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文檔簡介
大蒜新素及其衍生物對兔癢螨的體外殺螨活性研究任方奎何小燕李逐波*通訊*通訊西南大學藥學院,E-mail:zb63@163(西南大學藥學院,重慶北碚400716)來源:原作收稿:2023-11-21南寧獸藥科技網(wǎng)上傳時間:2023-12-1編輯:dongy大蒜新素是從大蒜(Alliumsativum)中提取的一種具有很強刺激性的揮發(fā)性油狀物質(zhì),其化學名稱為二烯丙基三硫醚,該化合物可以人工合成[1]。大蒜新素具有很強的抗菌[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗癌[5]等多種藥理活性。但大蒜新素在抗寄生蟲方面的報道很少,LunZR等[6]曾報道大蒜新素可以治療賈第蟲病和有溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)和滴蟲性陰道炎(Trichomonasvaginalis)等疾病。目前為止,大蒜新素及其衍生物對兔癢螨的研究還未見報道。本文主要研究大蒜新素及其衍生物對兔癢螨的體外殺螨活性,測定半數(shù)致死時間(LT50)和半數(shù)致死濃度(LC50),并對大蒜新素及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系進行了初步探討。1試驗材料1.1供試動物自然感染螨病的家兔6只,雌雄兼有,平均體重2.0±0.5kg。由重慶市北碚區(qū)某兔場提供。1.2儀器與試劑倒置顯微鏡,20孔細胞培養(yǎng)板,挑蟲針,大蒜新素(南通鑫利化工,批號:XY070705),二丁烯三硫醚、二戊烯三硫醚和二己烯三硫醚均有本實驗室合成[7],伊維菌素(河北威遠動物藥業(yè)),硫軟膏(成都明日制藥)。2方法2.1藥品配制精密稱取1.0g大蒜新素及其衍生物于10mL的容量瓶內(nèi),加0.1mL吐溫-80用水定容至刻度,混勻,即得100mg/mL的儲備藥液,4oC冰箱中保存?zhèn)溆?。精密稱取0.25g的阿維菌素于10mL的容量瓶內(nèi),加0.1mL的吐溫-80,用水定容至刻度,混勻,即得濃度為25mg/mL的阿維菌素,作為陽性對照液。取0.1mL的吐溫-80于10mL的容量瓶內(nèi)用水定容,作為陰性對照液。2.2離體殺螨試驗[8][9]癢螨的采集用小鑷子剝?nèi)∽匀桓腥掘x病家兔的耳道痂皮及膿血置平皿內(nèi),平皿邊緣涂少量的硫軟膏。置30oC溫箱內(nèi)保存30min使蟲爬出,借助放大鏡,用挑蟲針挑取螨蟲,在顯微鏡下對兔癢螨的形態(tài)學進行觀察[10],鑒定為兔癢螨。殺螨活性的測定冰將試謀驗分畜為藥屢物組黃、陽木性對西照組贈和陰廳性對憶照組賤。藥敢物組花:在嚷20大孔細載胞培矮養(yǎng)板犬的每耀孔各擇加入層10途0m霧g/熟mL戶供試純藥物趟0.襯2m姥L。劣陽性斤對照竄組:民20旅孔細款胞培塑養(yǎng)板累每孔尖各加辜入1娘0m貴g/效mL活的阿嘴維菌圓素0焰.2神mL柜。陰嚷性對常照組稿:在晴培養(yǎng)符板的堤每個麗孔中譜加0澇.2尚mL穗的陰削性對雪照液鈴。每透組設驕置3尤個重儀復。速每孔擱放置莖癢螨工10角只,謙在1舒0銀×犯40洲倍顯撈微鏡姿下觀押察,爪分別蔥記錄益螨的廳死亡兆時間晨。判右定標豪準:爽蟲體宜淋巴冬液流漠動,激蟲體螺不動哭但刺服激有哲反應壯或長蘭時間重微弱舞顫動跳為麻拌醉;壁蟲體云淋巴睡液靜扇止,碰蟲體煩完全背不動海,刺仆激無費反應析,判贈定為布死亡付。疊2.寧2.疲3欺半辰數(shù)致脅死時蓮間嶼(L集T懼50跨)悟的測逐定虹將大餓蒜新柳素及糠其衍攏生物泰的儲倒備液皆用水窮稀釋起成濃輔度為騎20姿mg際/m壯L,瀉挑取獻10很只螨核蟲置熄于2壟0孔懶的細衰胞培式養(yǎng)板蔬中,粥每個辯孔加糟0.鉛2m承L藥詳物,打設置狀3個寺重復剝,同啦時以甚陰性發(fā)對照者液為撫陰性倒對照裳。給汽藥后恥用顯矛微鏡辮觀察果,直果至所宜有癢趁螨死解亡,劃記錄何每個宿時段繼的死吸亡情或況。陳2.熊2.籍4氣半胞數(shù)致側(cè)死濃妹度伏(L背C償50訪)畏的測柔定士將大寬蒜新靠素及煉其衍寶生物委儲備至液先壓水稀騙釋成敗4m將g/眠mL垂,爛再倍長比稀帳釋成牌2.艦0m捷g/哲mL臨、1略.0籠mg寫/m宇L、培0.販5m旅g/互mL額、0菊.2極5m心g/榜mL耕和0信.1羨25變mg煌/m盯L5護個不區(qū)同濃星度,紹每個男濃度劣設置殼3個賓重復敞,同索時以持陰性葵對照雁液為墓陰性牙對照材。在抗培養(yǎng)惑板的蛙試驗察孔中構(gòu)各加且0.辨2m墨L不戶同濃女度的析藥物零,闊每孔稻挑入囑10尼只螨汁蟲。視將培商養(yǎng)板信放入寨測試熄環(huán)境解(2辮5愛o常C,銜相對么濕度貌為7惜5%嗚),飼24棕h后飾鏡檢咸死亡硬情況律。劇2.拆3胳統(tǒng)計遣分析競根據(jù)含機率廈值分甲析法賤,用節(jié)Ex厚ce樓l的腸卡方府檢驗茄運算柏程序假自動換判斷敵毒力奇回歸壘方程越的適袋合性此與否瞞[1洲1]識,計嶼算姻出臨LT丘50怒和喘LC皮50誰。您用踏SP泄SS僅1句2.搞0橡軟件咳對試臭驗數(shù)揭據(jù)進設行多粉因素全方差全分析佳。仁3瓣結(jié)果帆與分森析極3.平1卡殺螨味活性榨從表溪1中給可以某看出央,1失00混mg訴/m替L的尊大蒜妨新素蓄5m熔in熱開始神出現(xiàn)成螨蟲被死亡油,1文3m懷in幫全部碌死亡辦,2敢5m庸g/玉mL澤的阿賀維菌榆素5躁mi備n開奶始出促現(xiàn)螨牙蟲死扒亡,識17爆mi貸n螨黨蟲全鹽部死姻亡,下可見巖10盒0m魯g/尊mL開的大濃蒜新晴素與辣25烏mg滋/m瓦L的順阿維葡菌素戴的殺收螨活盈性差趣異顯掉著(悔P<尿0.遲05亞)。嬌從表再1中蘿可以墨看出邊,相臥同濃左度下袋的大里蒜新叫素衍逼生物抄的完摸全殺兵死螨奉蟲所掩需要液的時可間長塘于大自蒜新掃素,播大蒜助新素字與二糠丁烯充三硫座醚,扔二己壩烯三裕硫醚浸之間棗的差孝異顯抄著(激P<成0.狠05超),鈴與二浙戊烯冬三硫色醚的棵差異系不顯探著(提P>后0.渴05艦)。價二丁叛烯三責硫醚站、二瘋戊烯雨三硫濃醚與含阿維買菌素脖的差銜異不鞭顯著?。≒痰>0犬.0呢5)冒,與避二己刃烯三仔硫醚漂的差褲異極狂顯著脹(P促<0掀.0輕1)峽。大獄蒜新飽素衍第生物塞之間脆的差殲異顯記著(督P<飛0.傅05觀)。積可見躺,1壓00完mg職/m橫L大伏蒜新盡素與沙25雕mg勢/m稀L的頑阿維杜菌素絡殺螨鎖活性病相當乎,從看圖3悼中可蒜以看糞出隨講著鏈跡的延徹長大盞蒜新科素及諸其衍扔生物印的殺囑螨時地間呈辰現(xiàn)本“為N拴”需規(guī)律蠢變化婆。醬表1載大螞蒜新豬素及腸其衍行生物勵對兔替癢螨雕的離茶體殺純螨活扒性閣Ta山bl牲e課1叫Al謀li英ci慌n稿an夜d撈al愚li孕ci手n撓de暫ri抓va花ti肢ve蹄s蜂fo竊r敘th鄙e智ac辨ar蜓ic陜id盾al番a錘ct邊iv鳴it海y妹ag剛ai匙ns倒t緣P脖so宵ro販pt影es魔C浙un鍵ic統(tǒng)ul暫i電in也v鮮it岡ro梅組別疊藥物秘螨蟲墾數(shù)紫開始誠死亡島的時星間/貨mi減n妹全部陡死亡往的時服間/跨mi歉n協(xié)藥物剛組債10剪0m導g/導mL姨大蒜聞新素男10搬5燈±晨1震dD膠13錯±荷2脂eD亞10撒0m霧g/大mL裕二丁房烯三僅硫醚鐮10男10暈±摘1至cC渠20些±慈2紅cC俗10桂0m輔g/漢mL恩二戊恒烯三踩硫醚豪1后0話7快±屑1葡dC制D態(tài)15園±訂2壞de確CD絡10店0m州g/冶mL居二己略烯三箱硫醚憶10斤20乖±畢2忘bB煌35城±虎3戶bB聯(lián)陽性邀對照們組侵25左mg預/m榨L阿要維菌膀素舟10地5偏±雀1藥dD昏17眉±囑1論cd周CD禿陰性派對照貝組誠10木10抓80首±劃60累aA緩28拐80銜±抵0統(tǒng)aA漢同一峰列中確右上慈角標膊有不較同小削寫字挺母的倆數(shù)據(jù)頁之間詞差異恥顯著余(P話<0鹽.0蠻5)瞧,標李有不康同大歡寫字歌母的臺數(shù)據(jù)脹之間壘差異花極顯限著(嚇P<乖0.反01謝)。鄉(xiāng)陰性修對照金組4此8h廉(2今88叢0m袖in蒙)內(nèi)骨未完神全死鈔亡,恢全部脅殺死患時間摘以2鬧88袖0m羊in很計。筒3.要2巾半數(shù)啄致死仰時間避的計筒算00204060801001200123456789時間h死亡率%大蒜新素二丁烯三硫醚二戊烯三硫醚二己烯三硫醚陰性對照組余圖1理大拿蒜新慣素及礦其衍振生物錄在不工同時剛間的接累計餐死亡姿率音Fi抓gu忌re裙1芝暖Th平e在cu曲mu腿la窮ti煌ve屠m(xù)制or辨ta迷li捏ty均P汁so丸ro棋pt喜es取C貸un晝ic煤ul晌i轟of簽t好he帽a盟ll星ic星in熱a袋nd濫a聾ll包ic次in圾de牽ri瀉va墳ti金ve暢s胃in劈t榴he墓d害if舒fe箭re產(chǎn)nt慢t脂im過es技從圖管1中啦可以凈看出藥大蒜關(guān)新素蕉及其疏衍生址物對懂兔癢貸螨有悟很強叼的浸桿殺能鞠力,米在相也同濃挖度下蛋隨著碌作用表時間修的延梳長,撥癢螨劍的死浙亡率憂增加投。將金死亡筐率轉(zhuǎn)落化為芬概率倚單位廉求得逐不同炊化合洗物的芳毒力夾回歸銹方程乎可知釀,大寧蒜新病素及廁其衍貍生物快組中活兔癢朗螨的菠死亡佩率與豪作用準時間虛顯著提相關(guān)鑄(r若>0步.9拿84殊0)覆,即僅大蒜堪新素押的毒鉗力與竄作用憂時間佩呈正款相關(guān)燒,得蛾出大飾蒜新彼素、享二丁載烯三叼硫醚際、二不戊烯撈三硫有醚和園二己冶烯三伴硫醚同的壓LT朋50去分別疊為肝0.典62文67潑、1倦.1度03觀6、案0.大82油74讀和2截.2斑30染8。傲大蒜鼻新素寒及其盆衍生抽物之眼間的氧LT氣50仿存在采極顯酒著差吵異遼(P那<0晚.0揭1)脖。陰猶性對宿照組斗無癢撇螨死惡亡。宣可見睬,2故0m評g/軟mL棵的大赴蒜新沙素及博其衍健生物訓有較導小的它LT肚50派,大監(jiān)蒜新稍素及猛其衍鎮(zhèn)生物短的的巖毒性衫比較輪大。壇從圖蘿3中勿可以報看出哭隨著鉗碳鏈蜜的延己長揚LT疼50呆的數(shù)拴值呈紡現(xiàn)絞“網(wǎng)N泡”只變化歇。繡表2掃大打蒜新緩素及胖其衍易生物池對兔斑癢螨頁的毒盒力(里LT鉗50太)的罵幾率洞值回擠歸分瞧析震Ta懇bl害e貨2玻Pr伯ob身it需r組eg燕re祖ss完io臂n椒an員al限ys帖is佩o路f趴to彈xi廟ci盛ty政(L任T拖50危)o變f女t括he夾A負ll葬ic艘in刺丸an全d愛al鈔li嘴ci柔n始de救ri堂va顯ti貍ve錫s艱Ps物or經(jīng)op閑te由s汽Cu攜ni生cu餅li土i嫂n垂vi用tr卸o親藥品青濃度庫mg求/m救L反回歸籌方程蔥LT叔50比/h茄卡方墓值慢χ刃2沖相關(guān)惕系數(shù)乓r律大蒜叼新素箱20浙y=襲5.膏51雄81扒+結(jié)2.滑55幟33沫x頁0.拾62交67胖D妹0.好00摸04旁0.境99竹99下二丁奮烯三袍硫醚關(guān)20否y=腫4.島90辦26那+這2.堤27放38趴x乓1.挑10昂36扮B壞0.娘10想08奇0.飄99姜11鴨二戊窩烯三舍硫醚都20債y=慌5.政16身75斃+2貓.0在34小7鋪x件0.昂82交74鄭C望0.脈14譯30托0.依99效68聯(lián)二己劫烯三察硫醚泊20賣y=躬4.于28梨56絲+2輔.0螞50艷3僅x卵2.躺23魯08跳A繼0.取15勸57徑0.喇98執(zhí)40睜同一魄列中份右上摧角標咐有不前同大脈寫字命母的谷數(shù)據(jù)擋之間尤差異棋極顯棍著(矮P<截0.過01匆)。脆3.采3矩半數(shù)玉致死洲濃度位的計麥算0010203040506070809010000.511.522.5濃度(mg/mL)死亡率%大蒜新素二丁烯三硫醚二戊烯三硫醚二己烯三硫醚君圖2炒不熊同濃蹤度大衫蒜新臂素及描其衍蓋生物鉆對兔餅癢螨店的時24箱h陶致躺死率繩Fi纏gu局re鞠2纖種Th刮e疏mo博rt握al宿it乏y惑of街d民if愿fe閑re深nt賊c聰on膠ce敗nt應ra肝ti胸o余ns棕o賣f趣t老he儉a份ll舞ic淺in信務an腎d欲al泡li遣ci倒n域de湯ri哈va寬ti撫ve稅s化Ps風or僑op撥te園s款Cu贈ni沖cu若li也a劍ft鋸er擇2死4西h繳從圖顧2中但可以涼看出沖大蒜繼新素耕及其吹衍生雞物隨共著濃蜓度的褲增加刪,螨嶄蟲的稱死亡迅率增蜂加。飛根據(jù)請幾率瞇回歸僅分析環(huán)所得還的毒政力回粉歸曲團線可匆知,呀大蒜健新素卸及其杠衍生傷物的滿濃度婚與螨屆蟲的藏死亡息率顯懸著相昂關(guān)眉(r瞧>0音.9燭58帆1)抽,表古明癢造螨的拳死亡陸率與蝴濃度療間具溪有依斃賴性銹關(guān)系手,表淚2。莫大蒜鋸新素轟、二派丁烯蘇三硫費醚、援二戊踩烯三言硫醚吉、二誓己烯辭三硫明醚的榨LC朱50休分別酸為伸0.貿(mào)65申09偏、1傍.0垃98翻、0域.5坡33喇0、京1.掙20勝71冶。大程蒜素旁新素朝及其灘衍生散物之榆間的畝LC程50儉差異哭極顯委著(潛P<閱0.幻01究)醒。板陰性雄對照談組無經(jīng)癢螨靜死亡床。呼表3訂大貼蒜新圈素及佳其衍始生物裝對離或體兔傻癢螨冶毒力蝦(杯LC嘉50蛾)的刷幾率砍值回退歸分心析泰Ta龍bl搏e輝3狂志Pr尊ob筒it溉r雅eg辛re援ss顛io壩n蜻an誕al短ys華is盈o鵲f禾to斬xi蘆ci噴ty斑(L苦C畜50妄)o丈f慰th衫e排al佳li充ci漢n百a愛nd鬧a曬ll戒ic微in型d席er桑iv既at篩iv起es望P翼so悄ro骨pt梨es與C余un梳ic話ul科i再in憑v膝it鉛ro律濃度衡mg斤/m剪L聚回歸餃方程大半數(shù)眼致死扯濃度己/h歷卡方斬值悅χ偶2仗相關(guān)監(jiān)系數(shù)對大蒜似新素柜y=咱5.溉30董5x筍+1圾.6抵33絞1駁0.預65更09茅D早0.霸23救31敗0.中99強14膝二丁辦烯三擊硫醚趴y=赤4.息93倒15補x+俘1.蘭68逼41自1.薪09難80端B顯0.繞87絕94徹0.揚95秀81齊二戊天烯三此硫醚追y=餅5.偷49努70享x+渾1.朝81蓮85穴0.扎53極30攀C墳1.欺19豈56伐0.拖96躬33幕二己近烯三批硫醚栗y=剝4.項88匠20曲x+眼1.綁44放48牛1.蜘20鳥71碧A頂0.弄48惑20紋0.滔96躺88毅同一增列中芽右上于角標武有不屯同大閉寫字解母的螞數(shù)據(jù)椒之間竹差異譜極顯薄著(引P<詳0.齒01字)。沒可見復,大圓蒜新宣素及盯其衍寨生物技有較高小的帖LC跡50貍,大絹蒜新何素及形其衍盾生物冠對兔獸癢螨播的效強果好奮。從蘆圖3鳴中可俊以看嘴出隨圖著碳育鏈的能增加準LC抓50孕的變得化呈注現(xiàn)作“卡N屢”厭樣曲最線變引化。000.511.522.55678910111213碳原子個數(shù)LT50(h)LC50(mg/mL)殺螨的時間(min)寇圖3纖大葬蒜新桂素及堡其衍癥生物翁隨著吹碳原現(xiàn)子數(shù)鄉(xiāng)的增半加殺錫螨時搜間,霉LT總50進,L迷C旦50訓呈庭“盒N塘”杯樣曲夕線規(guī)們律變召化挪Fi體gu臉re騰3繡辜Wi品th鴨i液nc街re錄as此in亡g曉th熔e煤nu用mb做er碼o址f尚ca駛rb病on津a旁to線ms練,泊a含ca爹ri潤ci鑼da疤l割ac虛ti弊vi使ty乎,塵L頭T西50李勝an社d遞LC碎50味o把f坊al慌li苦ci概n泡an糠d刷it回s交de包ri鞠va懲ti籌ve敵s渴sh釘ow圣厲“千N物”猾c伏ha庸ng孟es真.臨4株討論戚4.歌1脆兔癢習螨病風是由學癢螨讓科的沙螨蟲槍主要滅寄生忽在兔缺耳部挨的一鋸種慢小性寄掙生性模皮膚賓病,還本病姐的特載點是灰病死梁率低浮、感么染率脊高、漢傳播盈速度鵲快,儉導致臟病兔凱生長增發(fā)育撫緩慢陪,消歲瘦體威弱,望體重識下降蓬,機蟲體抵錢抗力蔑下降慧,飼雜料報尼酬降仔低,床給養(yǎng)際殖戶嘗造成雜很大當?shù)慕?jīng)籌濟損滔失。番試驗例結(jié)果扔表明仙,大彈蒜新壟素及迎其衍帳生物解對兔財癢螨馬很強耕的殺偷螨活誼性,價其活紗性具歌有時失間-銷濃度擴依賴抬性,狗大蒜胖新素傲及其混衍生揭物具避有速彼殺,鵝高效慘的特寄點,遞10鼻0誰mg錫/m游L柿的大爬蒜新裝素、閃二戊繳烯三映硫醚魔與2弦5緒mg榜/m罩L東的阿悟維菌奴素之志間差鍛異不晴顯著筑(捕P>常0.戒05首)。社4.廊2征阿維冬菌素稀是近綱年研目發(fā)的勁一種檢大環(huán)索內(nèi)酯束類殺袋蟲藥嫁,辛雖是巷一種棉低毒點、高裝效的愈抗寄細生蟲債藥,膊具有腰很強因的殺創(chuàng)螨活赤性,獄但近采年泄發(fā)現(xiàn)利這類劫藥在德環(huán)境紫中殘湊留會字造成企不良想的生辨態(tài)影爛響,認目前潑已經(jīng)喊有螨朵蟲對數(shù)阿維以菌素擁類藥喚產(chǎn)生預抗性外的報童道脈[1申2]辭。大閉蒜新蓮素及貼其衍慎生物盯可以歸通過刺化學釣的方牲法合寧成,碰作為咳中藥社成分片的大獨蒜新蝴素具誦有毒積性低雕、副嫁作用摟少、秩殘留異低等宗優(yōu)點掌,與周目前員廣泛壘應用蛾的生盟物殺獨蟲劑鞏阿維唱菌素作的殺湖菌活助性相吸當,做因此畏,大蝴蒜新型素及糞其衍五生物翻作為索植物勒源的薦殺蟲埋劑具份有廣嬌闊的顛應用枕前景留。至雅于大當蒜新弓素及釋其衍槳生物倍能否敏作為午殺螨敬劑還陣須進亮一步外深入南研究負,殺淘螨的秧機理弱也還急需要親進一飄步研乘究。強4.湊3衣試驗貼結(jié)果恰看出朱,大拆蒜新長素及施其衍禍生物敬對癢悉螨作淡用快呀,毒至性強戰(zhàn),具咳有較訴小的隊半數(shù)紅致死薯時間它(L認T法50盆)和阿半數(shù)紫致死繳濃度移(L評C湊50陣)滴,從波圖3鈴中可編以看尖出隨目著碳燃鏈的篇延長澤對螨拘蟲的菠LT攻50講和表LC無50朋呈現(xiàn)弓“尾N逗”必樣曲尖線的鳥變化芒規(guī)律故。大惡蒜新抵素和素二戊姿烯三臺硫醚康的殺羅螨活貢性、薪LT慰50仆和博LC餓50喬相似博,二左丁烯沫三硫羽醚的際作用處次之結(jié),二疾己烯夠三硫布醚的魯作用縫最低償。這舊可能獅與化匙合物全的疏辯水性產(chǎn)、硫呈原子上的電誓荷及肉立體腫的變向化等笨多種錄因素財相互攜作用磁的結(jié)魚果有隙關(guān)。件參考籠文獻井[1斑]楊疾始剛宴.大通蒜新裁素二贊烯丙誠基三扯流化諸合物巖的化累學分陪析[致J]教.理慎化檢戒驗-虎化學哥分冊延,2棉00智3,償3(頓3)屯:1校42良-1依46撒.隙[2利]罩C襲ur戶ti芬s轎H嘗,區(qū)No場ll榨U勻,鞠St追?咽rm挪an雅n與J嗓,丈Sl烤us街ar膜en黨ko底桿AJ倍.繁Br爺oa艷d-飛sp蓄ec焦tr旋um助a纖ct去iv腹it費y洞of寒t浸he反v匪ol番at嗽il堆e飛ph漢yt烘oa怕nt煮ic居ip移in咬a仙ll欄ic聰in礎i錢n績ex貫tr朽ac右ts營o蓋f融ga調(diào)rl親ic校(匆Al級li散um張s偶at西iv璃um服L誘.穗)惰ag金ai屆ns譯t脊pl崇an曉t雅pa河th琴og雄en向ic樂b披ac滑te絨ri廈a,題f踏un和gi璃a親nd刻O逆om趟yc勻et咬es無[J劍].愈P鼓hy聽si皮ol據(jù)M辣ol頓P蹲la蔑nt太P濤at記ho鋸l字20需04召;僅65利:作79垃-8報9.昏[3梯]膨W璃eb酬er至N查D冊,諸An奧de戀rs束on減D淺O員,盯No均rt槳h昂JA燭,伏Mu證rr槍ay臉B穴K崗,膛La須ws闊on狀L下D銜,蔥Hu紐gh獻es倡B過G蹦.讓In濁v伯it眠ro獅v損ir嬸uc厘id賭al鈔e營ff叛ec測ts穴o販f慰Al蜜li吧um表s訓at粱iv薄um陶(袋ga梯rl多ic飽)飼ex戚tr洋ac腿t翠an越d寄co粘mp盤ou倡nd饑s襖[J涂].灣P乞la把nt疼a扭Me叛d茶19劑99對;蝦58緩:窯41絕7-塑23漁.胞[4梢]深W奪u螺CC坦,籠Ch女un湯g需JG恭,抽Ts筍ai份S等J哈,劈Ya武ng悅J丑H蹲,蒜Sh她ee平n血LY暈.骨Di袍ff放er埋en納ti礦al鵝e漏ff柏ec則ts璃o紡f頓al忘ly華l偽su梯lf畢id膛es旁f榜ro姥m粉ga公rl腐ic拌e代ss達en飾ti顏al隔o漲il揮o桂n蚊ce遣ll充c辭yc予le語r僵eg洞ul籠at柿io剃n塞in資h慚um盡an脹l魯iv公er餡t租um米or禾c冠el獲ls枯[季J]傻.摟Fo盼od各C造he城m攻To兩xi互co明l陡20親04興;梯42禿:市19競37安-4翁7.辟[5嘗]述O洗om水me淚n東S燒,無An羽to須R原J減,懶Sr崖in供iv頌as拜G駝,耕Ka薦ru輛na濫ga尤ra返n贊D翁.懶Al溉li過ci壞n昌(抽fr暑om啄g梅ar秤li嫂c)斬i糕nd掘uc竄es尾c叢as渣pa滑se缺m譯ed誓ia館-室te軟d敘ap坡op歷to秩si全s橫in命c貧an服ce琴r看ce拘l(wèi)l識s述[J限].刺E這ur息J匯P企ha愉rm漏ac腥ol蟻2責00功4;辨4烘85呢:衛(wèi)97淡-1招03蕩.亂[6訓]儀Lu繩n捐Z疏R,玉B隱ur統(tǒng)ri獎C怒,說Me拾nz覆in儀qe辛r迎M,窮e再t講al脾.施An誠ti膀pa丘ra正si葬t(yī)i倦c耳ac吊ti換vi遠ty揭o悶f析di縱al懇ly緊l爸tr由is倡ul吳fi索de湯(沾Da樓su隱an喜su截)把on蹈h系um爪an秧a察nd礎a視ni維ma呼l踢pa膊th堆og虧en回ic晨p篇ro潑to歡zo維a寸(T逃ry你pa栽no多so賠ma款s皮p.游,菊En某ta天mo啄eb阻a亞hi詞st冷ol朵yt妄ic鈔a冬an玩d慶Gi蓄ar槽di估a屈la乞mb輔li專a)務i紐n棒vi貴tr赤o虜[J燦].架A貢nn最al姓es萌d減e慢la抗S嫌oc湯ie讓te個B魂el臉ge書d鴿e擦Me連de投ci藍ne誤T掃ro狐pi曬ca尋le黑,栽19逢94談,膊74韻(1波):列5嗎1-山59楊.川[7見]鍬Re太n叫Fa玩ng逝ku革i,禾H奮e視Xi弄ao躲ya貸n,浸D電en崗g景Li要,疾et某a婦l.雙S湊yn館th禿es效is充a倍nd集A撇nt像ib輛ac封te咳ri廉a(chǎn)l餓A或ct保iv淘it歸y裁of慘1蠢,3蜓-D問ia經(jīng)ll套yl初-轟tr行is希ul納fa愧ne幸D秒er饅iv壘at垂iv株es辦[J海].抖割Bu奔ll拋.昏Ko拘
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