菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定培訓(xùn)課件

菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定主要內(nèi)容菌落總數(shù)測定大腸菌群測定MPN法原理（拓展內(nèi)容）菌落總數(shù)測定掌握菌落總數(shù)測定方法實驗原理 不同稀釋度的樣品，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃，48h（水產(chǎn)品30℃，72h），菌落數(shù)菌落總數(shù)測定器材與試劑樣品，無菌生理鹽水，平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，培養(yǎng)皿菌落總數(shù)測定傾注培養(yǎng)培養(yǎng)結(jié)果菌落總數(shù)測定實驗步驟5.菌落計數(shù)肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記必要時分區(qū)計數(shù)，菌落成片者作廢計算方法某稀釋度的菌落數(shù)兩平板菌落數(shù)取平均值選擇菌落數(shù)在30300之間的稀釋度（1）僅有一個稀釋度在此范圍菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)菌落總數(shù)測定計算方法（2）有兩個稀釋度在30300之間菌落數(shù)之比>2，選較小值菌落數(shù)之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300取稀釋倍數(shù)最大者（4）所有稀釋度均<30取稀釋倍數(shù)最小者（5）沒有任何稀釋度在30300之間選最接近該范圍者結(jié)果單位CFU/ml（g）菌落總數(shù)測定注意事項1.無菌操作2.標(biāo)記3.何時更換吸管4.吸吹混勻5.瓊脂培養(yǎng)基保溫6.安全常識大腸菌群數(shù)測定實驗?zāi)康膶嶒炘?6℃，48h，產(chǎn)氣（小倒管）三步法初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵器材與試劑樣品、無菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管初發(fā)酵器材與試劑樣品、225ml無菌生理鹽水、9ml無菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球大腸菌群數(shù)測定實驗步驟1.初發(fā)酵

菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定5.菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)（2）接種至10mlBGLB肉湯中4.（4）所有稀釋度均<30菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定三步法初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵3.（3）所有稀釋度均>300取稀釋倍數(shù)最小者每次劃線應(yīng)該壓到上一個區(qū)域的23條線（1）僅有一個稀釋度在此范圍x:細菌濃度，k:進入發(fā)酵管的細菌數(shù)初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基三步法初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙涂片接種環(huán)，挑取菌落，2.脫色95%乙醇，30s或至無色為止吸取樣品方法加注樣品初發(fā)酵結(jié)果右邊為陽性結(jié)果，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。實驗步驟3.復(fù)發(fā)酵（1）選取產(chǎn)氣試管（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養(yǎng)36℃，48h（4）觀察指標(biāo)若產(chǎn)氣則報告大腸菌群陽性。大腸菌群數(shù)測定實驗步驟2.分離培養(yǎng)（1）制備伊紅美藍平板45℃，無菌，傾注，15ml（2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（3）接種至伊紅美藍平板分區(qū)劃線法（4）培養(yǎng)36℃，48h分離培養(yǎng)器材與試劑初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)分區(qū)劃線法操作要點1.劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán)2.劃線時接種環(huán)同平板呈3040°角3.每次劃線應(yīng)該壓到上一個區(qū)域的23條線4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動大腸菌群數(shù)測定實驗步驟2.分離培養(yǎng)

（5）菌落特征深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深（6）革蘭染色、鏡檢選特征菌落革蘭染色法器材與試劑結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙革蘭染色法涂片接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定通過火焰若干次初染結(jié)晶紫一滴，1min，水洗媒染盧戈碘液一滴，1min，水洗脫色95%乙醇，30s或至無色為止復(fù)染復(fù)紅一滴，30s涂片脫色95%乙醇，30s或至無色為止（3）培養(yǎng)37℃，24h目的對某種細菌進行選擇性計數(shù)細菌進入發(fā)酵管的概率近似服從泊松分布:P(x=k)=ex×xk/k!目的對某種細菌進行選擇性計數(shù)（3）培養(yǎng)37℃，24h劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán)MPN法（MostProbableNumberMethod）劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán)淡紫紅色、中心顏色深（1）選取鑒定為無芽孢G桿菌的菌落13個初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基取稀釋倍數(shù)最小者涂片接種環(huán)，挑取菌落，菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定（1）選取產(chǎn)氣試管培養(yǎng)24小時后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管x:細菌濃度，k:進入發(fā)酵管的細菌數(shù)x:細菌濃度，k:進入發(fā)酵管的細菌數(shù)4.分區(qū)劃線法熱固定初染媒染脫色復(fù)染革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性革蘭染色法復(fù)發(fā)酵器材與試劑培養(yǎng)24小時后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管大腸菌群數(shù)測定實驗步驟3.復(fù)發(fā)酵（1）選取鑒定為無芽孢G桿菌的菌落13個（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（3）培養(yǎng)37℃，24h（4）觀察指標(biāo)產(chǎn)酸，產(chǎn)氣液體接種復(fù)發(fā)酵復(fù)發(fā)酵陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生大腸菌群數(shù)測定注意事項1.無菌操作2.吸管使用3.洗去染液的方法4.顯微鏡保養(yǎng)5.液體接種x:細菌濃度，k:進入發(fā)酵管的細菌數(shù)（3）所有稀釋度均>300（5）菌落特征（1）選取鑒定為無芽孢G桿菌的菌落13個劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán)（1）選取鑒定為無芽孢G桿菌的菌落13個肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記取稀釋倍數(shù)最小者（5）菌落特征分區(qū)劃線法細菌進入發(fā)酵管的概率近似服從泊松分布:P(x=k)=ex×xk/k!（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養(yǎng)36℃，48h右邊為陽性結(jié)果，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液涂片接種環(huán)，挑取菌落，MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）目的對某種細菌進行選擇性計數(shù)核心思想泊松分布實施方法多次稀釋直至無菌，每個稀釋度分別接種若干培養(yǎng)管，根據(jù)陽性管數(shù)估算MPN值MPN法原理MPN法（MostP