定量分析結(jié)題報(bào)告

涉及到LCSciences的公司商業(yè),請(qǐng)確保內(nèi)容您個(gè)人科研使用,并承擔(dān)責(zé)任.若擅自向任何第三人或者公司的內(nèi)容,根據(jù)國(guó)家有關(guān)法律、,LCSciences公司將有權(quán).I目介 材料和方 蛋白質(zhì)鑒 鑒定結(jié)果統(tǒng) 重復(fù)性分 肽段長(zhǎng)度分 蛋白覆蓋度分 蛋白質(zhì)定 實(shí)驗(yàn)標(biāo)記信 定量信息統(tǒng) 表達(dá)量層次聚類分 GO注 COG注 Pathway代謝通路注 差異蛋白的富集分 幫助文 蛋白鑒定及定 功能注 差異蛋白的富集分 iTRAQ技術(shù)是由應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）于2004年開發(fā)的同重標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量（isobarictagsforrelativeandabsolutetation，iTRAQ）技術(shù)。iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）連接的胺標(biāo)記同重元素。在一級(jí)質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。,我們已經(jīng)建立起一套成iTRAQ定量分析流程。包括成熟穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)流程，高分辨率、高靈敏度的質(zhì)譜系統(tǒng)ABSCIEXTripleTOF?5600plus，以及標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流475個(gè)蛋白（unique327個(gè)蛋145（up_regulate≥1.5down_regulate了功能注釋（GO、COG、Pathway分析），對(duì)所有顯著性差異蛋白質(zhì)做了表達(dá)量層次聚類分析以及功能富集分析（GO富集，Pathway富集）。通過(guò)這些分析，試圖挖掘有意義的蛋白。4.1，該項(xiàng)目的相關(guān)分析結(jié)果見./Project_data中，每級(jí)文件夾中都有命名為readme*.txt的文件說(shuō)明文件夾中的主要內(nèi)容。0123456789雙蒸水024686420工作液0 y=0.4415x-測(cè)定濃度HighpHC18柱是Duras C18（5μm，100?，4.6x250mm）。①LC-MS/MS質(zhì)譜設(shè)備規(guī)格：質(zhì)譜儀是ABSCIEXnanoLC-MS/MS(TripleTOF5600plus)，分析柱是ABSCIEX(75μm3μm，120?的ChromXPC1812cm），NEWobjective（20μm10μm)eksigentChromxpTrapColumn(3μmC18-CL,120?,350μm×0.5mm)。A:0.1%甲酸，5%B:0.1%甲酸，95%LoadingBuffer0.1%甲酸，3%0555定到的蛋白，認(rèn)為unusedscore≥1.3（即可信度水平在95%以上），每個(gè)蛋白至少包含一個(gè) Typeof iTRAQ8plex(PeptideLabeled Cys Bias ID Search ThoroughProtein 信息請(qǐng)參見Ident&Quant_SummaryResult.xlsx，該文檔的表頭解釋信息可參見第7.1鑒定肽段數(shù)器的穩(wěn)定性，重復(fù)性分析主要從同一樣品不同生物重復(fù)的CV值分析角度出發(fā)。均值的比值，用百分?jǐn)?shù)表示，具體表達(dá)式為CV（SDMEAN）×100。3.1表示不同樣品的CVCV20%時(shí)，兩組樣Case，ControlCV25.48%、20.24%，相對(duì)來(lái)說(shuō)，Case樣品的CV值更加集中在低值區(qū)域，說(shuō)明Case樣品的重復(fù)性更好。CV 100CV 1001200 03.2CVCV值的對(duì)比，不同顏色的盒形圖CVCV值中位數(shù)都小于40%3.2自左向右各個(gè)盒子的CV中位數(shù)分別為35.54%，32.04%，說(shuō)明本Numof40508090CumulativepercentUnique肽段為僅在一個(gè)蛋白質(zhì)中存在的肽段。由這類型肽段的存在，可以唯一地確定unique肽段數(shù)，左側(cè)縱坐標(biāo)為與橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)的蛋白數(shù)目；右Numof40508090Cumulativepercent001020123456789101112131415161719001020Numofunique3.416.59，PeptidesPeptides810131619222528313437Peptides3.5蛋白質(zhì)32.21%，覆蓋度大于等于20%的蛋白占總蛋白的47.37%，平均蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋度為

其次利用重復(fù)樣品間兩兩比較單樣本Student’st檢驗(yàn)的p-value中的最小值作為待比較樣品間倍及以上（即up_regulate≥1.5和down_regulate≤0.67），且經(jīng)過(guò)顯著性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其Pvalue值表4.1 比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上（1.5倍），且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其4.1。理論上對(duì)數(shù)化的比值分布近似服從正態(tài)分布。我們的結(jié)果顯示， Protein - - 層次聚類分析可以直觀地將相似度較高的樣品/蛋白到一起。如果按列對(duì)樣品進(jìn)行4.2差異蛋白層面的層次聚類結(jié)果。行代表蛋白聚類情況，列代表樣品對(duì)聚類情況。隨著蛋白質(zhì)比值從ProteinProtein0 05.1不同功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。橫坐標(biāo)表示鑒定或者不同的注釋方法，縱坐標(biāo)表示對(duì)應(yīng)于橫坐標(biāo)的蛋白都具有注釋信息，GO387個(gè)蛋白質(zhì)，COG135個(gè)蛋白質(zhì)，KEGG注釋到302個(gè)蛋白質(zhì)。GO新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表（controlledvocabulary）來(lái)全面描述生物體中和產(chǎn)物的屬性。GO總共有三個(gè)本體（ontology），分別描述的分子功能（molecularfunction）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）、參與的生物過(guò)程（biologicalprocess）。更詳細(xì)信息見。go2protein。見./Project_data/Function/All_ID_GO文件夾*.protein2go.xls。中所涉及的GOclassID及蛋白個(gè)數(shù)，結(jié)果見5.2GO分類。GO分類圖顯示了三個(gè)本體中所涉及到各條目的分布情況，不同顏色標(biāo)記為三個(gè)本體中涉比分析兩者的GO注釋結(jié)果，相應(yīng)的柱狀圖見5.3。差異蛋白質(zhì)的注釋結(jié)果見：./Project_data/Function/*_down_ID_GO和*_up_ID_GO。COGCOG（ClusterofOrthologousGroupsofproteins蛋白相鄰類的聚簇）是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。構(gòu)成每個(gè)COG的蛋白都是被假定為來(lái)自于一個(gè)祖先蛋白，并且因此進(jìn)化而來(lái)的蛋白，并且典型的保留與原始蛋白有相同的功能。Paralogs是那些在一定物種中COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)這些蛋白可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。圖5.4是本次鑒定結(jié)果比對(duì)到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)圖。/5.4COG分類。COG條目，縱坐標(biāo)為蛋白數(shù)量。該圖表示樣品中不同功能的蛋白質(zhì)的統(tǒng)計(jì)步了解其生物學(xué)功能。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)（Kanehisa，2008），通過(guò)Pathway5.5是其中一個(gè)通路的注釋情況，所有鑒定蛋白質(zhì)Pathway注釋的詳細(xì)結(jié)果請(qǐng)參StatisticsofUp-Regulated StatisticsofDown-Regulated25

25

40132722

12

11

41916

16

1212

9

9

9

666ComplementandcoagulationcascadesStaphylococcusaureusinfectionSystemiclupuserythematosusDilatedcardiomyopathyViralmyocarditisAllograftrejectionAutoimmunethyroid

ComplementandcoagulationcascadesSystemiclupuserythematosusStaphylococcusaureusinfectionArrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy(ARVC)PriondiseasesMetabolicpathwaysECM-receptorinctionRegulationofactincytoskeleton圖5.6列示了注釋到Case/Control上調(diào)和下調(diào)差異蛋白質(zhì)數(shù)目前十的Pathway功能統(tǒng)計(jì)餅圖，從圖中可以看出，前10的Pathway代謝功能類型在所有上調(diào)和下調(diào)差異蛋白質(zhì)中有所不同，兩者Pathway功能注釋結(jié)果前10的功能中相同的有5種：coagulationcascades”在下調(diào)差異蛋白質(zhì)功能注釋結(jié)果中的比例有所升高。差異蛋白質(zhì)的Pathway注釋結(jié)果見：./Project_data/Function/*_up_ID_Pathway和*_down_ID_Pathway。GO功能顯著性富集分析給出與所有鑒定到的蛋白質(zhì)背景相比，差異蛋白質(zhì)中顯著富集GO功能條目，從而給出差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異1.5Pvalue0.05時(shí)，視該蛋白為不同樣品GeneOntology數(shù)據(jù)庫(kù)（）的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的蛋白質(zhì)數(shù)目，然后應(yīng)用MNMP1m1inin n 其中NGO注釋信息的蛋白數(shù)目，n為N中差異蛋白的數(shù)目，M為GO條目的蛋白數(shù)目，mGO條目的差異蛋白數(shù)目。計(jì)算得到P-value值，以P-value<0.05GOterm定義為在差異蛋白質(zhì)GO功能富集詳細(xì)結(jié)果見./Project_data*/Enrient/*_GO_enrient文件夾GeneOntologyProteinfrequencyofP-122outof138genes,305outof387genes,

122outof138genes, 305outof387genes,78.8% 122outof138genes, 305outof387genes,78.8% 126outof138genes, 322outof387genes,83.2% 125outof138genes, 320outof387genes, 136outof138genes, 362outof387genes, 130outof138genes, 340outof387genes, 130outof138genes, 346outof387genes, 18outof138genes, 33outof387genes, sphericalhigh-densitylipoprotein

18outof138genes, 33outof387genes, 6outof138genes, 8outof387genes, 13outof138genes, 23outof387genes, 130outof138genes, 349outof387genes, etalphagranule 16outof138genes, 31outof387genes, 3outof138genes, 3outof387genes, 15outof138genes, 29outof387genes, 15outof138genes,29outof387genes,注:GeneOntologytermGO條目。ClusterfrequencyGO條目的差異蛋白的數(shù)量和比值。ProteinfrequencyofuseGO條目的所有蛋白的數(shù)量和比值。P-value為通過(guò)超幾何檢驗(yàn)計(jì)算得到P-value值PathwayGOKEGGPathway為單位，應(yīng)用Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 5252

1.6e-

2.6e- Percentof6.2Case/ControlPathway富集分析顯著性統(tǒng)計(jì)圖。圖中反映了不同功能通路下的顯著性差圖6.1為Case/Control差異蛋白質(zhì)Pathway富集分析中的一個(gè)通路圖，比值差異蛋白pathway富集分析詳細(xì)結(jié)果見./Project_data/Enrient/*_Pathway_enrient文件夾內(nèi)差異蛋白質(zhì)Pathway富集分析顯著性統(tǒng)計(jì)圖見./Project_data/Pathway_Enrient_Figure。本項(xiàng)目的所有鑒定、定量的詳細(xì)結(jié)果在文件./Project_data/Ident_Quant_result/白層次、譜圖（PSM）7.1列出了Proteins表格的表頭及注釋，表7.2列出了Spectra表格的表頭及注釋。差異蛋白質(zhì)的詳細(xì)結(jié)果在文.列 含 Same Protein Protein #of #ofUnique UniquePep. #of #ofUnique Unique #ofquantSpectra 列 含 Prec Prec Theor Theor 該譜圖在Protein Area 列 含 蛋白質(zhì)在樣品中的差異狀態(tài)，down表示下調(diào)，up表 該蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)到pathway富集分析中的通路，通路編*.pngGO分類圖（標(biāo)量圖）*.fa.GO2protein.xlsxGO分類文件（GO條目表 含 ponent或 GO 第一 第二 其余 GO表 含 文件