溶菌酶的制備酶活力和蛋白濃度的測(cè)定

溶菌酶的制備酶活力和蛋白濃度的測(cè)定第一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的來(lái)源：1922年的一天，正在感冒的英國(guó)細(xì)菌學(xué)家AlexanderFleming發(fā)現(xiàn)，把一些鼻粘液加入細(xì)菌的培養(yǎng)基后會(huì)引起細(xì)胞的溶解。而這種存在于鼻粘液中的能殺死細(xì)菌的重要物質(zhì)被認(rèn)為是一種酶，F(xiàn)leming命名其為溶菌酶（Lysozyme）。那時(shí)，溶菌酶不能證明有臨床價(jià)值。但是在酶機(jī)制的研究學(xué)習(xí)方面，溶菌酶扮演了一個(gè)很重要的角色。第二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的結(jié)構(gòu)在1965年,DavidPhillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射線(xiàn)晶體（X-raycrystallography）結(jié)構(gòu)分析法闡明了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)。第三頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的作用機(jī)制：溶菌酶是一種N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，該酶可以催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，使內(nèi)容物溢出而是細(xì)菌溶解，阻礙致病細(xì)菌的活性繁殖，并殺死細(xì)菌。第四頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)看法第五頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備本實(shí)驗(yàn)主要是以雞蛋清作為實(shí)驗(yàn)材料，采用D152型樹(shù)脂柱層析法除去雜蛋白及等電點(diǎn)法提取溶菌酶的粗品第六頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備：雞蛋清中約含有0.3％的溶菌酶，分子量為14，000，等電點(diǎn)為11.1，最適溶菌溫度為50℃，最適pH值為7。雞蛋清溶菌酶化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，當(dāng)pH值在1.2～11.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)，其結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變，遇熱時(shí)該酶也很穩(wěn)定，在pH4～7的范圍內(nèi)，100℃處理lmin，仍保持原酶活性。但在堿性環(huán)境中，該酶對(duì)熱穩(wěn)定性較差。其一級(jí)結(jié)構(gòu)由129個(gè)氨基酸殘基組成的一條多肽鏈，其穩(wěn)定性主要與多級(jí)結(jié)構(gòu)中的4對(duì)二硫鍵、氫鍵及疏水鍵相互作用。人溶菌酶的溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。第七頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備實(shí)驗(yàn)主要儀器、材料及試劑：（一）主要儀器：

高速冷凍離心機(jī)、恒流泵、部分收集器（二）材料及儀器：

D152大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，新鮮雞蛋，0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，pH7.0,氯化鈉，硫酸銨，0.5mol/LNaOH,0.5mol/LHCl,層析柱（2.6cm*30cm）,無(wú)水乙醇，聚乙二醇第八頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備實(shí)驗(yàn)步驟：蛋清樣品的制備：

取出蛋清，加入1.5倍體積的0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，攪拌均勻，將pH值調(diào)至8左右，然后用八層紗布過(guò)濾，去濾液，量取體積并記錄。第九頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備實(shí)驗(yàn)步驟：陽(yáng)離子交換層析的制備：1、D152樹(shù)脂的處理：將D152樹(shù)脂先將蒸餾水洗去雜物，濾除，用1mol/LNaOH攪拌浸泡并攪拌4~8h，抽濾干NaOH,用蒸餾水洗近pH7.5左右，抽濾干，再用1mol/LHCl按上述方法處理樹(shù)脂，知道全部轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫?，抽濾干HCl，用2mol/LNaOH處理樹(shù)脂，是指轉(zhuǎn)變?yōu)殁c型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH6.5）平衡樹(shù)脂。2、裝柱：取直徑為2.6cm，長(zhǎng)度為30cm的層析柱，自頂部注入經(jīng)處理過(guò)的上述樹(shù)脂懸浮液，關(guān)閉層析柱出口，帶樹(shù)脂沉降后，放過(guò)量的溶液，再加上一些樹(shù)脂，至樹(shù)脂沉積至15~20cm高度即可。與柱子頂部繼續(xù)加入0.02mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH6.5）平衡樹(shù)脂。最終是流出液pH為6.5為止，關(guān)閉柱子出口，保持頁(yè)面高出樹(shù)脂表面1cm。第十頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶的制備裝柱吸附：將上述蛋清液仔細(xì)加入到樹(shù)脂頂部，打開(kāi)出口使其緩慢流如注內(nèi)，流速為1ml/min。去雜蛋白：取出樹(shù)脂，用柱平衡液洗去樹(shù)脂上可能有的雜蛋白。在手機(jī)洗脫液的過(guò)程中，逐管用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)雜蛋白的洗脫情況，當(dāng)基線(xiàn)開(kāi)始走平后，改用含1.0mol/LNaCl的pH值6.5、濃度為0.02mol/L磷酸鈉緩沖液洗脫收集洗脫液！聚乙二醇濃縮：將上訴洗脫液合并裝入透析袋內(nèi)，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加蓋。酶液中的水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得濃縮液之后的透析袋用蒸餾水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！小心取的濃縮版的溶菌酶溶液第十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)看法：與教科書(shū)P488頁(yè)制備方法不同的是：教材所選用的吸附方法使用磁力攪拌器攪拌蛋清液和樹(shù)脂，個(gè)人覺(jué)得此方法可以用于樣品較小的情況下，大約在300毫升以下！第十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶活力、蛋白濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑試劑配制實(shí)驗(yàn)步驟第十三頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶活力、蛋白濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑：（一）儀器：721分光光度計(jì)(二)材料及試劑：溶菌酶，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，溶壁微球菌干粉，氯化鈉，考馬斯亮藍(lán)G-250,95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）第十四頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶蛋白濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理：

棕紅色的染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，形成藍(lán)色的復(fù)合物最大吸光度由465nm變?yōu)?95nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白和染料的結(jié)合符合比爾定律。通過(guò)測(cè)定595nm處的光吸收值的增加量，可對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量測(cè)定。

第十五頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶活力、蛋白濃度的測(cè)定試劑的配制：1、測(cè)活緩沖液：含30mmol/LNaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.2。2、底物濃度：40mg溶壁微球菌干粉，榮譽(yù)100mL測(cè)活緩沖液中。3、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑;考馬斯亮藍(lán)G-250100mL95%乙醇中，加入100mL85%鹽酸，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過(guò)濾。4、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用含有0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0(緩沖液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述實(shí)驗(yàn)中所獲得的溶菌酶粗品液，榮譽(yù)100mL的測(cè)活緩沖液。第十六頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶蛋白濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定：取14支試管按下表，分兩組進(jìn)行平行操作：管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/mL0.000.010.020.030.040.050.06緩沖液A/mL0.100.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍(lán)G-250/mL5.005.005.005.005.005.005.00搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色A295第十七頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶蛋白濃度的測(cè)定按上表的數(shù)據(jù)，以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度：測(cè)定方法同上。去合適的未知樣品提及，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查處相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的Laing，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）第十八頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶蛋白濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)備注：

若樣品濃度超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍，則適當(dāng)加以稀釋?zhuān)♂屩翗?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍之內(nèi)的濃度！第十九頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶活力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)以溶壁微球菌為底物，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌懸液濁度的變化（OD600）來(lái)測(cè)定溶菌酶的活性第二十頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶活力的測(cè)定酶活力的測(cè)定：在室溫下，取2個(gè)試管，分別在1號(hào)管中加入3.0mL測(cè)活緩沖液，2.5mL底物濃度；2號(hào)管中加入2.5mL測(cè)活緩沖液，2.5mL酶液。以2號(hào)管為對(duì)照，根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)在721分光光度計(jì)上每隔30s測(cè)定1號(hào)650nm處的吸光值。按下列表格記錄是按結(jié)果：時(shí)間/s0306090120150180OD650第二十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三溶菌酶活力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理酶活力單位（U）：沒(méi)在溫室pH6.2條件下，OD650每分鐘強(qiáng)大0.001為1個(gè)酶活力單位U。比活力=活力單位/mg蛋白根據(jù)測(cè)得結(jié)果，計(jì)算各步數(shù)據(jù)填入下表：組分體積/mL蛋白/mg*mL-1總蛋白/mL活力/U*mg-1比活力