代謝工程與調(diào)控第五章

目錄蛋白質(zhì)支架DNA支架RNA支架RNA干擾當(dāng)前第1頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)支架技術(shù)？？？當(dāng)前第2頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)代謝途徑的中間產(chǎn)物可能對(duì)宿主產(chǎn)生毒性，被競(jìng)爭(zhēng)途徑消耗，或通過(guò)分泌丟失。解決這些問(wèn)題的一個(gè)新興的策略是將合成途徑的酶組合成多酶復(fù)合物。多酶復(fù)合物在自然界中很常見(jiàn)，例如：由絲氨酸合成色氨酸的反應(yīng)過(guò)程中，催化色氨酸合成的最后兩個(gè)步驟的酶可以形成復(fù)合物，中間產(chǎn)物吲哚通過(guò)一個(gè)通道由一個(gè)活性位點(diǎn)到達(dá)另一個(gè)。酶支架技術(shù)產(chǎn)生的背景當(dāng)前第3頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)αreaction由絲氨酸合成色氨酸絲氨酸

色氨酸

當(dāng)前第4頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)多酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)多酶復(fù)合物形成一個(gè)分子內(nèi)通道，該疏水性通道連接α和β活性位點(diǎn)。中間產(chǎn)物吲哚，由α亞基產(chǎn)生(αreaction)，通過(guò)該疏水性通道，分子內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到β亞基，與L-絲氨酸反應(yīng)生成L-色氨酸(βreaction)中間產(chǎn)物吲哚是一個(gè)疏水性物質(zhì)，如果在反應(yīng)過(guò)程中不加以引導(dǎo)，它可能會(huì)穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜而無(wú)法發(fā)揮作用。該通道可以防止吲哚在催化反應(yīng)的過(guò)程中擴(kuò)散到溶劑中。當(dāng)前第5頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)將合成途徑的酶組合成多酶復(fù)合物是將途經(jīng)中的酶共定位形成最優(yōu)比例的復(fù)合物，可以增加途徑代謝產(chǎn)物和酶的局部濃度，限制途徑中間體的積累，減少與其他細(xì)胞成分之間不必要反應(yīng)的發(fā)生。將酶組合成復(fù)合物的一種方法是將催化連續(xù)反應(yīng)的酶進(jìn)行融合。酶-酶融合策略在某些情況下能夠增強(qiáng)途徑通量。但是其存在以下缺點(diǎn)：①不適用于包含超過(guò)兩個(gè)酶的途徑；②融合之后經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致一個(gè)或者兩個(gè)酶活性的降低；③不能輕易地改變復(fù)合物中酶的比例。當(dāng)前第6頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)酶的合成支架技術(shù)為途徑中兩個(gè)或多個(gè)酶的共定位提供了新的方法。蛋白質(zhì)、DNA和RNA都可以作為支架用于酶復(fù)合物的形成。proteinscaffoldsRNAscaffoldsDNAscaffolds當(dāng)前第7頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)許多信號(hào)蛋白包含模塊化的蛋白質(zhì)相互作用域，可以特異性地與其他域或短肽結(jié)合。當(dāng)這些域融合到其他蛋白的N端或者C端時(shí)，還可以保持結(jié)合功能。攜帶多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用域的支架蛋白可以和帶有多肽配體標(biāo)簽的酶相互作用，用于共定位途徑中連續(xù)的酶。蛋白質(zhì)支架及其應(yīng)用原理優(yōu)點(diǎn)1.可用于兩個(gè)或多個(gè)酶的共定位2.只需要在每個(gè)酶上加一條短肽，因此蛋白質(zhì)支架技術(shù)對(duì)酶活性的影響要低很多3.通過(guò)改變蛋白支架上結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可以控制不同酶的相對(duì)比例。當(dāng)前第8頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)蛋白質(zhì)支架的應(yīng)用---甲羥戊酸的生物合成甲羥戊酸的生物合成途徑，由乙酰輔酶A生產(chǎn)甲羥戊酸，包括三個(gè)酶：乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(AtoB)羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶(HMGR)HMGR甲羥戊酸的生物合成途徑圖解

DueberJE,WuGC,Nat.Biotechnol，2009,27:753-759.當(dāng)前第9頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

三種酶的活性不同，存在HMGS和HMGR之間流量不平衡的問(wèn)題，導(dǎo)致中間產(chǎn)物羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的積累。HMG-CoA對(duì)宿主大腸桿菌細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性。蛋白質(zhì)支架當(dāng)前第10頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)通過(guò)蛋白質(zhì)支架將HMG-CoA這個(gè)中間產(chǎn)物的產(chǎn)生酶(HMGS)和消耗酶(HMGR)之間共定位。調(diào)節(jié)兩個(gè)酶的比例，使甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了10倍。通過(guò)另外一個(gè)支架分子將途經(jīng)的第一個(gè)酶(AtoB)引入到復(fù)合物中，使甲羥戊酸的產(chǎn)量較無(wú)蛋白支架的對(duì)照提高了77倍。

當(dāng)前第11頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)蛋白與蛋白的相互作用區(qū)域與配體來(lái)自于動(dòng)物細(xì)胞SH3和PDZ域-----mouseGBD域----rat將其插入到大腸細(xì)胞中，設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)機(jī)制蛋白支架上結(jié)構(gòu)域的數(shù)量直接控制酶的比例配體當(dāng)前第12頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)途徑中的限速酶是HMGR，需要增加羥甲戊二酰輔酶A到甲羥戊酸這一步的流量。HMGS的C端可以與不同數(shù)量的SH3配體結(jié)合，HMGR的N端可以與一個(gè)SH3配體結(jié)合，從而形成不同酶比例的酶復(fù)合物甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了10倍HMGS和HMGR的雙酶支架當(dāng)前第13頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)AtoB以及HMGS和HMGR的三酶支架甲羥戊酸途徑中酶的表達(dá)由啟動(dòng)子PTET控制，支架的表達(dá)由啟動(dòng)子PBAD控制配體GBD、SH3、PDZ分別與AtoB、HMGS以及HMGR這三個(gè)酶結(jié)合，通過(guò)改變配體的數(shù)量(X、Y、Z)形成不同比例的多酶復(fù)合物當(dāng)前第14頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)九個(gè)不同的多酶復(fù)合物表現(xiàn)出很大的差異，最終GBD1SH32PDZ2多酶復(fù)合物相比于無(wú)支架的酶，產(chǎn)量提高了77倍當(dāng)前第15頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)蛋白質(zhì)支架的應(yīng)用---葡糖二酸的合成該途徑中，限速步驟的酶是(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)。MIOX可以被其底物肌醇激活。通過(guò)蛋白支架，增加了MIOX周圍肌醇的濃度，進(jìn)而使葡糖二酸產(chǎn)量提高5倍當(dāng)前第16頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)DNA之間可以通過(guò)雜交進(jìn)行結(jié)合，DNA和蛋白質(zhì)之間可以通過(guò)鋅指DNA結(jié)合域?qū)崿F(xiàn)相互作用DNA支架及其應(yīng)用原理優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可以通過(guò)控制DNA支架的結(jié)構(gòu)從而控制多酶復(fù)合物中酶與酶之間的距離缺點(diǎn)：將寡核苷酸共價(jià)結(jié)合到酶上以及組裝DNA納米結(jié)構(gòu)，操作煩瑣，使該策略難以實(shí)際應(yīng)用當(dāng)前第17頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)DNA支架應(yīng)用---用于GOx和HRPGOx與HRP共作用反應(yīng)機(jī)理ABST-為顯色物質(zhì)2--+H202HWilnerOI,WeizmannY,Nat.Nanotechnol.,2009,4:249-254當(dāng)前第18頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)組裝的DNA納米結(jié)構(gòu)，由單條的核苷酸鏈組成，每條鏈預(yù)先設(shè)計(jì)好互補(bǔ)序列，通過(guò)雜交可以形成六邊形結(jié)構(gòu)。剩余的10個(gè)堿基相當(dāng)于一個(gè)鉸鏈，可以使得DNA支架與生物大分子結(jié)合。(注意：將此結(jié)構(gòu)描述成六邊形是為了闡明DNA自主裝結(jié)構(gòu)的形式，實(shí)際情況下，該結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生扭曲，但由于雜交，它們保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)）60base+10base

90base+10baseDNA支架的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第19頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)酶與DNA支架結(jié)合通過(guò)賴氨酸殘基與DNA寡核苷酸共價(jià)交聯(lián)當(dāng)前第20頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)分別以兩個(gè)六面體和四個(gè)六面體的DNA結(jié)構(gòu)作為葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶的DNA支架當(dāng)酶的間距由從4個(gè)六面體(約33nm)縮短到2個(gè)六面體(約13nm)，產(chǎn)物的產(chǎn)量有了顯著的增加。原因：距離遠(yuǎn)使得生成的H2O2擴(kuò)散到體系中，導(dǎo)致HRP活性位點(diǎn)周圍的H2O2濃度較低，從而最終產(chǎn)量低當(dāng)前第21頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)DNA支架需要與生物大分子結(jié)合，設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意使支架的結(jié)構(gòu)靈活，穩(wěn)定性較低，以避免其對(duì)生物大分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響生物大分子的催化作用設(shè)計(jì)DNA支架時(shí)需注意的問(wèn)題當(dāng)前第22頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNA支架及其應(yīng)用原理優(yōu)缺點(diǎn)在RNA結(jié)構(gòu)模塊中包含蛋白質(zhì)的適配體域，用于結(jié)合需要共定位的蛋白優(yōu)點(diǎn)：可根據(jù)需要將RNA支架聚合成一維支架或者二維支架。缺點(diǎn)：RNA結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)時(shí)較為復(fù)雜，操作繁瑣當(dāng)前第23頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNA支架可合成一維或者二維的RNA支架，將酶定位在支架上RNA支架應(yīng)用---氫酶和鐵氧還蛋白的共定位DelebecqueCJ,LindnerAB,Science,2011,333:470-474.當(dāng)前第24頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

RNA支架(D0)結(jié)構(gòu)模塊中包含PP7和MS2適配體域用于結(jié)合PP7(氫酶)和MS2(鐵氧化還原蛋白)

RNA與蛋白結(jié)合原理圖當(dāng)前第25頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNA結(jié)構(gòu)中包含二聚區(qū)域(DD)和多聚區(qū)域(PD)，為了防止回文序列的倒塌多聚區(qū)域分子內(nèi)折疊，形成具有保護(hù)功能的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)與DD區(qū)域重疊，阻止序列倒塌，之后自組裝形成功能區(qū)域。構(gòu)建一維及二維RNA支架的“磚”當(dāng)前第26頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)將帶有兩個(gè)蛋白適配體域的RNA支架與組裝結(jié)構(gòu)結(jié)合，自組裝之后形成納米管最終形成一維RNA支架先將帶一個(gè)蛋白適配體域的結(jié)構(gòu)進(jìn)行自組裝，再加入帶另一個(gè)蛋白適配體域的結(jié)構(gòu)，再進(jìn)行自組裝，最終形成二維RNA支架RNA支架的形成當(dāng)前第27頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，二維RNA支架在細(xì)胞中形成穩(wěn)定的約100nm的球形結(jié)構(gòu)，使融合蛋白能夠近距離聚集。利用RNA支架進(jìn)行氫酶和鐵氧化還原蛋白的共定位，使氫氣產(chǎn)量提高了約48倍當(dāng)前第28頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNA干擾當(dāng)前第29頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNAinterference的發(fā)現(xiàn)早在1990年，Jorgensen等在研究如何增加矮牽?；ǖ念伾珪r(shí)，觀察到一種無(wú)法解釋的現(xiàn)象：通過(guò)添加過(guò)量色素基因拷貝來(lái)增加植物花的著色，結(jié)果事與愿違，不但花未著色，反而部分花變?yōu)榘咨?。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，這些導(dǎo)入的基因不僅不表達(dá)，反而使植物本身的基因表達(dá)也受到了抑制，即所謂的共抑制當(dāng)前第30頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)法爾和梅洛則首次在線蟲(chóng)身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干擾。實(shí)際上，法爾在接受諾貝爾獎(jiǎng)網(wǎng)站采訪時(shí)提到，第一個(gè)在線蟲(chóng)中觀察到(RNA干擾)這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學(xué)研究生郭蘇?！?995年，從復(fù)旦大學(xué)畢業(yè)后赴美的郭蘇在坎菲斯(Kenneth

Kemphues)指導(dǎo)下，試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)的某個(gè)基因時(shí)，意外地發(fā)現(xiàn)反義和正義這兩種單鏈RNA都阻斷了該基因的表達(dá)。√1998年，卡耐基研究院AndrewFire的研究證明，在正義RNA也阻斷了基因表達(dá)的試驗(yàn)中，真正起作用的是微量雙鏈RNA（污染）。是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時(shí)生成的。這種雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻斷作用被稱為RNA干擾。（RNAinterference,RNAi）。當(dāng)前第31頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)可惜的是，郭蘇和坎菲斯一直沒(méi)能解釋這個(gè)奇怪現(xiàn)象。直到3年后，法爾和梅洛才揭開(kāi)了謎底：在郭蘇的實(shí)驗(yàn)中，體外轉(zhuǎn)錄所得RNA污染了微量的雙鏈RNA，而經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA能夠高效率地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。這就是RNA干擾。

郭蘇后來(lái)到加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）任職。她說(shuō)：“他們?cè)谖覀児ぷ鞯幕A(chǔ)上，解釋了我們那個(gè)讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個(gè)飛躍……我和坎菲斯通過(guò)話，我們的工作在這個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)中有所貢獻(xiàn)，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認(rèn)為安德魯·法爾和克雷格理應(yīng)獲獎(jiǎng)?！眴⑹荆涸趯?shí)驗(yàn)時(shí)，要認(rèn)真觀察每個(gè)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導(dǎo)。當(dāng)前第32頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNAi現(xiàn)象的普遍性RNAi現(xiàn)象廣泛存在于線蟲(chóng)，果蠅，斑馬魚(yú)，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNAi來(lái)抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。當(dāng)前第33頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNA干擾的機(jī)理當(dāng)前第34頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)參與RNAi反應(yīng)的酶Dicer酶：是RNA酶Ⅲ家族的一個(gè)成員。RNA酶Ⅲ是一種能切割雙鏈RNA的酶。Dicer酶參與RNAi反應(yīng)，廣泛存在于蠕蟲(chóng)，果蠅，真菌，植物及哺乳動(dòng)物。結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合位點(diǎn)。Dicer酶的作用下，雙鏈RNA被裂解成21到23個(gè)核苷酸的片斷，稱為siRNA（shortinterferenceRNA），它啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的RNAi反應(yīng)。RdRP：細(xì)胞內(nèi)存在RNAi效應(yīng)的擴(kuò)增系統(tǒng)。能以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶（RNA-directedRNApolymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA通過(guò)類似于PCR的反應(yīng)過(guò)程，呈指數(shù)級(jí)的數(shù)量擴(kuò)增Dicer當(dāng)前第35頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)在RNA干擾機(jī)制中，雙鏈RNA誘導(dǎo)同源RNA降解的過(guò)程依賴于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的活性。RISC由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多種生物大分子裝配而成。RISC中的Dicer具有RNAaseш結(jié)構(gòu)域，在RNAi的起始階段負(fù)責(zé)催化siRNA的產(chǎn)生，在RISC裝配過(guò)程中起穩(wěn)定RISC中間體結(jié)構(gòu)和功能的作用；Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，前者為siRNA的傳遞提供結(jié)合位點(diǎn)，后者是RISC中的酶切割活性中心；siRNA是RISC完成特異性切割作用的向?qū)В诔墒斓腞ISC中雖然只包含siRNA一條鏈，但siRNA在RISC形成過(guò)程中的雙鏈結(jié)構(gòu)是保證RNAi效應(yīng)的決定因素。當(dāng)前第36頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNAi的反應(yīng)過(guò)程

1.雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA；

2.在RdRP的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNA；

3.SiRNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶降解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。4.結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。當(dāng)前第37頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)RNAi的應(yīng)用RNA干擾作為一種簡(jiǎn)單快速、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、效果可預(yù)測(cè)的技術(shù)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，它比反義核酸優(yōu)越，比基因敲除簡(jiǎn)單，具有很好的應(yīng)用前景，具體可用于以下幾個(gè)方面：1.基因功能分析2.研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑3.新藥物的研究與開(kāi)發(fā)4.基因治療5.其他應(yīng)用RNA干擾技術(shù)自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)在不斷地發(fā)展中，由繁變簡(jiǎn)，近年來(lái)一些RNA干擾技術(shù)被應(yīng)用于代謝工程中，并取得了一定的成果……當(dāng)前第38頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)1真核體系中的RNA干擾23最先發(fā)現(xiàn)的RNA干擾機(jī)制，但因其機(jī)制較為復(fù)雜，過(guò)程中涉及到酶及復(fù)合體等，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)運(yùn)用到實(shí)際中較為繁瑣，有一定的操作困難需要蛋白輔助的RNA干擾不需蛋白輔助的RNA干擾sRNA需要在蛋白的幫助下，與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，輔助的蛋白可以提高sRNA與靶標(biāo)mRNA的雜交效率、穩(wěn)定sRNA、促進(jìn)靶標(biāo)mRNA的降解。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及操作較為簡(jiǎn)單sRNA不需要蛋白的幫助就可以與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，整個(gè)干擾機(jī)制較為簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，操作相對(duì)較為容易當(dāng)前第39頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)sRNA應(yīng)用在代謝工程中的應(yīng)用示意圖a.篩選抑制效果最好的菌株及sRNA組合b.通過(guò)調(diào)整代謝流量提高產(chǎn)量當(dāng)前第40頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1.較高特異性：能夠非常特異地降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA。2.高效性：相對(duì)少量的dsRNA就可以使相應(yīng)的基因表達(dá)受抑制。3.可遺傳性及遠(yuǎn)距離效應(yīng)：RNAi基因表達(dá)的效應(yīng)可以突破細(xì)胞的界限，可傳遞給子一代。4.對(duì)細(xì)胞的有害性?。褐苯忧贸承┗蚩赡軙?huì)導(dǎo)致細(xì)胞失活，用RNA干擾可避免這種情況當(dāng)前第41頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)在大腸桿菌中使用小RNA干擾基因的表達(dá)

---需要蛋白的輔助Solomon,K.V.,Sanders,,2012.Metab.Eng.14,661–671.在Hfq蛋白的幫助下，sRNA與mRNA結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄當(dāng)前第42頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)sRNA質(zhì)粒庫(kù)的構(gòu)建a.模板質(zhì)粒中插入表達(dá)組件(啟動(dòng)子、支架序列、轉(zhuǎn)錄終止序列)b.選擇sRNA與目的基因結(jié)合序列及設(shè)計(jì)引物c.通過(guò)定向位點(diǎn)突變PCR，插入選擇的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)d.轉(zhuǎn)入大腸桿菌中e.通過(guò)序列分析，確認(rèn)合成的sRNAsf.sRNA質(zhì)粒庫(kù)構(gòu)建完成當(dāng)前第43頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)應(yīng)用a.篩選菌株b.篩選基因靶標(biāo)c.優(yōu)化和控制代謝流量d.遺傳和代謝電路的調(diào)控當(dāng)前第44頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)應(yīng)用實(shí)例

-----在大腸桿菌中通過(guò)利用sRNA抑制翻譯提高產(chǎn)物產(chǎn)量Na,D.,Yoo,S.M.,Chung,Nat.Biotechnol.31,170–174sRNA在Hfq蛋白的幫助下與mRNA結(jié)合，mRNA不能與核糖體結(jié)合，從而抑制翻譯當(dāng)前第45頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)合成的sRNA的結(jié)構(gòu)大部分sRNAs由兩部分功能序列組成：結(jié)合靶標(biāo)mRNA的序列和支架序列(E.coli中大部分sRNAs中都有一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu),為招募Hfq蛋白提供支架Hfq蛋白可以提高sRNA與靶標(biāo)mRNA的雜交效率、穩(wěn)定sRNA、促進(jìn)靶標(biāo)mRNA的降解)？？結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定，抑制效果越好當(dāng)前第46頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)支架的篩選101個(gè)已知的sRNAs，篩掉：靶向結(jié)合序列未鑒定的Hfq蛋白結(jié)合序列未鑒定或者缺失的靶向不唯一的最終篩選出三個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的sRNAsC--空白對(duì)照，無(wú)sRNA-不帶結(jié)合靶標(biāo)mRNA序列的支架+帶結(jié)合靶標(biāo)mRNA序列的支架最終篩選出最優(yōu)的支架MicC當(dāng)前第47頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)不同結(jié)合區(qū)域與抑制效果的關(guān)系結(jié)合區(qū)域的選擇：1.靶標(biāo)mRNA的翻譯起始位點(diǎn)(TIR)范圍內(nèi)：從SD序列到下游20-30個(gè)核苷酸全部結(jié)合部分結(jié)合2.靶標(biāo)mRNA的翻譯起始位點(diǎn)(TIR)范圍外抑制效果最好的D1、D2，抑制效率能達(dá)到90%以上翻譯起始位點(diǎn)（TIR）當(dāng)前第48頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)具體實(shí)例一：運(yùn)用sRNA干擾策略在E.coli中提高酪氨酸產(chǎn)量綠色---過(guò)表達(dá)基因紅色---sRNA抑制的靶標(biāo)大腸桿菌中Hfq蛋白輔助的RNA干擾當(dāng)前第49頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)質(zhì)粒4、3-4、1-4、2-4、及質(zhì)粒2的兩個(gè)突變體與質(zhì)粒4組合，分別導(dǎo)入14株不同的菌中，篩選出產(chǎn)量最高的最優(yōu)組合產(chǎn)量最高的是S17-1與質(zhì)粒1-4的組合質(zhì)粒1:可編碼帶anti-csrA序列的sRNA的質(zhì)粒質(zhì)粒2:可編碼帶anti-pgi序列的sRNA的質(zhì)粒質(zhì)粒3:可編碼帶anti-ppc序列的sRNA的質(zhì)粒質(zhì)粒4:可編碼帶anti-tyrR序列的sRNA的質(zhì)粒當(dāng)前第50頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)具體實(shí)例二：運(yùn)用sRNA干擾策略在E.coli中提高1.5戊二胺的產(chǎn)量紅色代表候選靶基因運(yùn)用sRNA對(duì)候選靶基因進(jìn)行抑制，產(chǎn)量最高的是對(duì)murE進(jìn)行抑制的體系當(dāng)前第51頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)在大腸桿菌中使用小RNA干擾基因的表達(dá)

---不需要蛋白的輔助YapingYang,YuhengLin，MetabolicEngineering29(2015)217–226莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以增加反義RNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，該結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，阻止其與核糖體結(jié)合，達(dá)到干擾基因表達(dá)的效果(mRNA的翻譯起始區(qū)，包括RBS和起始密碼子被認(rèn)為是最理想的靶標(biāo))當(dāng)前第52頁(yè)\共有57頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)asRNA的環(huán)的長(zhǎng)度與干擾效率的關(guān)系研究了四種不同長(zhǎng)度環(huán)的asRNA(100,150,200and300nt)與干擾效率的關(guān)系1.

PT---空白對(duì)照，只有支架沒(méi)有環(huán)pZEase