址：三亞市解放三路558號電話政編碼：572000傳真：88392148Email:121707046@201108132

為了保證醫(yī)療質(zhì)量和醫(yī)療安全，衛(wèi)生部持續(xù)加大對醫(yī)院感染管理督查力度，各類新規(guī)范、新標(biāo)準(zhǔn)和指南相繼出臺都是在指導(dǎo)我們的工作、規(guī)范我們的行為怎么與微生物的戰(zhàn)爭。所以我們感控人在與病原微生物的“博弈”中，怎樣立于不敗之地？那就是要了解微生物、研究微生物、打擊微生物、局部消滅微生物、繼而有效預(yù)防和控制醫(yī)院感染！201108133

微生物培養(yǎng)是一種用人工方法使細(xì)菌生長繁殖的技術(shù)。細(xì)菌在自然界中分布極廣，數(shù)量大，種類多，可造福人類，也可成為致病因素。201108134微生物檢驗(yàn)的思路與原則1.確保臨床標(biāo)本可靠。2.全面了解機(jī)體正常菌群。3.保證檢驗(yàn)質(zhì)量、快速準(zhǔn)確提供信息。4.微生物學(xué)定性、定量和定位分析并結(jié)合病情。5.加強(qiáng)與臨床聯(lián)系201108135正常菌群：人自出生后，外界的微生物就逐漸進(jìn)入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種腔道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，存在著對人體無害的微生物群（細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體等）。它們與宿主的長期進(jìn)化過程中，微生物群的內(nèi)部及其與宿主之間互相依存、互相制約，形成一個能進(jìn)行物質(zhì)、能量及基因交流的動態(tài)平衡生態(tài)系統(tǒng)習(xí)慣稱之為正常菌群。正常菌群大部分是長期居留于人體的又稱為常居菌，也有少數(shù)微生物是暫時寄居的，稱為過路菌。正常菌群？201108136正常菌群生理作用：

1.生物拮抗作用：正常菌群通過粘附和繁殖能形成一層自然菌膜，是一種非特異性的保護(hù)膜，可促使機(jī)體抵抗致病微生物的侵襲及定植，而對宿主起到一定程度的保護(hù)作用。正常菌群除與病原菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和空間位置外，還可通過其代謝產(chǎn)物及產(chǎn)生抗生素、細(xì)菌素等起作用。正常菌群是人體防止外襲菌侵入的生物屏障。

2.刺激免疫應(yīng)答：正常菌群釋放的內(nèi)毒素等物質(zhì)可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)保持活躍狀態(tài)，是非特異免疫功能的一個不可缺少的組成部分。

3.合成維生素：有些微生物能合成維生素，如核黃素、生物素、葉酸、吡哆醇及維生素K等，供人體吸收利用。

4.降解食物殘?jiān)耗c道中正常菌群可互相配合，降解未被人體消化的食物殘?jiān)?，便于機(jī)體進(jìn)一步吸收。

201108137在一定條件下，正常菌群也能使人患病：①由于機(jī)體的防衛(wèi)功能減弱，引起自身感染。例如皮膚粘膜受傷（特別是大面積燒傷）、身體受涼、過度疲勞、長期消耗性疾病等，可導(dǎo)致正常菌群的自身感染；②由于正常菌群寄居部位的改變，發(fā)生了定位轉(zhuǎn)移，也可引起疾病。例如大腸桿菌進(jìn)入腹腔或泌尿道，可引起腹膜炎、泌尿道感染。因此，這些細(xì)菌稱為條件致病菌。在正常情況下，人體和正常菌群之間及正常菌群中各細(xì)菌之間，保持一定的生態(tài)平衡。如生態(tài)平衡失調(diào)，使機(jī)體某部位的正常菌群各細(xì)菌的比例發(fā)生數(shù)量和質(zhì)量上的變化，稱為菌群失調(diào)。菌群失調(diào)的常見誘因主要是濫用抗生素、同位素、激素、患有慢性消耗性疾病時腸道、呼吸道、泌尿生殖道的功能失常也是重要原因。去除誘因后可使菌群復(fù)常，也有長期失調(diào)難于逆轉(zhuǎn)的情況。201108138空氣中的細(xì)菌：

空氣中的微生物分布種類和數(shù)量因環(huán)境不同有所差別?？諝庵形⑸飦碓从谌诵蠛粑赖娘w沫及地面飄揚(yáng)起來的塵埃。由于空氣中缺乏營養(yǎng)物及適當(dāng)溫度，細(xì)菌不能繁殖，且常因陽光照射和干燥作用而被消滅。只有抵抗力較強(qiáng)的細(xì)菌和真菌或細(xì)菌芽胞才能存留較長時間。室內(nèi)空氣中的微生物比室外多，尤其是人口密集的公共場所、醫(yī)院病房、門診等處，容易受到帶菌者和病人污染。如飛沫、皮屑、痰液、膿汁和糞便等攜帶大量的微生物，可嚴(yán)重污染空氣。某些醫(yī)療操作也會造成空氣污染，如高速牙鉆修補(bǔ)或超聲波清潔牙石時，可產(chǎn)生微生物氣溶膠；清掃及人員走動塵土飛揚(yáng)也是醫(yī)院空氣中微生物的來源。室內(nèi)空氣中常見的病原菌有腦膜炎奈瑟氏菌、結(jié)核桿菌、溶血性球菌、白喉?xiàng)U菌、百日咳桿菌等?？諝庵形⑸镂廴境潭扰c醫(yī)院感染率有相應(yīng)的關(guān)系。201108139微生物檢驗(yàn)負(fù)責(zé)工作：病原學(xué)診斷（鑒定結(jié)果）藥物的敏感試驗(yàn)（藥敏結(jié)果）環(huán)境器械與微生物學(xué)調(diào)查保證醫(yī)院內(nèi)消毒、滅菌的質(zhì)量細(xì)菌學(xué)分型試驗(yàn)，追蹤感染源2011081310檢驗(yàn)標(biāo)本的采集與處理對感染性疾病進(jìn)行病原檢查和鑒定，須通過采集病人標(biāo)本，經(jīng)系列實(shí)驗(yàn)，才能獲得明確的病原學(xué)診斷。標(biāo)本質(zhì)量的好壞直接影響診斷結(jié)果的正誤，不當(dāng)?shù)臉?biāo)本可導(dǎo)致假陽性、假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此在標(biāo)本采集、送檢、保存等各個環(huán)節(jié)都要規(guī)范操作，嚴(yán)格控制，是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提?！?011081311標(biāo)本采集的一般原則早期（適時）采集無菌采集根據(jù)目的菌的特性用不同的方法采集采集適量標(biāo)本安全采集2011081312如：痰液篩選的標(biāo)準(zhǔn)為痰液涂片鏡檢，鱗狀上皮細(xì)胞<10個/低倍視野和白細(xì)胞＞25個／低倍視野或鱗狀上皮細(xì)胞：白細(xì)胞≤1：2.5，進(jìn)行培養(yǎng)才具有較大診斷意義。2011081313重視病毒、真菌和寄生蟲引起的醫(yī)院感染！病毒（如輪狀病毒、諾如病毒、SARS病毒等）和真菌以及寄生蟲（如肺孢子蟲和弓形體等）已被證明是醫(yī)院感染的重要病因。需要實(shí)驗(yàn)室人員抓住引起感染的重要微生物的特征，而且通過培養(yǎng)和其他方法鑒定出來。2011081314醫(yī)院感染常規(guī)監(jiān)測

與臨床微生物檢驗(yàn)的區(qū)別采樣用的培養(yǎng)基不同；標(biāo)本的接種不同；消毒劑需用中和劑，醫(yī)院感染常規(guī)監(jiān)測標(biāo)本一般需計(jì)數(shù)；報(bào)告的方式不同；2011081315根據(jù)不同樣本種類進(jìn)行培養(yǎng)基配制空氣培養(yǎng)：營養(yǎng)瓊脂物體表面、手：采樣液（生理鹽水）、營養(yǎng)瓊脂使用中的消毒液：含不同種類中和劑的采樣液、營養(yǎng)瓊脂無菌物品：營養(yǎng)肉湯內(nèi)鏡：含相應(yīng)的中和劑0.03mol/L，pH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）、營養(yǎng)瓊脂、中國藍(lán)、SS

供應(yīng)室清洗、消毒后的物品：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂透析液、透析用水：營養(yǎng)瓊脂→2011081316報(bào)告方式：空氣：cfu/m3物體表面、手：

cfu/cm2使用中的消毒液：cfu/ml內(nèi)鏡：cfu/鏡供應(yīng)室清洗、消毒后的物品：

cfu/件無菌物品：無菌生長（有菌則報(bào)告菌種）透析液、透析用水：cfu/ml2011081317細(xì)菌的檢測細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢測細(xì)菌的分離培養(yǎng)與接種技術(shù)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測與生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)細(xì)菌感染的血清學(xué)檢測細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢測2011081318細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢測：是細(xì)菌檢驗(yàn)中極為重要的基本方法之一，包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法。顯微鏡是觀察細(xì)菌形態(tài)所必備的基本工具。20110813192011081320病原學(xué)報(bào)告:當(dāng)引起醫(yī)院感染的病原體初步分離、鑒定后，應(yīng)該給臨床醫(yī)生或感染控制人員一個恰當(dāng)?shù)膱?bào)告。各細(xì)菌室應(yīng)采取快速檢測及分級報(bào)告制度：預(yù)報(bào)告初步報(bào)告確定報(bào)告2011081321預(yù)報(bào)告時限為2小時內(nèi)：將標(biāo)本直接涂片和革蘭氏染色，進(jìn)行顯微鏡檢查，報(bào)告標(biāo)本有無細(xì)菌存在，對染色性質(zhì)、細(xì)菌形態(tài)及數(shù)量作初步報(bào)告。20110813222011081323201108132420110813252011081326細(xì)菌的分離培養(yǎng)：

絕大多數(shù)細(xì)菌在適宜的條件下可以生長，細(xì)菌感染性患者標(biāo)本只有經(jīng)過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，才可對感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷并指導(dǎo)臨床用藥。因此，細(xì)菌培養(yǎng)對疾病的診斷、預(yù)防和治療具有重要的作用。2011081327初步報(bào)告時限為24小時：做標(biāo)本的直接藥敏試驗(yàn)，也可對18小時內(nèi)在平皿上生長出的細(xì)菌采用酶法快速生化、血清學(xué)試驗(yàn)，抗體檢測，微生物自動分析儀等進(jìn)行鑒定。2011081328培養(yǎng)基的種類基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基2011081329分離培養(yǎng)基的種類血平板巧克力血平板中國藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板麥康凱平板SS瓊脂血液增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯2011081330接種技術(shù)2011081331細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)各種酶類試驗(yàn)抑菌試驗(yàn)2011081332確定報(bào)告時限為72小時：根據(jù)細(xì)菌種類及生長速度不同除采用上述方式外，應(yīng)用生化發(fā)酵管、API系統(tǒng)等進(jìn)行終末鑒定，最終發(fā)出完整、確切的檢測報(bào)告。2011081333抗菌藥物敏感性試驗(yàn)意義可預(yù)測抗菌治療的效果指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇使用抗生素提供所選擇藥物的依據(jù)監(jiān)測耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染病流行病學(xué)，控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行2011081334細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)方法

稀釋法：試驗(yàn)菌的結(jié)果報(bào)告用MIC（ml∕ug）或用敏感（S）、中介（I）、和耐藥（R）報(bào)告。紙片瓊脂擴(kuò)散法(K－B)：對量取的抑菌圈直徑作出“敏感”、“耐藥”和“中介”的判斷。2011081335基本術(shù)語

敏感：表示檢測菌能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到濃度所抑制或殺滅耐藥：表示檢測菌不能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的濃度所抑制。2011081336中介第一、對某藥中介的菌株，其MIC值接近于該藥的血液濃度或組織液濃度，與敏感的菌株相比，用該藥治療效果不好；第二、對于那些可以在某些部位濃集的藥物或者可以較大使用劑量的藥物，中介意味著敏感；第三、中介作為一個緩沖域，用來防止由微小的試驗(yàn)誤差可能造成較大的錯誤結(jié)果，此點(diǎn)對于那些毒性較大的藥物尤為重要。2011081337MIC：最低抑菌濃度MBC：最小殺菌濃度MIC50：最低抑菌濃度百分之五十位數(shù)MIC90：最低抑菌濃度百分之九十位數(shù)2011081338多重耐藥菌：是指有多重耐藥性的病原菌。其定義為一種微生物對三類（比如氨基糖苷類、喹諾酮類、β－內(nèi)酰胺類）或三類以上抗菌藥物同時耐藥，而不是同一類三種。泛耐菌株：對幾乎所有類抗菌藥物耐藥。比如泛耐不動桿菌，對氨基糖苷、青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯、四環(huán)素、氟喹諾酮及磺胺類等耐藥。2011081339常規(guī)試驗(yàn)和特殊試驗(yàn)的藥物選擇：咨詢請教“醫(yī)院感染管理委員會”和“藥事管理委員會”，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)負(fù)責(zé)常規(guī)藥敏試驗(yàn)的藥物選擇，既考慮到醫(yī)院臨床醫(yī)生普遍的用藥習(xí)慣，又考慮到標(biāo)本中常出現(xiàn)的病原體。有時為流行病學(xué)的目的，需要做某種藥敏試驗(yàn)。2011081340定期和不定期的作細(xì)菌耐藥趨勢及病原學(xué)報(bào)告：應(yīng)定期（每半年一次）作出細(xì)菌敏感類型的總結(jié)，指導(dǎo)抗菌藥物的合理使用。可對本單位列入前三名的病原菌的分類和耐藥趨勢作追蹤調(diào)查,并不定期作出報(bào)告。2011081341藥敏統(tǒng)計(jì)的方法和內(nèi)容細(xì)菌藥敏統(tǒng)計(jì)的方法、內(nèi)容根據(jù)各地區(qū)、醫(yī)院條件而定。有條件的可通過微機(jī)聯(lián)網(wǎng)，既能分門別類，也能隨需隨調(diào)。無條件的則通過手工操作，進(jìn)行資料收集、整理、統(tǒng)計(jì)、分析、反饋。2011081342藥敏統(tǒng)計(jì)并反饋的項(xiàng)目1、各科室、各感染部位細(xì)菌的分布及排位。2、下述耐藥菌分離率：耐甲氧西林的的葡萄球菌(MRS)；耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)；對萬古霉素敏感性降低的葡萄球菌；耐萬古霉素腸球菌(VRE)；耐亞胺培南的腸桿菌；耐青霉素的肺炎球菌(PRP)；耐頭孢曲松的淋病奈瑟菌；耐多種藥物的結(jié)核分枝桿菌(MDR-TB)；

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耐氨芐西林的流感嗜血桿菌；產(chǎn)超廣譜酶的大腸和肺炎克雷伯菌；高產(chǎn)Ampc酶的陰溝桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌；多重耐藥的銅綠假單胞菌、不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌。

3、真菌的分離率。

4、各細(xì)菌對各類藥物敏感或耐藥比例。

2011081344流行預(yù)報(bào):

微生物實(shí)驗(yàn)室一個關(guān)鍵責(zé)任，是作為發(fā)現(xiàn)感染控制問題的早期預(yù)警系統(tǒng)。臨床微生物室發(fā)現(xiàn)某病區(qū)同時或在較短時間內(nèi)有同種菌感染達(dá)3例以上時應(yīng)及時通知院感科，并協(xié)助進(jìn)行病原學(xué)檢測與保留菌株做同源性鑒定。2011081345實(shí)驗(yàn)室記錄：

實(shí)驗(yàn)室記錄是感染監(jiān)測的重要工具。實(shí)驗(yàn)室記錄應(yīng)包括：標(biāo)本的來源、收集時間、病人的確診、病房和病原體的鑒定結(jié)果以及藥敏試驗(yàn)等。記錄保存的時間一般認(rèn)為至少應(yīng)保存18個月。細(xì)菌分型、菌種的保存。2011081346環(huán)境微生物學(xué)檢測方法①空氣；②醫(yī)務(wù)人員手；③物體表面；④使用中消毒劑；⑤無菌物品；⑥消毒滅菌效能監(jiān)測；⑦透析用水和透析液；⑧內(nèi)窺鏡消毒滅菌效果的監(jiān)測；⑨醫(yī)院污水的監(jiān)測。2011081347可疑傳染源和傳播媒介：水、食物、食具、各種診療器械、藥液、輸液及注射器械、與病人密切接觸的各種生活用物、密切接觸病人的醫(yī)護(hù)人員和陪伴者的手。2011081348輸血反應(yīng)后血制品的培養(yǎng)輸血反應(yīng)通常是由于能在低溫下生長的細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素引起的。應(yīng)立即停止輸血、并檢查所輸?shù)难杭拜斞b置。若肯定是血制品的細(xì)菌污染，那么必須對存放血制品的冰箱、房間及其他可疑環(huán)節(jié)進(jìn)行培養(yǎng)，另外應(yīng)抽病人的靜脈血做培養(yǎng)。2011081349輸液器材及液體的培養(yǎng)對與菌血癥有關(guān)的輸液治療所用的針頭、導(dǎo)管、輸液器、液體、瓶塞以及某些接頭部分都要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，同時還需要采集病人血標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。由于某些感染是由于商品污染的結(jié)果造成的，因此在病案中和實(shí)驗(yàn)室的記錄中都應(yīng)記載其商品批號、廠家等有關(guān)資料。2011081350確保實(shí)驗(yàn)室的生物安全

導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室感染的主要原因：1.檢驗(yàn)標(biāo)本中含有大量的、種類繁多的病原體；2.操作時形成的微生物氣溶膠；3.檢驗(yàn)器材、儀器和環(huán)境可能被污染；2011081351實(shí)驗(yàn)室生物安全主要

涉及“硬”、“軟”兩個方面的問題。硬件方面:主要是對實(shí)驗(yàn)室實(shí)行生物安全分級（BSL-1—BSL-4）設(shè)置和裝備；對微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全的要求WHO要求微生物實(shí)驗(yàn)室要達(dá)到2級生物安全等級。

軟件方面:主要是嚴(yán)格規(guī)范管理。但是軟件管理要比硬件建設(shè)艱難很多。軟件管理最重要的是“兩個到位”:實(shí)驗(yàn)室管理到位，人員培訓(xùn)到位。2011081352醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生規(guī)范

手衛(wèi)生效果的監(jiān)測方法

采樣時間：在接觸患者、進(jìn)行診療活動前采樣。2011081353

采樣方法：被檢者五指并攏，用浸有含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液浸濕的棉拭子在雙手指曲面從指跟到指端往返涂擦2次，一只手涂擦面積約30c㎡，涂擦過程中同時轉(zhuǎn)動棉拭子；將棉拭子接觸操作者的部分剪去，投入10ml含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液試管內(nèi)，及時送檢。另有壓印法。

2011081354檢測方法：將采樣管在混勻器上振蕩20秒或用力振打80次，用無菌吸管吸取1.0ml待檢樣品接種于滅菌平皿，每一樣本接種2個平皿，平皿內(nèi)加入已溶化的45℃～48℃的營養(yǎng)瓊脂15ml～18ml，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，置36℃±1℃溫箱培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。菌落總數(shù)計(jì)算方法：細(xì)菌菌落總數(shù)（cfu/cm2）=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2）2011081355醫(yī)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測

室內(nèi)空氣消毒效果的監(jiān)測方法

采樣的時間：選擇消毒處理后與進(jìn)行醫(yī)療活動操作前進(jìn)行采樣。

2011081356采樣方法根據(jù)其采樣原理分為平板暴露法、微生物采樣器法。平板暴露法采樣高度距地面1.5m（80-150cm）；布點(diǎn)方法，室內(nèi)面積≤30㎡,設(shè)內(nèi)、中、外對角線三點(diǎn)。室內(nèi)面積>30㎡,設(shè)四角及中央5點(diǎn)，均距墻壁1m。將普通營養(yǎng)瓊脂平板或血平板（直經(jīng)9cm）放在室內(nèi)各采樣點(diǎn)處，采樣時將平板蓋打開，扣放于平板旁，暴露5分鐘，蓋好立即送檢。↓2011081357檢測方法將采樣平板置37℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)并鑒定細(xì)菌。單克隆抗體潛血災(zāi)光Ab法2011081358遺傳學(xué)分類法DNAG+Cmol%測定核酸同源值測定核蛋白體堿基序列測定2011081359核酸同源值測定（分子雜交法）彌補(bǔ)G+Cmol%測定法的不足方法：變性解鏈—將兩種DNA混合—保溫復(fù)性—鑒定雙螺旋結(jié)合率

同一菌：100%同一菌種，同一亞種：80～90%同一菌種，不同亞種：60～70%同一菌屬，不同菌種：20～60%2011081360

與實(shí)驗(yàn)室有關(guān)的造成院內(nèi)感染假爆發(fā)的原因：標(biāo)本在采集過程中被污染；標(biāo)本在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中被污染；標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室處理過程中被污染；培養(yǎng)基、溶液或其他試劑、設(shè)備和儀器、使用不適宜的方法和技術(shù)等被污染。2011081361“三定一結(jié)合”的采用

臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意：醫(yī)院感染病人中常見的是條件致病菌，病原學(xué)診斷時，要進(jìn)行定性、定量和定位分析并結(jié)合病情。定位：指微生物群存在的生態(tài)空間。定性：指對微生物群落中各種群的分離鑒定。定量：指微生物的數(shù)量。2011081362常見標(biāo)本的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)：

尿、痰、組織標(biāo)本的定量培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到規(guī)定的數(shù)值時，則可判斷為感染的病原菌。尿培養(yǎng)≥105cfu/