艾滋病抗病毒治療與實驗室檢測進展

艾滋病抗病毒治療與實驗室檢測進展實驗室檢測是艾滋病臨床診斷、病程進展監(jiān)測、抗病毒治療啟動、治療效果監(jiān)測、耐藥性檢測及調(diào)整治療方案等診療工作不可或缺的技術(shù)支撐。為滿足不斷增加的艾滋病診斷和治療相關(guān)的防治需求，全國艾滋病實驗室網(wǎng)絡(luò)不斷發(fā)展壯大。特別是實施“四免一關(guān)懷”政策以來，實驗室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)快速持續(xù)發(fā)展，檢測技術(shù)和檢測策略也適時進行完善、更新，為艾滋病診斷和治療提供了有力的技術(shù)支持和質(zhì)量保證，助力我國艾滋病防治工作取得顯著成效。1艾滋病檢測實驗室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與發(fā)展2006年的《全國艾滋病檢測工作管理辦法》中，將艾滋病檢測實驗室分為三類，分別為參比實驗室、確證實驗室和篩查實驗室［1］，規(guī)定了各類實驗室的具體管理辦法，為全國艾滋病實驗室網(wǎng)絡(luò)規(guī)范化管理奠定了基礎(chǔ)。在《中國遏制與防治艾滋病行動計劃》（2006－2010年）中提出實驗室建設(shè)發(fā)展應(yīng)建成覆蓋縣級以上的國家艾滋病監(jiān)測體系和篩查實驗室網(wǎng)絡(luò)［2］，健全市級以上確證實驗室網(wǎng)絡(luò)。之后的“十二五”和“十三五”《中國遏制與防治艾滋病行動計劃》進一步為實驗室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與發(fā)展提供了強大的發(fā)展動力［3-4］。截至2021年底，我國已有篩查實驗室13261個和檢測點35912個，覆蓋了96.9%的縣級行政區(qū)域。確證實驗室739個，覆蓋了91.7%的地級行政區(qū)域。遍布全國的篩查和確證實驗室，為各地進行艾滋病診斷提供了技術(shù)保證。同時，隨著抗病毒治療需求增加，CD4細胞、病毒載量、基因型耐藥檢測技術(shù)平臺也得到了快速發(fā)展。截至2021年底，全國各級疾病預(yù)防控制系統(tǒng)和醫(yī)療機構(gòu)等共有1195個實驗室具備yCD4細胞檢測能力，446個實驗室具備了病毒載量檢測能力，61個實驗室具備了基因型耐藥檢測能力，為國家免費抗病毒治療工作的大規(guī)模開展提供了檢測技術(shù)保障，使我國超過百萬HIV感染者的治療效果得到科學評估。實施“四免一關(guān)懷”政策以來，2004年在自愿咨詢檢測門診實施免費抗體篩查檢測，2006年起在疾病預(yù)防控制機構(gòu)實施免費CD4細胞檢測和病毒載量檢測，2008年起在疾病預(yù)防控制機構(gòu)實施免費抗體確證檢測［5］，這些免費政策有力促進了全國艾滋病篩查、確證和治療相關(guān)的檢測工作。2艾滋病檢測質(zhì)量保證體系的建立和發(fā)展為加強艾滋病檢測工作的規(guī)范化管理，不斷完善檢測質(zhì)量，為臨床診斷和治療監(jiān)測提供準確的檢測結(jié)果，有效服務(wù)于臨床診斷和治療相關(guān)的檢測需求，國務(wù)院出臺了一系列政策文件對艾滋病檢測實驗室網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)提出具體要求和發(fā)展目標［2-4］。艾滋病檢測質(zhì)量保證體系也在同步建立和完善，目前已建立了部級質(zhì)量保證體系和省級質(zhì)量保證體系［5］。部級質(zhì)量保證體系部級質(zhì)量保證體系以中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心參比實驗室為核心，負責組織編寫和修訂一系列檢測質(zhì)量保證指南，指導各級實驗室的艾滋病檢測質(zhì)量保證工作。主要包括《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細胞檢測質(zhì)量保證指南》《HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南》《HIV-1基因型耐藥檢測及質(zhì)量保證指南》等［6-8］。此外，參比實驗室組織各類檢測項目的部級培訓，對各級實驗室開展現(xiàn)場技術(shù)督導，以及對艾滋病檢測試劑質(zhì)量進行監(jiān)測。部級質(zhì)量保證體系的一個重要技術(shù)支撐是參比實驗室組織的部級能力驗證（ProficiencyTesting,PT）。自1998年啟動血清學檢測能力驗證（包括快速篩查、ELISA篩查、WB確證）以來，先后啟動CD4細胞檢測能力驗證（2003年）、HIV-1病毒載量檢測能力驗證（2005年）、HIV-1基因型耐藥檢測能力驗證（2006年）。部級質(zhì)量保證體系的不斷發(fā)展完善，有效覆蓋了全國各省的確證實驗室，CD4細胞、病毒載量和耐藥檢測實驗室，實驗室的考評合格率不斷提升，近年來各檢測項目的考評合格率均穩(wěn)定達到95%以上。此外，參比實驗室還組織開展乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、梅毒非特異性抗體、梅毒特異性抗體、HIV-1新發(fā)感染等檢測項目的能力驗證。每年對所有能力驗證結(jié)果和實驗室質(zhì)量管理情況進行綜合考評。自2013年起，全國艾滋病檢測實驗室管理信息全部納入電子信息管理平臺，所有質(zhì)量管理考評結(jié)果通過電子信息系統(tǒng)進行錄入和統(tǒng)計，極大提升了網(wǎng)絡(luò)實驗室的信息收集和管理能力。省級質(zhì)量保證體系各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）也逐步建立和發(fā)展了以艾滋病確證中心實驗室為核心的省級質(zhì)量保證體系，包括對轄區(qū)內(nèi)篩查實驗室的血清學抗體檢測能力驗證，對轄區(qū)內(nèi)所有艾滋病檢測實驗室的質(zhì)量管理考評，對下級實驗室進行檢測技術(shù)和質(zhì)量控制的分級培訓和現(xiàn)場技術(shù)督導。部分省份實現(xiàn)了質(zhì)量管理考評的電子化數(shù)據(jù)上報與管理。省級質(zhì)量保障體系的建立有力推動和促進了省級以下艾滋病檢測實驗室的質(zhì)量管理和檢測質(zhì)量，基本滿足了各地不斷增加的診斷和治療檢測需求。3艾滋病檢測技術(shù)和檢測策略的發(fā)展自1985年美國批準第一種HIV抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑以來,艾滋病檢測技術(shù)和策略不斷發(fā)展。作為我國艾滋病檢測工作的綱領(lǐng)性文件，《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》不斷發(fā)展和完善（2004版，2009版、2015版、2020版）［9］，適時納入國內(nèi)外最新的檢測技術(shù)和策略進展，更好地滿足我國艾滋病檢測工作需求，有效指導各級實驗室的艾滋病檢測工作。HIV血清學檢測HIV血清學檢測可用于陽丫感染者的篩查和確證。我國目前廣泛用于陽丫感染者血清學篩查的酶聯(lián)免疫檢測和快速檢測主要使用檢測抗HIV1/2抗體的第三代篩查檢測試劑，檢測窗口期為感染后3?4周。近年發(fā)展的可同時檢測HIV-1p24抗原和抗HIV1/2抗體的第四代篩查檢測試劑，檢測窗口期縮短到感染后2周左右，在我國各級檢測實驗室的應(yīng)用日益增加。化學發(fā)光免疫檢測是近年來發(fā)展的新技術(shù)，由于用發(fā)光底物替代ELISA顯色底物，背景很低，因此靈敏度優(yōu)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測?；瘜W發(fā)光免疫檢測可以實現(xiàn)高度自動化和高通量分析、快速出報告，已成為臨床測定微量抗原或抗體的主流技術(shù)［10］?？焖贆z測試劑一般操作簡單，在10~30分鐘內(nèi)出結(jié)果。目前，我國批準的快速檢測試劑可使用包括血液、口腔黏膜滲出液、尿液在內(nèi)的多種樣本，滿足了不同應(yīng)用場景的需求。2019年，我國藥品監(jiān)督管理局批準了國際上首個基于尿液樣本檢測的快速檢測試劑，也可用于陽丫自我檢測，進一步提高yHiv篩查檢測的可及性［11］。篩查檢測的技術(shù)進步促進了電丫感染者的早期檢測和發(fā)現(xiàn)。HIV-1病毒載量檢測我國于1997年引進HIV-1病毒載量檢測技術(shù)，早年主要使用基于反轉(zhuǎn)錄PCR(Reversetranscriptase-polymerasechainreac-tion,RT-PCR)、核酸序列依賴性擴增(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)＞分枝口M(BranchedDNAsignalamplification,bDNA)等原理的檢測技術(shù)，2010年以來基于實時熒光定量PCR(Re-al-timePCR)原理的檢測技術(shù)逐漸發(fā)展。2015年和2019年，基于bDNA和NASBA原理的檢測技術(shù)已經(jīng)分別停用，基于實時熒光定量PCR的病毒載量檢測技術(shù)逐漸成為主流［12］。2016年以來國產(chǎn)HIV-1病毒載量檢測試劑不斷發(fā)展,多項研究顯示國產(chǎn)檢測試劑與進口檢測試劑之間的差距逐漸縮小［13-14］。HIV-1病毒載量即時檢測(molecularpoint-of-careTest-ing,POCT)技術(shù)可快速獲得結(jié)果,有效減少從采樣到反饋結(jié)果的時間,適合在資源有限地區(qū)應(yīng)用。近年來，WHO推薦將病毒載量即時檢測用于及時監(jiān)測HIV感染者的抗病毒治療效果，以加快結(jié)果返回和臨床決策的時間［15］。我國已有通過國家藥品監(jiān)督管理局認證的HIV-1病毒載量即時檢測設(shè)備，檢測過程可在90分鐘內(nèi)完成［16］。既往HIV-1病毒載量檢測主要用于監(jiān)測抗病毒治療的效果，或輔助HIV感染診斷。隨著我國持續(xù)推動擴大檢測策略，越來越多的早期感染者可以通過抗原抗體或抗體篩查發(fā)現(xiàn)，而抗體確證檢測方法由于窗口期較長（4~5周），存在延遲診斷的情況［17］。為盡早明確感染狀態(tài)，2015年的《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》明確提出使用病毒載量檢測作為補充試驗的策略［18］，對于篩查試驗有反應(yīng)者建議核酸檢測或2~4周后復(fù)查。在2018年的《中國艾滋病診療指南》和2019年的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》行業(yè)標準中［19-20］也明確提出對于成人、青少年及18月齡以上兒童，HIV抗體篩查試驗有反應(yīng)和血漿病毒載量大于5000拷貝/mL時，即可診斷用丫感染。核酸檢測作為補充試驗策略，可極大提高HIV-1抗體不確定樣本的診斷率及診斷效率，縮短診斷周期，使感染者及早獲得治療［21-22］。CD4細胞檢測CD4細胞檢測是判斷陽丫感染者免疫狀況、臨床分期，評價抗病毒藥物治療效果的重要指標。常用的CD4細胞檢測方法分為兩類，一類是流式細胞儀測定法，包括雙平臺法（DPT）和單平臺法（SPT）,另一類是非流式細胞儀測定法，如基于成像技術(shù)的細胞計數(shù)儀。雙平臺法始于20世紀90年代，使用血液分析儀檢測淋巴細胞總數(shù)，同時使用流式細胞儀CD3/CD4或CD3/CD4/CD45抗體檢測CD4細胞所占淋巴細胞百分比，由此計算出細胞數(shù)。雙平臺法計算結(jié)果的影響因素較多，不同實驗室差異較大且操作步驟復(fù)雜，結(jié)果穩(wěn)定性較低。單平臺法于1996年提出，可應(yīng)用流式細胞儀配以三色、四色流式試劑和內(nèi)參絕對計數(shù)微球，一步獲得T細胞亞群的相對數(shù)（百分比）和絕對數(shù)，計數(shù)結(jié)果的重復(fù)性和準確性都能得到良好保證。我國學者通過研究確定了我國部分省及少數(shù)民族健康人T淋巴細胞參考值范圍［23］,并通過研究我國感染者的外周血T淋巴細胞14種表型正常參考值［24］，以及樣本存放溫度及時間對于外周血CD4細胞測定結(jié)果的影響［25］,為我國建立CD4細胞計數(shù)技術(shù)平臺奠定了基礎(chǔ)。我國CD4細胞計數(shù)檢測一直使用進口儀器配套進口試劑，價格昂貴且實驗室運行成本高，通過對臨床通用性CD4細胞檢測試劑進行研制，國產(chǎn)CD4熒光單克隆抗體試劑于2014年獲得國家藥品監(jiān)督管理局注冊［26］。近年來CD4細胞的即時檢測設(shè)備也在不斷發(fā)展,目前國內(nèi)外已有多種基于微流控芯片或成像技術(shù)的CD4細胞即時檢測設(shè)備。我國藥品監(jiān)督管理局也批準了多個CD4細胞即時檢測設(shè)備，檢測過程可在20分鐘內(nèi)完成，為HIV感染者提供yCD4細胞的現(xiàn)場檢測方式［27］,為基層艾滋病治療效果監(jiān)測提供了更多便捷可靠的技術(shù)手段。HIV-1基因型耐藥檢測HIV耐藥是指病毒因發(fā)生變異而對某種藥物敏感性降低。耐藥變異株的出現(xiàn)源于HIV的快速復(fù)制更新和HIV反轉(zhuǎn)錄酶的高錯配率，導致高突變率和新病毒株不斷產(chǎn)生。在抗病毒藥物存在的情況下,耐藥毒株被藥物選擇成為優(yōu)勢株。H1V感染者的耐藥檢測對于抗病毒治療具有重要指導意義。HIV耐藥檢測方法可分為基因型檢測和表型檢測。HIV-1耐藥基因型檢測基于對耐藥相關(guān)基因突變的檢測，檢測病毒基因的pol區(qū)是否存在與抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物（如蛋白酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶抑制）易感性降低相關(guān)的突變,并利用耐藥基因型解釋系統(tǒng)判斷是否耐藥以及耐藥程度。目前我國HIV-1基因型耐藥檢測采用商品化試劑盒或?qū)嶒炇易越?In-house)方法。商品化耐藥檢測試劑盒檢測費用高昂，難以在我國廣泛應(yīng)用，因此我國主要使用5-卜0我&方法。2010年國內(nèi)首個以h-標我一方法為基礎(chǔ)的全國HIVT基因型耐藥檢測質(zhì)量保證參考標準的研究，推動了國內(nèi)HIV-1基因型耐藥檢測的實驗室標準化［28-29］。2015年我國自主研究制備的基因型耐藥能力驗證質(zhì)控品保證了從耐藥樣本采集、保存到傳遞送樣的標準化和檢測結(jié)果準確性［30］。近期有研究根據(jù)中國HIV-1主要流行株，在擴增蛋白酶區(qū)和反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基礎(chǔ)上，建立了擴增整合酶區(qū)的基因型耐藥檢測方法［31］。近年發(fā)展的二代測序技術(shù)是一種快速、高通量的測序方法，能同時對多個樣本進行全基因深度測序，也被廣泛應(yīng)用于HIV-1耐藥基因型檢測［32］。HIV-1耐藥表型檢測基于體外培養(yǎng)技術(shù)，通過檢測待檢樣本中病毒生長所需的藥物半抑制濃度或90%抑制濃度(IC50或IC90),與敏感參考株的IC50或式90進行比較，得到耐藥倍數(shù)，進而判斷待檢測樣本的耐藥程度。國內(nèi)實驗室基于假病毒pNL4-3Lac的表型耐藥性檢測方法結(jié)合ypSG3Aenv和PNL4-3檢測系統(tǒng)的優(yōu)點，能高通量評價HIV對藥物的耐受性，可用于感染者耐藥性分析和抗病毒藥物篩選［33］。4挑戰(zhàn)與展望我國已經(jīng)建立了數(shù)目龐大的艾滋病檢測實驗室網(wǎng)絡(luò)和較為完善的分級質(zhì)量保證體系，實驗室檢測技術(shù)能力不斷增強，國產(chǎn)檢測試劑與進口試劑的差距逐漸縮小，為全國艾滋病治療工作提供了有力的技術(shù)保障。但檢測工作仍然面臨著新的挑戰(zhàn)，在實驗室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)方面，艾滋病確證實驗室布局不合理問題日益突出。目前全國70%~80%的確證實驗室分布在疾病預(yù)防控制機構(gòu)，如何推動醫(yī)療機構(gòu)開展確證檢測，推動核酸診斷策略的臨床應(yīng)用，是盡快廣泛實現(xiàn)艾滋病一站式診療服務(wù)面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。此外，對于數(shù)量持續(xù)增長的各類艾滋病檢測實驗室，如何進行合理有效的分級管理和分級質(zhì)控，也是保證檢