酶工程制藥技術

酶工程制藥技術第一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)酶工程概論一、酶的特性二、酶工程的研究內容三、酶工程的研究進展及應用第二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二酶的定義和分類酶的定義----酶是生物體內具有生物催化功能的生物大分子，包括蛋白質和核酸等。酶的分類----分為6大類

1、氧化-還原酶

2、轉移酶

3、水解酶

4、裂合酶

5、異構酶

6、連接酶（合成酶）第三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二酶的特性1、專一性強2、催化效率高3、反應條件溫和4、酶活性的調控機制復雜

醛糖還原酶的活性中心第四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二酶的來源（一）來源類別（二）利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點（三）各種能夠生產(chǎn)酶的微生物

蚯蚓含蚓激酶，對心血管疾病有較好的治療效果第五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（一）來源類別1、酶作為生物催化劑普遍存在于動物、植物、微生物中，可以直接從生物體中分離提純而獲得，早期酶的生產(chǎn)多是以動植物為主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前還受到試劑、設備條件的限制。3、利用動物、植物細胞和組織培養(yǎng)方法來生產(chǎn)酶，由于周期較長、成本較高，也存在一定難度。4、利用微生物生產(chǎn)酶制劑。第六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（二）利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點（1）能夠生產(chǎn)酶的微生物種類繁多，有較大的選擇余地。（2）微生物繁殖快、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)方法簡便，培養(yǎng)過程容易控制，（3）微生物具有較強的適應性，能夠培育出新的高產(chǎn)菌株。第七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（三）各種能夠生產(chǎn)酶的微生物1、氧化-還原酶（1）葡萄糖氧化酶 （來源于霉菌）（2）D氨基酸氧化酶 （來源于霉菌、腎臟）（3）尿激酶 （來源于酵母菌、腎臟）（4）過氧化氫酶 （來源于細菌、霉菌、紅血球）（5）近氧化物酶 （來源于植物）2、轉移酶（1）轉氨基酶 （來源于細菌、動物肝臟）（2）核苷磷酸轉移酶 （來源于細菌）3、水解酶4、裂合酶5、異構酶第八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、水解酶脂肪酶 （來源于細菌、霉菌、胰臟）

5`-磷酸二酯酶 （來源于霉菌）

淀粉酶 （來源于細菌、霉菌、胰臟、麥芽）

果膠酶 （來源于細菌、霉菌）

纖維素酶 （來源于霉菌、蘑菇）

半纖維素酶 （來源于霉菌）

溶菌酶 （來源于細菌、雞卵白）

蜜二糖酶 （來源于霉菌）

乳糖酶 （來源于細菌、霉菌）

轉化酶 （來源于細菌、酵母）

透明質酸酶 （來源于細菌、動物睪丸）

凝乳酶 （來源于霉菌、小牛胃、羊胃）

天冬酰胺酶 （來源于細菌）

脲酶 （來源于豆科植物）

青霉素?；? （來源于細菌、霉菌）

氨基?；? （來源于細菌、霉菌、牛腎臟）

橙皮苷酶 （來源于霉菌）

蛋白酶 （來源于霉菌、放線菌、動物內臟、植物瓜果）第九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二裂合酶和異構酶4、裂合酶天冬氨酸-β-脫羧酶 （來源于細菌）β-酪氨酸酶 （來源于細菌）延胡索酸酶 （來源于細菌）谷氨酸脫羧酶 （來源于細菌）5、異構酶氨基酸消旋酶 （來源于細菌、霉菌、酵母）葡萄糖異構酶 （來源于細菌、放線菌

第十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二酶的生產(chǎn)菌種1、對生產(chǎn)菌種的要求2、目前常用的產(chǎn)酶微生物

第十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、對生產(chǎn)菌種的要求（1）產(chǎn)酶量高（2）不是致病菌（3）性能穩(wěn)定，不容易變異、退化、不易感染噬菌體。（4）能夠利用廉價的原料，發(fā)酵周期短、易于培養(yǎng)。第十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、目前常用的產(chǎn)酶微生物大腸桿菌---用來生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素?；浮ⅵ?半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黃曲霉）---用來生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；?、脂肪酶?？莶輻U菌---用于生產(chǎn)a-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶。啤酒酵母---用來生產(chǎn)轉化酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶。青霉菌---用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5`-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌---用于生產(chǎn)纖維素酶。根霉菌---用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶。鏈霉菌---用來生產(chǎn)葡萄糖異構酶。第十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件2、菌種的分離篩選3、菌種的變異誘導技術4、原生質體誘導實際生產(chǎn)例子第十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件（1）產(chǎn)酶促進劑（2）影響酶產(chǎn)量的各種因素（3）誘導劑和抑制劑第十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（1）產(chǎn)酶促進劑在酶制劑的生產(chǎn)過程中，如果添加少量的某種物質就能增加酶的產(chǎn)量，則這類物質就稱為產(chǎn)酶促進劑。產(chǎn)酶促進劑多數(shù)是酶的誘導物、或者是表面活性劑，常用的產(chǎn)酶促進劑有：（A）吐溫-80（B）脂肪酰胺磺酸鈉（C）聚乙烯醇（D）糖脂（E）乙二胺四乙酸（EDTA）第十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（2）影響酶產(chǎn)量的各種因素A、溫度---各種產(chǎn)酶微生物對于溫度的要求是各不相同的。細菌：35-37度霉菌：30度酵母菌：30-35度B、PH值---通過掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通過添加緩沖劑、能夠控制發(fā)酵液的PH值。C、通氣量（供氧量）訖今為止，產(chǎn)酶和微生物都是需氧性的微生物。在液體深層發(fā)酵中，微生物利用的氧必須是溶解于培養(yǎng)基中和溶解氧。空氣中的氧氣---培養(yǎng)基溶解氧---透過細胞膜進入原生質。精確測定時采用溶氧儀。D、攪拌---攪拌可將泡沫打碎、增加氧氣的溶解速度、加強了液體的湍流作用，有利于營養(yǎng)物質與菌體細胞的接觸，促進細胞新陳代謝。E、泡沫第十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二E、泡沫酶制劑發(fā)酵過程中泡沫較多。泡沫的存在會阻止CO2的排除、同時直接影響O2的溶解。排除常常采用：機械力消泡沫法、化學消泡劑消泡沫法。常用的消泡劑有：天然油類、礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、磷酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷等等物質。國內酶制劑工業(yè)常用的消泡劑為：甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）泡敵（聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油醚）第十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（3）誘導劑和抑制劑某些酶反應，當培養(yǎng)基中不存在誘導物質時，其酶的合成就受到抑制，而當添加誘導物質時，酶的合成就能順利進行，這類物質稱作誘導劑。使用某些酶的抑制劑常常能夠促進酶的合成，如在多粘芽孢桿菌的培養(yǎng)基中添加淀粉酶抑制劑S-AI，能增加淀粉酶的產(chǎn)量。在酶的生產(chǎn)中，加入適量表面活性劑，也能提高酶制劑產(chǎn)量，如用爪哇真青霉生產(chǎn)纖維素酶時，如果添加0.1%的吐溫-80，則纖維素酶的產(chǎn)量可提高4倍。第十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、菌種的分離篩選（1）含菌樣品質采集（2）富集培養(yǎng)（3）菌種純化

第二十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、菌種的變異誘導技術（1）采用物理、化學方法進行誘導物理方法----紫外線、X射線、γ-射線、高能電子、快速中子?；瘜W方法----亞硝基胍、亞硝酸。（2）采用基因工程技術進行誘導德國的生物技術人員，提取出大腸桿菌的青霉素酰化酶基因，通過質粒pBR233，克隆到宿主大腸桿菌中，新構建的工程菌，其產(chǎn)酶能力提高了50倍。在國內，有人將產(chǎn)生葡萄糖異構酶的放線菌基因，通過質粒pBR233，克隆到宿主大腸桿菌中，新構建的工程菌，其表觀活力提高了5倍。有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纖維素基因克隆到酵母菌中，一旦獲得成功，就能夠利用淀粉、纖維素為原料，以酵母菌作為載體，通過發(fā)酵來生產(chǎn)酒精。（3）采用原生質體融合技術進行誘導原生質體融合育種的頻率要高于普通雜交的方法。不同種屬之間也可進行融合。在曲霉與曲霉、青霉與青霉、鏈霉菌與鏈霉菌、芽孢桿菌與芽孢桿菌之間的融合應用較多。第二十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二4、原生質體誘導實際生產(chǎn)例子蛋白酶產(chǎn)生菌種之間的原生質體融合共分為7步：A、使用的親本菌株B、菌株標記的獲得C、原生質體的制備D、細胞的再生E、原生質的融合F、融合子的繼代培養(yǎng)、檢驗和生產(chǎn)性能第二十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二A、使用的親本菌株二親本為：（1）枯草桿菌AS1.398（2）地衣芽孢桿菌AS1.807

二者都是野生型，對利福平和鏈霉素敏感。第二十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二B、菌株標記的獲得采用紫外線進行誘變，篩選營養(yǎng)缺陷型菌株、和抗藥性菌株，經(jīng)過十代以上傳代，形成穩(wěn)定的突變菌株。第二十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二C、原生質體的制備二親本接種入完全培養(yǎng)基，37℃搖瓶培養(yǎng)20小時

↓

離心收集菌體，懸浮于0。55mol的NaCl溶液中

↓

經(jīng)4000r/min離心15分鐘，洗滌2-3次，離心，棄去上清液

↓

菌體細胞懸浮于SMM緩沖液中

↓

加入采用SMM液配制的溶菌酶1000單位/ml，置恒溫水浴溶解細胞壁，

定時取樣鏡檢，并用計數(shù)板計數(shù)。

↓

待原生質球形成之后，以4000-6000r/min離心2次，每次15分鐘，

洗滌2-3次、離心

↓

放于無菌蒸餾水中，使原生質體膨脹

↓

適當稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上

↓

32℃下、培養(yǎng)20小時

↓

得原生質體第二十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二D、細胞的再生取原生質體，放入0.55mol的NaCl溶液之中

↓

適當稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上

↓

32℃下、培養(yǎng)24小時

↓

得原生質體再生的細胞第二十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二E、原生質的融合取等量的二親本原生質體、加入SMM溶液混勻

↓

經(jīng)4000r/min離心25分鐘，棄上清液

↓

加入由SMM配制的、含30%的、分子量為6000的PEG2-4ml

在40℃下攪勻、保溫2-3分鐘。

↓

加入3-10倍量的SMM緩沖液

↓

取適量（0.1-0.25ml/皿）涂布到含有二種抗生素的高滲完全培養(yǎng)基上，

鏈霉素含量為2000單位/ml，

利福平含量為10單位/ml，

↓

32℃下、培養(yǎng)20-36小時

↓

得初步的原生質體融合子第二十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二F、融合子的繼代培養(yǎng)和檢驗和生產(chǎn)性能將初步的原生質體融合子在含有鏈霉素+利福平的平板培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，可以檢測出穩(wěn)定的原生質體融合子。融合菌株的生產(chǎn)性能比親株高出30%。

第二十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)藥用酶的生產(chǎn)一、激肽釋放酶二、雙鏈酶三、超氧化物歧化酶四、鏈激酶五、鏈道酶六、彈性酶七、胰酶八、含糖蛋白酶九、糜胰蛋白酶十、淀粉酶十一、菠蘿蛋白酶十二、β-半乳糖苷酶十三、天門冬酰胺酶十四、尿激酶第二十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二一、激肽釋放酶1、藥理功能----具有擴張血管的功能，并能提高血管通透性，起到改善血液循環(huán)的作用。2、臨床應用----治療動脈硬化、血管炎、四肢皮膚潰瘍。3、生產(chǎn)方法

（1）提取法生產(chǎn)----以豬的頷下腺為原料進行提取。

（2）提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進行提取。第三十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二二、雙鏈酶1、藥理作用----內含二種酶，二者合用可清除炎癥物、膿塊、瘀血，促進外傷傷愈合。

（1）為鏈激酶（SK）、又稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物的纖維部分。

（2）為鏈道酶（SD）、又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細胞2、臨床應用----治療血腫、膿腫、骨髓炎、創(chuàng)傷性感染、潰瘍。3、生產(chǎn)方法----細菌發(fā)酵法生產(chǎn)。第三十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二三、超氧化物歧化酶1、藥理作用----能專一性地清除人體內的超氧陰離子自由基。2、臨床應用----治療類風濕關節(jié)炎，自身免疫疾病、心肌缺血、抗衰老、斷肢再植、整形美容。3、生產(chǎn)方法

（1）提取法----從新鮮豬血中提取

（2）提取法----從玉米中提取第三十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二鏈激酶和鏈道酶四：鏈激酶鏈激酶（SK）稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物的纖維部分。生產(chǎn)方法----由β-溶血性鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)五：鏈道酶鏈道酶（SD）又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細胞。發(fā)酵法生產(chǎn)----由β-溶血性鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)。

第三十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二六、彈性酶1、藥理作用----能夠水解彈性蛋白、血纖維蛋白、血紅蛋白。2、臨床應用----用于治療高血脂、慢性支氣管炎、動脈硬化、高血壓、脂肪肝。3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進行提取。第三十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二七、胰酶1、藥理作用----其成份為胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。能夠消化淀粉、蛋白質、脂肪。2、臨床應用----助消化，增加食欲。3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進行提取。第三十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二八、含糖蛋白酶1、藥理作用----是一種蛋白質消化酶2、臨床應用----助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進行提取。第三十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二九、糜胰蛋白酶1、藥理作用----是一種蛋白質消化酶2、臨床應用----助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以牛羊的腸粘膜為原料進行提取。第三十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二十、淀粉酶1、藥理作用----是一種消化酶2、臨床應用----助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法

發(fā)酵法生產(chǎn)----以黃曲霉發(fā)酵生產(chǎn)。

第三十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二十一、菠蘿蛋白酶1、藥理作用----具有消炎、抗水腫的作用。2、臨床應用----治療炎癥、水腫、血腫、支氣管炎、肺之、乳腺炎、靜脈炎。3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以菠蘿的皮為原料進行提取。第三十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二十二、β-半乳糖苷酶1：藥理作用----消化酶，能夠消化乳糖2：臨床應用----適用于嬰兒乳糖消化不良。3：生產(chǎn)方法

發(fā)酵法生產(chǎn)----以毛霉（米曲酶）發(fā)酵生產(chǎn)。

第四十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二十三、天門冬酰胺酶（一）藥理作用和臨床應用1、藥理作用----對腫瘤細胞具有抑制作用。2、臨床應用----抗腫瘤制劑（二）生產(chǎn)方法

第四十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（二）生產(chǎn)方法發(fā)酵法生產(chǎn)----以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。

大腸桿菌種子級菌種

↓

加入玉米漿，發(fā)酵罐、37℃下培養(yǎng)7小時

↓

取發(fā)酵液，加入丙酮后壓濾

↓

濾餅風干，得干菌體

↓

加入硼酸緩沖液，PH=8、37℃下提取

↓

得提取液，加醋酸調節(jié)PH=4。3，

↓

得沉淀物，即為干粗酶

↓

加入甘氨酸，60℃熱處理30分鐘

↓

得酶溶液，加入聚乙二醇，在不同的PH值下進行精制

↓

得無熱源酶液

↓

凍干、無菌分裝

↓

得天門冬酰胺酶凍干制劑第四十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二十四、尿激酶1、藥理作用----是一種蛋白質水解酶，具有溶血作用和降血壓作用2、臨床應用----抗血栓3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以男性新鮮尿液為原料進行提取。第四十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第三節(jié)固定化酶工程一、酶和細胞的固定化二、固定化酶的制備技術三、固定化細胞的制備技術四、固定化生物反應器第四十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二一、酶和細胞的固定化（一）固定化酶的定義（二）固定化生物催化劑的特點（三）酶固定化的方法分類（四）細胞固定化的方法分類（五）固定化技術所用載體第四十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（一）固定化酶的定義固定化酶是指限制或者固定于特定空間位置的酶，具體來說，就是指經(jīng)過物理、化學方法處理，使酶變成不易隨水流失的固定化催化劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。酶可以采用經(jīng)過分離后高純度的提純酶、也可以是菌體細胞碎片上的酶系，甚至可以是死細胞上的酶。第四十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（二）固定化生物催化劑的特點（1）固定化酶屬于修飾酶，這種酶可以通過化學、生物、分子工程手段加以改良。（2）固定化酶的穩(wěn)定性很高，可以多次連續(xù)使用。（3）反應以后，產(chǎn)物中不含酶，易于純化。（4）反應條件易于控制，可實現(xiàn)連續(xù)化和自動控制。（5）酶的利用率高，酶的實際使用量較少。（6）固定化酶比水溶性酶更適合進行多酶反應。第四十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（三）酶固定化的方法分類1、載體結合法2、交聯(lián)法3、包埋法

第四十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、載體結合法（1）物理吸附法（2）離子結合法（3）共價鍵結合法

第四十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（1）物理吸附法A、物理吸附法的優(yōu)點：

（1）操作簡單

（2）可選用不同的吸附劑

（3）酶失活之后，載體可以再生B、物理吸附法的缺點：

（1）酶的最適吸附量無規(guī)律可尋

（2）酶與載體之間的吸附力不強，酶容易脫落。C、常用的吸附劑第五十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二C、常用的吸附劑活性炭

碳酸鈣----每克載體能吸附1mg酶蛋白。

纖維素

多孔玻璃

酸性白土

漂白土

高嶺石

氧化鋁

硅膠

膨潤土

羥基磷灰石

磷酸鈣

金屬氧化物----二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒，直徑為100-200um，每克載體能吸附17mg酶蛋白。

淀粉

谷蛋白

陶瓷

丁基葡聚糖凝膠

已基葡聚糖凝膠

單寧纖維素衍生物第五十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（2）離子結合法A、離子結合法的優(yōu)點----操作簡單、處理條件溫和，酶的活性中心不容易被破壞。B、離子結合法的缺點----載體和酶的結合力較弱、常常發(fā)生酶脫落的現(xiàn)象

C、常用的離子結合劑樹脂----陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、多糖類離子交換劑、合成高分子類離子交換劑。每克載體能吸附50-150mg酶蛋白。DEAE-纖維素Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-50第五十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（3）共價鍵結合法酶分子上的氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基與載體表面的反應基團形成共價鍵，因而將酶固定在載體上的方法。A、共價鍵結合法的優(yōu)點----酶與載體結合牢固，酶不會發(fā)生脫落。B、共價鍵結合法的缺點----操作復雜、反應條件苛刻，酶的活性中心會遭到部分性的破壞。C、共價鍵結合法的類別重氮化 迭氮化

酸酐活化法 酰氯法

異硫氰酸酯法 縮合劑法

溴化氰活化法 烷基化法紀

硅烷基化法第五十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、交聯(lián)法（1）交聯(lián)的優(yōu)缺點（2）交聯(lián)法的類別和內容（3）參與交聯(lián)的酶蛋白功能團和常用的交聯(lián)劑第五十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（1）交聯(lián)的優(yōu)缺點交聯(lián)法是采用雙功能、或者多功能試劑，使得酶與酶之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法?；鶊F之間的交聯(lián)通過共價鍵結合。交聯(lián)法的優(yōu)點----交聯(lián)后的酶活性較高交聯(lián)法的缺點----反應條件劇烈、酶的回收率低。第五十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（2）交聯(lián)法的類別和內容類別酶與酶交聯(lián)法酶與輔助蛋白交聯(lián)法吸附交聯(lián)法載體交聯(lián)法內容分子內交聯(lián)分子間交聯(lián)酶與輔助蛋白分子之間交聯(lián)酶與載體之間交聯(lián)第五十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（3）參與交聯(lián)的酶蛋白功能團和常用的交聯(lián)劑參與交聯(lián)的酶蛋白功能團N-末端的α-氨基賴氨酸的ε-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巰基組氨酸的咪唑基常用的交聯(lián)劑戊二醛雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸1、5-二氟-2、4-二硝基苯已二酰亞胺二甲酯第五十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、包埋法包埋法的優(yōu)點----不需要改變酶的高級結構，酶的回收率較高。包埋法的缺點----包埋酶容易導致酶的失活，包埋法只適用于小分子底物的反應過程，大分子底物由于無法進入凝膠，故不適用。包埋法分為三類

（1）凝膠包埋法

（2）微囊化包埋法

（3）纖維包埋法第五十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（1）凝膠包埋法凝膠包埋法也稱網(wǎng)格法，是指將酶包埋在高分子凝膠的細策網(wǎng)格之中。凝膠包埋法是目前因定化技術中用得最多的方法。所用的凝膠有：

聚丙烯酰胺

聚乙烯醇

光敏樹脂

淀粉

明膠

膠原

海藻膠（卡拉膠）

角叉菜膠第五十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（2）微囊化包埋法將酶包埋在高分子半透膜中的方法，稱為微囊化包埋法。微囊化固定化酶的優(yōu)點----微囊化固定化酶的直徑為幾微米到幾百微米之間的球狀體，其顆粒較小，有利于大分子底物進行反應。微囊化固定化酶的缺點----反應條件要求高，制備成本也較高。第六十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（3）纖維包埋法此法適用于大規(guī)模生產(chǎn)。纖維包埋法所形成的聚合物，每克能夠包埋1500mg的轉化酶，并且具有良好的穩(wěn)定性。制備時，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纖維素、聚氯乙烯）的有機溶劑（二氯甲烷）中進行乳化，

↓

然后將乳化液通過一多孔噴絲頭擠壓進凝結浴池中，形成纖維

↓

酶溶液便被包裹在纖維內

↓

將纖維編織成各種酶布，以適合反應器的要求。第六十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（四）細胞固定化的方法分類（1）交聯(lián)法（2）包埋法（3）選擇性熱變性法----此法專用于細胞固定化，是將細胞在適當溫度下處理，使其細胞膜蛋白質變性，但不使其酶變性，從而使酶固定于細胞內的方法。

第六十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（五）固定化技術所用載體1、固定化載體必須符合的條件（1）固定化過程不傳統(tǒng)引起酶變性。（2）對酸堿具有一定的耐受性。（3）具有一定的機械強度。（4）具有一定的親水性，并且具有良好的穩(wěn)定性。（5）具有一定的疏松網(wǎng)狀結構，顆粒均勻。（6）進行共價鍵結合時，具有可活化基團。（7）有耐受酶和微生物細胞的能力。（8）廉價易得。2、常用的固定化載體（1）物理吸附載體（2）離子吸附載體（3）包埋法吸附載體（4）共價鍵結合載體第六十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（1）物理吸附載體活性炭 碳酸鈣 纖維素漂白土 高嶺石 石英砂氧化鋁 硅膠 礬土膨潤土 膠棉 羥基磷灰石磷酸鈣凝膠 淀粉 谷蛋白陶瓷 二氧化硅 皂土煤渣 多孔玻璃 酸性白土金屬氧化物（二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒）丁基葡聚糖凝膠單寧纖維素衍生物已基葡聚糖凝膠第六十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（2）離子吸附載體陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂DEAE-纖維素TEAT-纖維素羧甲基纖維素DEAE-Sephadex—A50Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-50第六十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（3）包埋法吸附載體聚丙烯酰胺凝膠 三醋酸纖維素二醋酸纖維素 甲殼素硅膠 聚乙烯醇丙烯酸高取物 瓊脂瓊脂糖 光敏樹脂淀粉 明膠膠原 海藻膠卡拉膠 角叉菜膠第六十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（4）共價鍵結合載體纖維素 Sephadex——A200瓊脂 瓊脂糖苯胺多孔玻璃 對氨基苯纖維素聚丙烯酰胺 膠原尼龍 多聚氨基酸多孔玻璃珠 金屬氧化物第六十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二二、固定化酶的制備技術（一）固定化酶的制備（二）固定化酶的形狀和性質（三）固定化酶的活力測定方法

第六十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（一）固定化酶的制備1、固定化方法的選擇（1）固定化酶應用的安全性，應該附合藥用和食用標準。（2）固定化酶的穩(wěn)定性，能夠長期反復使用。（3）固定化酶的成本、水、電、氣、設備、勞務等費用。2、固定化酶的選擇----目前在工業(yè)化大生產(chǎn)經(jīng)常應用的有：（1）聚乙烯醇（2）卡拉膠（3）海藻膠。3、固定化酶制備技術第六十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、固定化酶制備技術（1）物理吸附法---將酶的水溶液與具有高度吸附能力的載體混合，然后洗去雜質和未吸附的酶，即得固定化酶。（2）離子吸附法---將解離狀態(tài)的酶溶液與離子交換基混合后，洗去雜質和未吸附的酶，即得固定化酶。（3）凝膠包埋法---將凝膠材料（卡拉膠、海藻膠、瓊脂及明膠）與水混合，加熱使之溶解，再降至其凝固點溫度，然后加入預保溫的酶溶液、混合均勻，最后冷卻凝固成型、即成固定化酶。（4）凝膠包埋聯(lián)合法---在進行聚丙烯酰胺包埋時，將酶、混合單體、交聯(lián)緩沖劑一起混合，再加入催化劑，在單體產(chǎn)生聚合反應形成凝膠的同時，將酶限制在網(wǎng)格之中，經(jīng)過破碎后就成為固定化酶。（5）脂質體包埋法---這是一種采用表面活性劑和磷脂酰膽堿等物質，形成液膜來包埋酶的方法。（6）纖維包埋法---即前面已經(jīng)講述的酶布包埋方法。（7）共價鍵結合法---實質上是一種酶與包埋劑之間的化學反應過程（8）界面沉降微囊包埋法（9）界面聚合微囊包埋法（10）交聯(lián)法第七十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（8）界面沉降微囊包埋法采用與水不相溶的、沸點比水低的有機相A。 ↓將酶液在有機相A中乳化、形成油包水的微滴。 ↓再在乳化液中加入溶于有機溶劑的高聚物B。 ↓再加入不能溶解高聚物B的另一種有機溶劑C。 ↓結果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成微囊型固定化酶。第七十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（9）界面聚合微囊包埋法含酶的、10%的血紅蛋白溶液+已甲叉二胺水溶液------充分混合

↓

加入1%的Span-85的氯仿-環(huán)已烷進行分散乳化，

↓

再加入溶于有機相的癸二酰氯，酶和載體在油-水界面上發(fā)生聚合反應，

↓

棄去上清液，加入Tween-20去乳化，

↓

洗去有機溶劑用未聚合的單體，

↓

將聚合物轉移到水相之中，就成微囊。

所制得的微囊直徑在1-300um之間，每1ml酶溶液可以制得2500cm2總表面積的微囊。第七十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（10）交聯(lián)法是指向酶液中加入多功能試劑，在一定的條件下使酶在分子內、或者在分子間形成網(wǎng)絡結構，最終形成固定化酶的技術。交聯(lián)法可以分為：（1）酶與輔助蛋白交聯(lián)法（2）吸附交聯(lián)法（3）載體交聯(lián)法。如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在PH=5.2-5.7、溫度為0℃的條件下，24小時即完成酶的固定化。第七十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（二）固定化酶的形狀和性質1、固定化酶的形狀2、固定化酶的性質3、酶穩(wěn)定性的變化第七十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、固定化酶的形狀固定化酶的形狀----酶膜、酶管、酶纖維、微囊、顆粒狀的固定化酶。（1）顆粒狀的固定化酶----又可分為酶珠、酶塊、酶片和酶粉。其制備方法簡單、顆粒比表面積大，轉化效率高，適用于各類反應器。（2）纖維狀的固定化酶----只適用于填充床式反應器。（3）膜狀的固定化酶----也稱為酶膜，其表面積大、滲透阻力小，可用于酶電極、破碎之后也可用于填充床反應器，目前已經(jīng)用于生產(chǎn)木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、氨基?；?、脲酶等。（4）管狀的固定化酶----其機械強度大，切短之后可用于填充床式反應器，也可組裝成列管式反應器。第七十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、固定化酶的性質（1）酶活力的變化----經(jīng)過固定化之后，酶的活力大都發(fā)生下降。（2）酶反應特性的變化----底物專一性，酶經(jīng)過固定化之后，由于位阻效應，其活性會下降。（3）最適PH值----酶經(jīng)過固定化之后，其最適PH值會發(fā)生變化。（4）最適溫度----酶經(jīng)過固定化之后，其空間結構更加穩(wěn)定，因此，其最適溫度也會提高。（5）米氏常數(shù)----改變不顯著。（6）最大反應速度----會產(chǎn)生一定的差異。第七十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、酶穩(wěn)定性的變化（1）操作穩(wěn)定性----當固定化酶的穩(wěn)定半衰期達到1個月以上時，就具有工業(yè)應用價值。

（2）貯藏穩(wěn)定性----固定化的胰蛋白酶在20℃保存數(shù)月，其活性不變。

（3）對熱穩(wěn)定性----由于加熱提高了反應速度，從而提高反應效率。

（4）對蛋白酶的穩(wěn)定性----大多數(shù)天然酶在經(jīng)過固定化之后，它們對于蛋白酶的耐受力均有大幅度提高。這在工業(yè)生產(chǎn)中是極為有利的。第七十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（三）固定化酶的活力測定方法在酶促反應中，其底物或者產(chǎn)物具有光吸收、旋光、電位差、熒光等變化，可以使用分光光度計進行直接測定。（1）分批測定法

固定化酶在攪拌、振蕩的情況下，每間隔一定時間取樣，過濾之后按常規(guī)方法測定。（2）連續(xù)測定法

從反應器中引出反應液到流動比色杯中，在分光光度計中進行連續(xù)測定。

或者通過測定反應過程中氧氣、NH4、電導率、消化系數(shù)來確定酶的活力。第七十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二酶活力測定儀器第七十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二三、固定化細胞的制備技術1、固定化細胞的制備2、固定化細胞的形狀和性質訖今為止技術上還沒有過關的原因：（1）細胞培養(yǎng)技術存在著難題。（2）固定化之后，細胞的生物學活性存在著障礙。（3）細胞固定方法上在套用酶固定化技術，但是細胞不同于酶的單分子蛋白質，技術共用難度很大。在此只能作為標題介紹，不宜展開。第八十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二四、固定化生物反應器1、酶反應器2、固定化反應器的類型和特點3、固定化反應器的選擇依據(jù)第八十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、酶反應器用于酶催化反應的裝置稱為酶反應器，它可用于溶液酶、也可用于固定化酶。第八十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、固定化反應器的類型和特點（1）間歇式攪拌反應罐（BSTR）（2）連續(xù)流動攪拌反應罐（CSTR）（3）填充式反應罐（PBR）（4）流化床反應器（FBR）（5）循環(huán)反應器（RCR）（6）連續(xù)流動攪拌—超濾膜反應器（CSTR/UF）（7）其它反應器第八十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（1）間歇式攪拌反應罐（BSTR）也稱為分批攪拌反應器。其特點是結構簡單、操作方便。其缺點是，經(jīng)過單一批次的反應之后，酶就隨著反應產(chǎn)物流失。主要用于游離酶反應。當前食品和飲料工業(yè)中常用這類反應器。其方法是將酶和底物一起加入到反應器中，控制反應溫度，當達到預期的轉化率時，隨即放料。第八十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（2）連續(xù)流動攪拌反應罐（CSTR）這是一種連續(xù)進料、連續(xù)出料的反應器。結構上與間歇式攪拌反應器基本相同。第八十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（3）填充式反應罐（PBR）屬于使用最普遍的反應器。主要用于固定化酶生產(chǎn)的反應器。固定化酶通常以各種形狀如球形、碎片、薄片、丸粒填充于反應層內。固定化酶所使用的載體有多也玻璃珠、珠狀離子交換樹脂、聚丙烯酰胺凝膠、二乙胺乙基葡聚糖凝膠，膠原蛋白薄膜片。填充式反應罐系統(tǒng)運轉時，底物按照向上流動的方向以恒定的速度通過反應床。第八十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（4）流化床反應器（FBR）在流化床反應器，底物溶液以足夠大的流速向上通過反應床。使得固體顆粒處于流化狀態(tài)，從而來增加反應效率。由于流化床反應器具有混合程度高，傳熱性能良好等特點，因此可以用來處理粘性較強的底物、或者用來處理含有固體顆粒的底物。第八十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（5）循環(huán)反應器（RCR）這種反應器是讓部分反應產(chǎn)物流出，流出物再與原始底物混合之后重新流入反應系統(tǒng)的方法。循環(huán)反應器能夠提高液體的流速，并能減少底物在固定化酶表面沉積，從而達到較高的轉化效率。當反應底物是不溶性物質時，可以采用循環(huán)反應器生產(chǎn)。第八十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二(6)鼓泡式反應器鼓泡式反應器(bubblecolumnreactor,BCR)是利用從反應器底部通入的氣體產(chǎn)生的大量氣泡，在上升過程中起到提供反應底物和混合兩種作用的一類反應器。也是一種無攪拌裝置的反應器。鼓泡式反應器可以用于游離酶和固定化酶的催化反應。在使用鼓泡式反應器進行固定化酶的催化反應時，反應系統(tǒng)中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應器。鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易,剪切力小，物質與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應中常用的一種反應器。例如氧化酶催化反應需要供給氧氣，羧化酶的催化反應需要供給二氧化碳等。第八十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二(6)膜反應器膜反應器（membranereactor,MR）是將酶催化反應與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應器?？梢杂糜谟坞x酶的催化反應，也可以用于固定化酶的催化反應。用于固定化酶催化反應的膜反應器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應器。膜反應器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應器。第九十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（7）連續(xù)流動攪拌-超濾膜反應器（CSTR/UF）連續(xù)流動攪拌-超濾膜反應器=連續(xù)流動攪拌反應器+超濾膜裝置。超濾膜被安裝在連續(xù)流動攪拌反應器的出口處，這種膜只允許反應產(chǎn)物、或者是未曾反應的底物通過，而分子量較大的酶就被截留在反應器中，從而實現(xiàn)酶的反復利用。第九十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二在CSTR（連續(xù)式攪拌罐）出口處設置一個超濾器?？梢詫⑿》肿赢a(chǎn)物與大分子酶和底物分開，有利于產(chǎn)物回收。該反應器適用于顆粒較細的固定化酶、游離酶和細胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。游離酶在膜反應器中進行催化反應時，底物溶液連續(xù)地進入反應器，酶在反應容器的溶液中與底物反應，反應后，酶與反應產(chǎn)物一起，進入膜分離器進行分離，小分子的產(chǎn)物透過超濾膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循環(huán)使用?；乇菊履夸浀诰攀?，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二（8）其它反應器淤漿式反應器滴流床反應器氣栓式流動反應器轉盤式反應器篩板反應器復合類反應器第九十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二各種酶反應器的特點反應器類型適用的操作方式適用的酶特點攪拌罐式反應器分批式,流加分批式連續(xù)式,游離酶固定化酶反應比較完全，反應條件容易調節(jié)控制。填充床式反應器連續(xù)式固定化酶密度大，可以提高酶催化反應的速度。在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。流化床反應器分批式流加分批式連續(xù)式固定化酶流化床反應器具有混合均勻，傳質和傳熱效果好，溫度和pH值的調節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對粘度較大反應液也可進行催化反應。第九十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二反應器類型適用的操作方式適用的酶

特點鼓泡式反應器分批式流加分批式連續(xù)式游離酶固定化酶鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質、傳熱效率高,適合于有氣體參與的反應。膜反應器連續(xù)式游離酶固定化酶清洗比較困難噴射式反應器連續(xù)式游離酶通入高壓噴射蒸汽，實現(xiàn)酶與底物的混合，進行高溫短時催化反應，適用于某些耐高溫酶的反應第九十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、固定化反應器的選擇依據(jù)（1）根據(jù)固定化酶的形狀來選擇。（2）根據(jù)底物的物理性質來選擇。（3）根據(jù)外界環(huán)境條件對于酶的穩(wěn)定性來選擇。（4）根據(jù)操作要求和固定化酶反應器的投資費用來選擇。第九十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二通常顆粒狀、片狀、膜狀或纖維狀固定化酶均可采用填充床反應器（PBR），而顆粒狀、粉末狀及片狀固定化酶均可使用于連續(xù)式攪拌罐（CSTR），膜狀固定化酶要用螺旋卷膜式反應器。在應用游離酶進行催化反應時，酶與底物均溶解在反應溶液中，通過互相作用，進行催化反應?？梢赃x用攪拌罐式反應器、膜反應器、鼓泡式反應器、噴射式反應器等?？扇苄缘孜镞m用于所有的反應器。難溶底物或者底物溶液呈膠體狀者，易堵塞柱床，可選用FBR。顆粒狀底物溶液可適用于CSTR。當反應過程需要控制溫度、調節(jié)pH時，選用CSTR更為方便。在反應器操作過程中，由于攪拌或液流的剪切作用，常會使酶從載體上脫落下來，或者由于磨損而使粒度變細，從而影響了固定化酶的操作穩(wěn)定性。第九十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)酶工程應用實例一、L-天門冬酸生產(chǎn)工藝二、固定化細胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸三、固定化酶法生產(chǎn)5`-復合單核苷酸注射液四、固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸五、r-氨基丁酸的生產(chǎn)工藝六、L-多巴的生產(chǎn)工藝第九十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二實例1、酶工程產(chǎn)品益生源，用于飼料添加劑第九十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第一百頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第一百零一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二例2、酶工程產(chǎn)品萬壽膠囊，用于補充人體營養(yǎng)物質第一百零二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二例3、生態(tài)復合酶制劑，用于改善環(huán)境第一百零三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二例4、酶工程藥品和化妝品原料天門冬酰胺酶注射劑Elspar(AsparaginaseVials)第一百零四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二藥品名稱天門冬酰胺酶;左旋門冬酰胺酶,愛施巴,L-天門冬酰胺酶,門冬酰胺酶英文名L-Asparaginase,ASP,L-ASP,Elspar,Asparaginase適應癥對急性粒細胞型白血病和急性單核細胞白血病也有一定療效。對惡性淋巴瘤也有較好的療效。其優(yōu)點是對于常用藥物治療后復發(fā)的病例也有效，缺點是單獨應用不僅緩解期短，而且很易產(chǎn)生耐藥性，故與其他藥物合并應用。對機體免疫有抑制作用，因而有人用來治療皮肌炎等。用量用法可用于靜注、靜滴、肌注和鞘內注射。一般劑量：每千克體重２０～５０００單位或每平方米體表面積１００００～１５０００單位，每周３～７次。以每日每千克體重５００～１０００單位較佳。亦可每周應用１次，每次每千克體重２５００單位，一般以３～４周為１療程?？倓┝繎鶕?jù)所用藥物的純度和毒性而定。靜注以等滲鹽水２０～４０ｍｌ稀釋，靜滴以５％葡萄糖液或等滲鹽水５００ｍｌ稀釋。注重事項1.大腸桿菌門冬酰胺酶含有內毒素，故可引起發(fā)熱現(xiàn)象。此外，還常有食欲減退、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應，有的病人有頭痛、頭昏、嗜睡、精神錯亂等。由于門冬酰胺酶能影響蛋白質的合成和干擾脂質代謝，有的病人有血漿蛋白低下，血脂質過高或過低，氮質血癥和肝功能損害。約１／３～１／２病人有骨髓抑制，表現(xiàn)為白細胞和血小板下降，有的病人可有貧血、凝血障礙、局部出血、感染等。有人報告有的病人有心血管系統(tǒng)癥狀、脫發(fā)、蛋白尿等，極少數(shù)病人且可發(fā)生胰腺炎。2.可引起過敏反應，故用藥前必須先用過敏試驗，如有紅腫、斑塊，則為過敏反應。有過敏史的病人應十分小心或不用。3.不同藥廠、不同批號的產(chǎn)品，其純度和過敏反應均有差異，使用時必須慎重。4.有致畸胎作用，故妊娠早期應禁用。5.肝、腎功能嚴重損害者忌用。6.溶解后不宜長時間放置，以免喪失活力。藥品規(guī)格注射用門冬酰胺酶：每支含１０００單位、２０００單位。第一百零五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二例5、膜反應器，用于污水處理第一百零六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第五節(jié)酶工程研究進展一、酶的化學修飾二、酶的人工模擬三、有機相中的酶反應四、基因工程酶的構建（略）第一百零七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二一、酶的化學修飾1、關于酶的化學修飾2、常用的化學修飾劑3、化學修飾方法4、修飾酶所具有的新特征

第一百零八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、關于酶的化學修飾（1）原因----但是由于酶是一種蛋白質，常常在應用過程中出現(xiàn)異體蛋白的抗原性、容易被水解、容易受抑制、在反應系統(tǒng)中半衰期較短等缺點。因此提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性就成為技術關鍵。（2）定義----酶的化學修飾就是在分子水平上，采用化學方法對酶進行改造，通過添加一些化學基團，或者采用具有生物相容性的大分子進行共價鍵聯(lián)接，從而改變酶分子性質的一種技術。第一百零九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、常用的化學修飾劑化學修飾劑的要求----具有較大的分子量，具有良好的生物相容性、具有水溶性，分子表面具有較多的反應基團。（1）糖以及糖的衍生物----右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝膠、聚乳糖。（2）高分子多聚物----聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚N-乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）。（3）生物大分子----肝素、血漿蛋白質、聚氨基酸。（4）雙功能試劑----戊二醛、二異硫氰酸、二胺類。（5）其它試劑----糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑。第一百一十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、化學修飾方法（1）修飾酶的功能基團----如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基。來提高穩(wěn)定性。（2）在酶分子內進行交聯(lián)、或者進行分子間的交聯(lián)----提高酶解能力、消除抗原性。（3）修飾酶的輔助因子----提高穩(wěn)定性。（4）使酶與高分子化合物相結合----提高穩(wěn)定性。第一百一十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二4、修飾酶所具有的新特征（1）對熱的穩(wěn)定性有所提高。（2）具有對抗各類失活因子的能力。（3）抗原性消除。（4）體內的半衰期有所延長。（5）最適PH值發(fā)生改變。（6）酶反應特性發(fā)生變化。（7）在人體組織中的分布能力發(fā)生變化，有利于被靶器官選擇性的吸收。第一百一十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二二、酶的人工模擬根據(jù)酶的作用原理，采用人工方法合成的，具有活性中心和催化反應作用的、非蛋白質結構的化合物，稱為人工模擬酶。人工模擬酶的構成條件：（1）具有能夠識別底物的分子結構，（2）具有酶活性部位的催化基團。1、環(huán)糊精2、分子印跡技術第一百一十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1、環(huán)糊精它具有一個疏水的結合部位，能與有機分子形成包絡物，同時，它還能催化一些反應。環(huán)糊精分子是一個椅子狀的空穴結構，空穴的邊緣是一些葡萄糖羥基，使得環(huán)湖精能夠溶液于水?？昭ǖ闹虚g則是疏水結構，能夠將有機小分子束縛到空穴之中。環(huán)糊精的酶促反應過程為---參與反應的底物先被環(huán)糊精分子包束，然后再發(fā)生酶促反應。環(huán)糊精所模擬的胰凝乳蛋白酶，其催化效率與天然的胰凝乳蛋白酶相同。但是，環(huán)糊精的對熱穩(wěn)定性、對PH值穩(wěn)定