蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題優(yōu)質(zhì)課件

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題優(yōu)選蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題

WesternBlot原理簡(jiǎn)介

WesternBlot一般流程

WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析內(nèi)容概要

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。WesternBlot原理

目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達(dá)量分析WesternBlot的應(yīng)用

WesternBlot原理簡(jiǎn)介

WesternBlot一般流程

WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析內(nèi)容概要WesternBlot流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色通過(guò)水溶法或有機(jī)溶劑制備總蛋白水溶液提取法針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機(jī)溶劑提取法對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過(guò)層析或電洗脫法制備目的蛋白

蛋白樣品的制備Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—雜交信號(hào)弱Step5：加入顯色底物（或放射自顯影），顯色檢測(cè)倒掉一抗溶液，用250mlPBS漂洗液濾膜3次，每次檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—雜交信號(hào)弱在陰極buffer中加入0.WesternBlot的應(yīng)用稀鹽和緩沖系統(tǒng)水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。更換高pH值Buffer設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對(duì)照來(lái)檢測(cè)二抗是否有非特異結(jié)合拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳W(wǎng)esternBlot一般流程硝酸纖維素膜：80μg/cm2）拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲凝膠濃度與蛋白分離范圍封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。蛋白樣品的定量Bradford法考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。TIANGEN產(chǎn)品

Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠成分N,N’亞甲雙丙烯酰胺和丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過(guò)硫酸銨Tris甘氨酸電泳緩沖液凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡(jiǎn)單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價(jià)格昂貴價(jià)格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機(jī)械強(qiáng)度濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過(guò)夜。半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。

轉(zhuǎn)膜方法麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過(guò)程。轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)Step5：加入顯色底物（或放射自顯影），顯色檢測(cè)WesternBlot一般流程檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照更換高pH值Buffer膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。維素濾膜，換水幾次?？贵w與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析蛋白分子量<10KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度01%SDS可提高轉(zhuǎn)膜效率WesternBlot一般流程電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫溫育將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過(guò)夜。WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析蛋白分子量<10KD轉(zhuǎn)膜后的封閉脫脂奶粉BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）

把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉劑，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫溫育1-2小時(shí)。倒掉緩沖液，立即加入一抗溶液與濾膜溫育。一抗用量也根據(jù)0.1ml/cm2來(lái)計(jì)算，室溫12小時(shí)。倒掉一抗溶液，用250mlPBS漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫溫育12小時(shí)。一抗、二抗孵育二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法堿性磷酸酶法化學(xué)發(fā)光顯色法Anti－His應(yīng)用舉例：用Westernblot檢測(cè)患者血清中的HIV病毒抗體Step1：經(jīng)電泳將HIV混合抗原按分子量大小分離Step2：印跡轉(zhuǎn)移已分離的抗原至硝酸纖維膜上，封閉Step3：加入待檢病人血清，漂洗Step4：加入合適的、標(biāo)記的二抗（HRP或AP），漂洗Step5：加入顯色底物（或放射自顯影），顯色檢測(cè)

WesternBlot原理簡(jiǎn)介

WesternBlot一般流程

WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析內(nèi)容概要Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入AP和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊QA條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—SDS電泳QA凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？

可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的紙片確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)QA蛋白分子量<10KD蛋白的等電點(diǎn)=8SDS濃度不合適凝膠太厚蛋白分子量<10KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑的膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高轉(zhuǎn)膜效率延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—蛋白轉(zhuǎn)膜效率低AR膜沒(méi)有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過(guò)高轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度ARWesternblot常見(jiàn)問(wèn)題—顯色背景高抗體保存不當(dāng)抗原不充足膜的漂洗過(guò)度抗體長(zhǎng)期保存應(yīng)在－70℃，使用前做效價(jià)檢測(cè)增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照減少漂洗的時(shí)間和次數(shù)Westernblot常見(jiàn)問(wèn)題—雜交信號(hào)弱AR倒掉緩沖液，立即加入一抗溶液與濾膜溫育。稀鹽和緩沖系統(tǒng)水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。WesternBlot一般流程WesternBlot流程硝酸纖維素膜：80μg/cm2）膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。針的Western印跡過(guò)程。WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析更換高pH值Buffer蛋白分子量<10KD通過(guò)水溶法或有機(jī)溶劑制備總蛋白不連續(xù)的電泳緩沖體系。Step1：經(jīng)電泳將HIV混合抗原按分子量大小分離應(yīng)用舉例：用Westernblot檢測(cè)患者對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括（生物試劑公司提供）WesternBlot一般流程Step1：經(jīng)電泳將HIV混合抗原按分子量大小分離WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)WesternBlot一般流程Step5：加入顯色底物（或放射自顯影），顯色檢測(cè)WesternBlot一般流程WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析“微笑”或“倒微笑”條帶？SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳倒掉一抗溶液，用250mlPBS漂洗液濾膜3次，每次把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.硝酸纖維素膜：80μg/cm2）加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫溫育WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析1ml/cm2的量加入封閉劑，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫溫育1-2小時(shí)。增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使