實驗五 離子交換柱層析法分離氨基酸

實驗五離子交換柱層析法分離氨基酸第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二目的要求（1）學習采用離子交換樹脂分離氨基酸的基本原理。（2）掌握離子交換柱層析法的基本操作技術。第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的層析方法。?

即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團交換反應的過程。第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二離子交換過程示意：起始吸附解吸完成x+:起始緩沖離子

y+：待分離離子

z+：待分離離子

第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團即離子交換劑。（一）按活性功能基團帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑—

帶負電荷，與陽離子交換陰離子交換劑

—

帶正電荷，與陰離子交換第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二（二）按載體種類不同1.離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）二乙烯苯交聯(lián)度=————————×100%苯乙烯+二乙烯苯第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下，以采用交聯(lián)度較高的樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選擇性。第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二目數(shù)：離子交換樹脂的顆粒直徑大小Dowex50為20-50目Dowex20840m50297m100149m（代表二乙烯苯的百分含量）第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二樹脂resin（據(jù)所含交換基團的性質(zhì)分）陽離子交換樹脂

強酸型含磺酸基團(R-SO3H)中等酸型含磷酸基團(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂

強堿含季胺基團[-N+(CH3)3]弱堿含叔胺、伯胺基團[-N(CH3)2

陰離子交換樹脂對化學試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。

第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二2.離子交換纖維素陰離子交換纖維素—如:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基陽離子交換纖維素—如:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二3.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二三、操作注意點

（一）離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇—同一性質(zhì)離子交換劑中選用對被分離物質(zhì)各組分之間結合力差異大的型號交換劑，以保證通過離子交換層析后能得到比較滿意的結果。第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二考慮因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二根據(jù)分離過程的實驗條件強酸強堿—應用廣泛弱酸型—只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型—只能在酸性pH范圍內(nèi)使用第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二（二）緩沖液的選擇原則：不能發(fā)生化學反應，所帶電荷應與樣品一致。避免使樣品變性第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二(三)洗脫劑

原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團改變pH或離子強度增強洗脫液與離子交換劑的結合力降低分離物與離子交換劑的結合力洗脫方式：梯度洗脫第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二四、應用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二離子交換層析法分離氨基酸及測定

第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二[原理]

所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI9.74)，在緩沖溶液中分別帶正電荷和負電荷，與強酸型陽離子交換樹脂Dowex50親和力有很大不同，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應生成有色化合物進行氨基酸鑒定。第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測定和紙層析顯色與水含茚三酮的反應：第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

AspLyspH4.2pH>10第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二[器材]

1.

層析柱等2.

沸水浴第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二[試劑]

Dowex502mol/LNaOHpH5.3檸檬酸緩沖液樣品液：氨基酸混合液茚三酮混合液第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二實驗步驟1．樹脂的處理將干的強酸型樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理，做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。2．裝柱取直徑1cm,長度10－12cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經(jīng)處理的樹脂懸浮液，關閉層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量溶液，再加入一些樹脂，至樹脂沉降至8~10cm的高度即可。裝柱要求連續(xù)、均勻，無紋格、無氣泡，表面平整。液面不低于樹脂。第二十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二3．平衡將緩沖液瓶與恒流泵相連，恒流泵出口與層析柱入口相連，樹脂表面保留3－4cm液層，開動衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH與洗脫液相同。

4.加樣揭去層析柱上口蓋子，待柱內(nèi)液面至樹脂表面1－2mm關閉出口，沿管壁四周小心加入0.5ml樣品，慢慢打開出口，同時開始收集流出液。當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，即刻加入少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次，然后注入檸檬酸緩沖液至液面高3－4cm左右，接恒流泵。5.洗脫以緩沖液洗脫，開始用試管收集洗脫液，每管收集1mL，共收集60—80管。第二十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二6．洗脫及氨基酸的鑒定

向各管收集液中加1mL水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中準確加熱5min后冷卻至室溫，再加入3mL的0.1%硫酸銅溶液?；靹?，以收集液第2管為空白，測定A570波長的光吸收值，以光吸收值為縱坐標，以洗脫液體積為橫坐標繪制洗脫曲線。第二十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二實驗結果根據(jù)氨基酸的解離性質(zhì)，分析該實驗條件下氨基酸從層析柱洗脫下來的順序。第三十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二Separationofaminoacidsonacationexchangec