第十七章-螺旋體課件

第一節(jié)鉤端螺旋體

是人畜共患病，鼠類和豬是儲存宿主。在腎中存在，隨尿排出，污染水和土壤，人類接觸污染疫水。穿透皮膚粘膜侵入，并引起血癥，產(chǎn)生如內毒素等物質，引起鉤端螺旋體病，出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛肌痛、眼結膜充血等中毒癥狀，患者有全身毛細血管損傷和微循環(huán)障礙，并引起肝腎功能損害。由于血清型、毒力數(shù)量不同以及免疫水平差異，有①流感傷寒型；②黃疽出血型；③肺出血型；④腦膜腦炎型；⑤腎功能衰竭型；⑥胃腸炎型等類型。應用顯微鏡凝集試驗和凝集素吸收試驗，可進行血清群和型的分類。問號狀鉤端螺旋體可分為25個血清群、273個血清型，其中我國至少存在19個血清群、74個血清型。我國目前使用的問號鉤端螺旋體參考株有14群15型。微生物特性

螺旋細密和規(guī)則，一端彎曲使菌體呈問號狀故名鉤端螺旋體。G-，但不易著色。常用Fontana鍍銀染色法，被染成棕褐色。暗視野顯微鏡下可見活潑運動、折光性強而成白色的鉤端螺旋體。內鞭毛緊緊纏繞在原生質圓柱體表面呈螺旋狀，使鉤端螺旋體活潑地沿長軸旋轉運動。培養(yǎng)特性

營養(yǎng)要求較高，常用含10％兔血清的Korthof培養(yǎng)基，兔血清除促進鉤端螺旋體生長外，尚有中和代謝產(chǎn)物毒性的作用。最適生長溫度為28℃～30℃，最適pH為7．2～7．6，人工培養(yǎng)基中生長緩慢。在液體培養(yǎng)基中，分裂一次需8～lOh，培養(yǎng)一周左右，呈現(xiàn)為半透明云霧狀生長，但菌數(shù)僅相當于普通細菌的1／10—1／100。抵抗力

對熱抵抗力弱，60℃、1min即死亡。0．2％來蘇、l：2000升汞、1％石炭酸經(jīng)10～30min被殺滅。對青霉素敏感。鉤端螺旋體在夏秋季酸鹼度中性的濕土或水中可存活20天以上，甚至數(shù)月之久，這在本菌的傳播上有重要意義。標本采集鉤端螺旋體可從臨床標本、攜帶者和自然界的水中分離獲得。標本采集包括血液、尿和腦脊液，發(fā)病早期(1周內)血液的陽性率高，1周后尿和腦脊液等的陽性率高。感染6～10天取血可檢出抗體，在病程第3或4周達最高水平，此后抗體水平逐漸下降，血清學診斷則需在病程早期及恢復期分別采集血清，作雙份血清試驗。標本直接檢查

1．取急性期病人血以4000r／min離心45—60min，取1滴沉淀物置玻片上，加蓋玻片后作暗視野檢查。也可用Fontana鍍銀染色法染色后觀察。2．核酸檢測采用同位素或生物素、地高辛標記的特異DNA探針法，檢出標本中鉤端螺旋體的核酸，較培養(yǎng)法快速、敏感。若先用PCB技術先行擴增，再用探針確定，則敏感度更加提高。分離培養(yǎng)

取鉤端螺旋體血癥期的病人血液2ml或發(fā)病后第2周的無菌弱堿性尿沉渣接種于Korthof培養(yǎng)基中，28℃孵育，因系需氧生長，故靠近培養(yǎng)液面呈半透明霧狀混濁。取培養(yǎng)物作暗視野檢查，觀察有無螺旋體生長。連續(xù)觀察30d，如無生長方判為陰性抗體檢測顯微鏡下凝集試驗是常用的方法。(1)抗原制備：取標準菌株4—7天的培養(yǎng)物，每視野50～60條活鉤端螺旋體。(2)方法與結果：取病人血清以56℃，30min滅活后稀釋，每個稀釋度0．1ml血清中加入等量活菌抗原，30℃2h后，取1滴覆蓋玻片，暗視野顯微鏡下若有抗體存在，則鉤體凝集成團，數(shù)減少，菌體溶解。結果判定：50％以上菌體凝集或溶解為“2+”為血清效價。達1：300以上才有診斷意義或效價增高4倍以上，則可確診本病。酶聯(lián)免疫吸附試驗用ELISA法和IgM斑點-ELISA法等間接檢測鉤體病人血清中特異性抗體，用于該病的快速診斷。包被抗原用鉤端螺旋體培養(yǎng)物經(jīng)超聲波破碎，15000r／min離心20min，用于包被的抗原濃度以20μg／ml為好。被檢血清OD值為陰性對照的2倍，即為陽性。動物試驗動物是分離鉤端螺旋體的敏感方法，尤其適用于有雜菌污染的標本。方法是將標本接種于幼齡豚鼠或金地鼠腹腔。接種3～5d后，可用暗視野顯微鏡檢查腹腔液；亦可在接種后3～6d取心血檢查并作分離培養(yǎng)。動物死后解剖，可見皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾臟器中有大量鉤端螺旋體存在。第二節(jié)疏螺旋體屬

有3～10個稀疏而不規(guī)則的螺旋，運動活潑。對人致病的主要有伯氏疏螺旋體、回歸熱螺旋體、奮森螺旋體等。一、伯氏疏螺旋體是萊姆病的主要病原體，1977年在美國萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)，從硬蜱及患者體內分離出伯氏疏螺旋休。1985年我國在黑龍江省林區(qū)首次發(fā)現(xiàn)萊姆病，1988年從病人血液中分離出病原體，迄今已有十多個省和自治區(qū)證實有萊姆病存在。傳播媒介是硬蜱，伯氏疏螺旋體可在蜱的中腸生繁殖，叮咬時使宿主感染。經(jīng)3～30d潛伏期，在叮咬部位可出現(xiàn)慢性移行性紅斑。經(jīng)2-3周，皮損消退，留有斑痕與色素沉著。早期癥狀有頭痛發(fā)熱、肌痛等。80％未經(jīng)治療的可發(fā)展至慢性關節(jié)炎、慢性神經(jīng)系統(tǒng)異常，嚴重者可同時出現(xiàn)皮膚、神經(jīng)、關節(jié)、心等多臟器損害。微生物特性

1．疏螺旋體，兩端稍尖。運動活潑，在培養(yǎng)基中，不規(guī)則地纏繞一起，呈卷圈狀。周漿鞭毛數(shù)不等。與運動有關。Ｇ-易著色。Giemsa或Wright染色均佳。2．抗原成分主要的有鞭毛蛋白(40kＤ)、外膜蛋白A(OspA)、B(OspB)和C(OspC)，60kD抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致病原之一。3.營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)基需含有長鏈飽和與不飽和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和q清蛋白等。微需氧，5％—10％C02促進生長。適宜溫度為35℃。生長慢，1代需18h，需培養(yǎng)1～3周觀察到生長情況。微生物檢驗

1．標本采集早期取病損皮膚組織、淋巴結抽出液、血液。2.直接用暗視野顯微鏡，觀察關節(jié)滑膜液、腦脊液、尿液等標本中螺旋體的形態(tài)和運動，因數(shù)量太少，故在實驗室診斷中價值不大。用于蜱內臟組織檢查,檢出率較高。

3.核酸檢測用PCR技術檢查DNA，方法快速、敏感性高，用已知引物，以標本中螺旋體質粒DNA片段為模板，擴增后形成309bp的DNA分子(是編碼OspA的基因片段)，經(jīng)瓊脂糖電泳證實。此DNA分子在所有伯氏疏螺旋體菌株中均可被檢出，而其他菌種則為陰性。4.分離培養(yǎng)標本接種在BSK復合培養(yǎng)基中，33℃孵育。BSK培養(yǎng)基是含有牛血清白蛋白(BSA)和熱滅活兔血清等營養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基，通常從感染的脾中分離螺旋體較易，而從損傷皮膚中分離較難。因分裂1代需12h以上，需培養(yǎng)2-3周可觀察生長情況。5.抗體檢測間接免疫熒光法(IFA)：將螺旋體在BSK中培養(yǎng)5-7天，離心8200rpm30min收集螺旋體，稀釋至200個螺旋體／高倍鏡視野。取20μl懸液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待檢血清以PBS倍比稀釋，加于玻片10～15μl稀釋血清，濕盒內37℃孵育30min，洗后加熒光素標記抗人IgG。IFA操作簡便實用，但類風濕性關節(jié)炎和其他螺旋體病可出現(xiàn)假陽性反應。6.動物試驗常用的實驗動物有小白鼠，金地鼠和兔等。以螺旋體懸液感染，可出現(xiàn)與人類相似的皮損癥狀，血培養(yǎng)亦陽性，抗體效價顯著升高，可作為良好的動物模型，常用新西蘭白兔。動物試驗雖是一種經(jīng)典的方法，但較繁瑣，有生物危害。二、回歸熱疏螺旋體是引起人類回歸熱的病原體。根據(jù)回歸熱傳播媒介不同，分為兩類:一為虱傳回歸熱，或稱流行性回歸熱，其病原體為回歸熱疏螺旋體。另一為蜱傳回歸熱熱，又稱地方性回歸熱。我國流行的回歸熱主要是虱傳型。流行性回歸熱主要通過人體虱在人類中傳播。當虱吸吮病人血液后，螺旋體從中腸進入血淋巴大量繁殖，不進入唾液或卵巢。人被虱叮咬后，因抓癢將虱糞壓碎，經(jīng)皮膚創(chuàng)傷進入人體。侵入人體后，先在內臟繁殖，經(jīng)一周左右的潛伏期，大量流入血液，引起菌血癥型發(fā)熱、肝、脾腫大，出現(xiàn)黃疽；持續(xù)一周左右，驟然退熱，血中螺旋體消失，隔一周或數(shù)日又發(fā)熱，血中出現(xiàn)螺旋體。如此反復發(fā)作與緩解可達3～10次，故稱回歸熱取發(fā)熱期外周血1滴，加蓋玻片用暗視野顯微鏡觀察，螺旋體運動活潑；為紅細胞直徑的2-4倍，螺旋稀疏不規(guī)則，呈波狀。如發(fā)熱期未能查到螺旋體，取抗凝血0．1ml接種乳鼠腹腔，每日取尾靜脈血鏡檢，1～3天可查到大量疏螺旋體?？乖鬃园l(fā)變異，使其血清學診斷十分困難。三、奮森疏螺旋體

有3—8個不規(guī)則疏螺旋，形態(tài)與回歸熱螺旋體類似。G-，運動活潑。專性厭氧，常與梭桿菌寄生于牙齦部。一般不致病，只有當人體抵抗力顯著降低時，兩種菌繁殖，協(xié)同引起奮森咽峽炎、牙齦炎、口頰壞疽、潰瘍性口腔炎等。用棉拭子從病灶處取材，涂片染色鏡檢，可見G-螺旋體與G-梭桿菌共存。第四節(jié)密螺旋體屬螺旋細密、規(guī)則兩端尖，數(shù)目多；包括致病性和非致病性兩大類。致病密螺旋體有蒼白和品他密螺旋體兩個種。蒼白密螺旋體又分3個亞種：蒼白亞種、地方亞種和極細亞種，它們分別引起梅毒、是性傳播疾病。地方性梅毒通過污染餐具傳染，雅司病經(jīng)直接接觸患者皮膚受損部位而傳染，二者的臨床癥狀與梅毒相似，但不是性傳播疾病。品他密螺旋體引起人類品他病。一、梅毒螺旋體引起梅毒。人是惟一傳染源。先天性梅毒通過胎盤由母體傳染胎兒，獲得性梅毒經(jīng)性接觸傳播。也可經(jīng)輸血引起。獲得性梅毒，臨床上分為三期：Ⅰ期無痛性硬下疳。多見于外生殖器；Ⅱ期梅毒疹，全身淋巴結腫大；Ⅲ期損害全身組織和器官。先天性梅毒，又稱胎傳梅毒。引起胎兒全身性感染，導致流產(chǎn)或死胎；或出生呈現(xiàn)馬鞍鼻、先天性耳聾等特殊體征。微生物特性

1．形態(tài)與染色有8～14個致密規(guī)則小螺旋，兩端尖直運動活潑，G-，但不易著染。Fontana鍍銀染成棕褐色。在光鏡下易于查見。在暗視野顯微鏡下，可觀察標本形態(tài)和運動方式。2.電鏡下觀察，有細胞壁和細胞膜。細胞壁外有包膜，細胞膜內為含細胞質和核質的螺旋形原生質圓柱體。繞著3—4根周漿鞭毛或內鞭毛，與運動有關。3.不能在無活細胞的人工培養(yǎng)基中生長繁殖。4.抵抗力極弱。對溫度和干燥特別敏感，4℃3天死亡。保存4℃3天血液就無傳染梅毒的危險。梅毒螺旋體檢驗1.直接顯微鏡檢查

初期梅毒，取下疳分泌物；二期梅毒取梅毒疹、病灶滲出物或局部淋巴結穿刺液，將上述檢材置于玻片上用暗視野顯微鏡檢查，如見有呈現(xiàn)運動活潑，沿其長軸滾動、屈伸、旋轉、前后移行等的螺旋體即有診斷意義。2.核酸檢測用PCR技術直接檢測臨床標本中梅毒螺旋體的特異性DNA片段，用于檢測的引物和探針是編碼外膜蛋白4．7kD的基因，其擴增產(chǎn)物經(jīng)斑點印跡，或電泳以Southern印跡法鑒定。3.抗體檢測

(1)非密螺旋體抗原試驗多用牛心肌的心脂質作為抗原，測定病人血清中的反應素。初期梅毒病灶出現(xiàn)后1-2周時，陽性率為53％～83％，二期梅毒的陽性率可達100％，晚期梅毒的陽性率58％-85％，胎傳梅毒的陽性率為80％-100％。1)性病研究所實驗室

(VDRL)玻片試驗所用抗原(0．03％心擬脂、0．21％卵磷脂、0．9％膽固醇，用無水乙醇配制)0．3ml加入裝有0．3ml緩沖鹽水的小瓶內(10—15ml容積)，加塞混勻。再加2．4ml緩沖鹽水即為抗原懸液，待檢血清經(jīng)56℃30min滅活，滴加于玻片的漆圈內加等量抗原液，搖轉玻片5min充分混勻反應后觀察結果。有大片絮狀凝聚物為(3+)，中等凝聚物為(2+)，細小凝聚物為(+)，液體混濁為(—)。2)快速血漿反應素環(huán)狀

卡片試驗(RPR)用活性炭顆粒吸附VDRL抗原。與反應素結合形成黑色凝集塊，可肉眼觀察結果。取待檢血清加于環(huán)狀卡圓圈內，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋轉搖勻8min，觀察結果。在白色底板出現(xiàn)明顯黑色凝集顆粒為陽性，試驗結果用肉眼很容易判斷，不需顯微鏡，也易于推廣?？蓪吮颈侗认♂屵M行半定量試驗。對評價療效和判斷是否再感染有價值。(2)密螺旋體抗原試驗用密螺旋體抗原檢測病人血清中特異性抗體，由于梅毒螺旋體、雅司螺旋體等抗原性相似，所以用血清學試驗不可能區(qū)別這些密螺旋體及其所致疾病。

1)熒光密螺旋體抗體

吸收試驗(FTA-ABS)

先用吸收劑去除病人血清非特異性抗原，提高特異性，稀釋成不同稀釋度，加于預先涂有梅毒螺旋體抗原的玻片上，置濕盒內，37℃孵育30min，洗片后再用熒光素標記的羊抗人丙球蛋白抗體，在熒光顯微鏡下觀察。陽性者可見發(fā)熒光的梅毒螺旋體。FTA-ABS試驗具高度特異性和敏感性，在第一期梅毒的頭幾天就可測出特異性抗體。

2)梅毒螺旋體熒光抗體

雙染色試驗(FTA—ABS-DS)

用Nichol株梅毒螺旋體作抗原，用四甲基異硫氰酸若丹明結合的抗人球蛋白抗血清及異硫氰酸熒光素(FITC)結合的抗梅毒螺旋體球蛋白雙重染色，用間接免疫熒光技術檢測血清中的抗TPlgG抗體。FTA-ABS-DS法無論對早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特異性，且陽性出現(xiàn)時間早。一期梅毒陽性率達90％，晚期梅毒的陽性率為95％。對確診病人的敏感性和特異性分別為91．7％和92．o％，但技術要求較高，且較費時費錢，因此多用于實驗室試驗。3)抗梅毒螺旋體抗體的微量

血凝檢測(MHA-TP)

用抗原致敏紅細胞作間接血凝試驗是檢測抗體最簡易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋體(Nichols株)提取物去致敏經(jīng)醛化處理的綿羊紅細胞，病人的血清先與非致病性Reiter細胞。血清若含有抗體則與這些細胞反應形成平鋪孔底的凝集；用非致敏紅細胞作對照，以除外非特異性凝集。4)ELISA用Nichols株為抗原，以超聲波擊碎。此法可用于各期梅毒診斷，靈敏度為96％，對感染血清靈敏度為95％。與熒光抗體雙吸收法(FTA-ABS-DS)比較