實驗九用正交法測定幾種因素對蔗糖

實驗九用正交法測定幾種因素對蔗糖第一頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二實驗原理酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應的速度。通常是在其他因素恒定的條件下，通過對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定，求得該因素對酶活力的影響，這是單因素的簡單比較法。本實驗用正交法測定溫度、pH值、底物濃度和酶濃度四種因素對蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實驗方法。第二頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二正交法是通過正交表安排多因素實驗，利用統(tǒng)計數(shù)學原理進行數(shù)據(jù)分析的一種科學方法，它符合“以盡量少的試驗，獲得足夠的、有效的信息”的實驗設計原則。正交試驗法的程序為下列八個步驟：（1）確定試驗目的。實驗目的是多種多樣的，如找出產(chǎn)品質(zhì)量指標的最佳組合、確定最佳工藝條件等。本實驗的目的是為了提高酶的反應速度，提高酶的活力。（2）選擇質(zhì)量特性指標。應選擇能提高或改進的質(zhì)量特性及因素效應。對于本實驗來說就是產(chǎn)物（葡萄糖）生成量的多少。（3）選定相關(guān)因素。即選擇和確定可能對實驗結(jié)果或質(zhì)量特性值有影響的那些因素，可人為控制與調(diào)節(jié)的因素，如溫度、pH等。這些因素之間有相互獨立性。（4）確定水平。水平，又稱位級，是因素的一個給定值或一種特定的措施，或一種特定的狀態(tài)。水平也就是因素變化的各種狀態(tài)。在確定水平時，應考慮選擇范圍、水平數(shù)和水平位置。如本實驗的溫度水平可以選擇20℃、30℃、50℃三個水平。第三頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二（5）選用正交表。應從因素數(shù)、水平數(shù)以及有無重點因素需要強化考察等各方面綜合考慮選用正交表。一般情況下，首先根據(jù)水平數(shù)選用2或3系列表，然后，以容納試驗因素數(shù)，選用實驗次數(shù)最少的正交表。如有重點考察的因素，則根據(jù)其多考察的水平數(shù)，選混合型正交表。（6）配列因素水平，制定實驗方案。按隨機原則，把因素配列于選用的正交表中，制定實驗的順序、時間等，即制定實驗具體方案。（7）實施實驗方案。按實驗方案，認真、正確地試驗，如實記錄各種實驗數(shù)據(jù)。（8）實驗結(jié)果分析。對實驗中取得的各種數(shù)據(jù)進行分析。如從數(shù)據(jù)中直接選出符合或接近質(zhì)量特性期望值的實驗條件組。如不能采用直觀分析方法，則應采用其他分析方法，確定各因素主次地位可用極差分析方法，定量分析各個因素對實驗結(jié)果的影響程度，則用方差分析方法。

第四頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二操作方法

1.實驗設計：

1）確定指標：即實驗的結(jié)果。本實驗的指標是酶活力。這里，用A520值表示。

2）制定因素水平表：考察四個因素（溫度、pH值、底物濃度和酶濃度），每個因素取三個水平（如溫度選擇20℃、35℃和50℃三個水平）。水平是因素變化的范圍（通常是根據(jù)專業(yè)知識確定。如無資料可借鑒，應先加寬范圍再逐步縮?。﹥?nèi)要進行實驗的具體條件，如表1。

第五頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二表1因素水平表

因素水平A溫度（℃）BpH值C底物濃度（ml）D酶濃度（ml）1202.50.100.022354.50.30.063506.50.60.1Note:各組可根據(jù)自己的設計選擇相應因素的水平變化范圍如：溫度的選擇可為25℃、35℃、55℃。第六頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二3）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本實驗不考察各因素間的交互作用，也沒設計混合水平，只有水平數(shù)均為3的的四個因素，故選用L9（34）表，見表2。分析：

A.判斷各因素的水平范圍是否選偏；

B.判斷各因素顯著性大小的順序；

C.判斷實驗結(jié)果的置信度。4）實驗安排:根據(jù)因素和各因素的水平條件設計實驗。（見表3）第七頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二表2正交表L9（34）（舉例）列號試驗號1（溫度）

2（pH）3（底物濃度）4（酶濃度）111112122231333421235223162312731328321393321第八頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二表3、實驗安排（舉例）管號試劑168249357蔗糖溶液Ml0.10.30.60.10.30.60.10.30.6緩沖液pH體積？4.01.886.01.645.0？5.0？4.0？6.0？6.0？5.0？4.0？溫度（預熱）252525353535505050酶液Ml0.020.060.10.060.10.020.10.020.06溫度5min252525353535505050準確反應5分鐘,加0.5ml二硝基水楊酸,2.5mlNaOH,沸水浴5分鐘,冷水沖3分鐘,以“0”管520nm調(diào)“0”測A值.進行極差分析，找出何種條件下酶活力最高，影響最大的因素和最小的因素。第九頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二具體操作步驟：

1、將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于試管中。2、將酶粉用蒸餾水溶解（適當體積10-30ml不等），離心去除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。3、酶活預示實驗，確定酶的稀釋倍數(shù)。（可根據(jù)產(chǎn)物稀釋的倍數(shù)來確定酶的稀釋倍數(shù)）A520在0.4-2.0之間即可。4、準備10支試管。其中一支為“0”號管，作為測量時的參比溶液。其他九支試管根據(jù)前面的圖表3加入相關(guān)的溶液，分別在不同的條件下進行酶反應。利用二硝基水楊酸的方法測定不同管在A520下的光密度值。5、計算同一因素不同水平的級差，級差小代表離散度小，表示該水平為酶反應的最適條件。第十頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二1）數(shù)據(jù)記錄：將上述兩組平行實驗的結(jié)果取平均值后的9個數(shù)據(jù)，填入表4中的Yi項內(nèi)。2）數(shù)據(jù)整理及分析：對于一般的實驗，可用極差分析，該分析方法簡單、直觀。對要求精細的實驗，則要用方差分析，該方法可給出誤差的大小估計，但有一定的計算量。對于有混合水平的正交實驗，只能用方差分析。本實驗，只使用極差分析：A.計算出各水平實驗結(jié)果總和，即第1、2、3、4列上的k1、k2、k3，并求出k1、k2、k3和k的R值（極差）。B.選出優(yōu)水平組合：據(jù)R值的大小，排出因素顯著性的順序，并比較k值選出優(yōu)水平組合（即好的實驗條件）。由上述數(shù)據(jù)分析及驗證實驗，討論在本實驗條件下，溫度、pH值、底物濃度和酶濃度對蔗糖酶活性的影響；求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值。數(shù)據(jù)記錄和分析第十一頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二因素水平A溫度（℃）BpH值C底物濃度（ml）D酶濃度（ml）120℃K1和R2.5K1和R0.10K1和R0.02K1和R235℃K2和R4.5K2和R0.3K2和R0.06K2和R350℃K3和R6.5K3和R0.6K3和R0.1K3和Rk1、k2、k3代表各水平測量結(jié)果的總和，R代表各水平測量結(jié)果的級差。數(shù)據(jù)的計算整理（舉例）第十二頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二

討論

A.根據(jù)上述的計算結(jié)果，畫出各因素的趨勢圖以判斷各因素的水平范圍是否選偏；B.對從9次實驗結(jié)果中選出的較好實驗條件、根據(jù)計算比較選出的優(yōu)水平組合和綜合比較后設計的較好方案，進行驗證實驗（今天不