抗體的提取與純化

］抗體的提取與純化抗體的提取與純化（關(guān)鍵詞：抗體；抗體的提取與純化；鹽析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱層析純化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B親合層析純化IgG；離子交換層析）精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術(shù)，避免蛋白變性。如分離IgG時(shí)，多結(jié)合使用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應(yīng)用凝膠過(guò)濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過(guò)濾等。一、 鹽析法取xml血清加xml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。&4°C,3h以上，使其充分沉淀離心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。山置4C3h以上，［此時(shí)，（NH4）2SO4的飽和度為33%］重復(fù)上述第二步過(guò)程1?2次。末次離心后所得沉淀物為Y-球蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。山對(duì)PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色，即無(wú)NH4+為止。取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以751型紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。影響鹽析的因素很多，如蛋白質(zhì)的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結(jié)果，操作時(shí)要充分注意（參閱本章第二節(jié)）。二、 冷酒精沉淀法分離過(guò)程如下。血清加3倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.7（士）冷卻到0C。在激烈攪拌的條件下，加預(yù)冷的酒精（-20C）到最終濃度為20%，保持在-5C。產(chǎn)生的沉淀（A），含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15?20mol/LNaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸調(diào)節(jié)pH到5.1，產(chǎn)生的沉淀（B）,包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液內(nèi)。調(diào)節(jié)上清液的pH到7.4,加冷酒精（-20C?-30C）到最終濃度為25%，維持在-5C。所得到的沉淀（C）含有90%?98%IgG。不同動(dòng)物，IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見(jiàn)表2-5。從沉淀（B）可按下述方法進(jìn)一步分離出IgA和IgM的混合物：將沉淀（B）懸浮在0C水中，調(diào)節(jié)pH到5.1，離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié)上清液離子強(qiáng)度到0.01?0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最終濃度為10%，保持在-2C或-3C低溫，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。表2-5從幾種動(dòng)物和人血清沉淀A分離IgM的條件物種pH沉淀?xiàng)l件IgG產(chǎn)量酒精濃度（%）離子強(qiáng)度人5.115.0.0165山羊5.200.0165家兔5.2100.0170大鼠5.0150.0150豚鼠5.1150.0170三、DEAE-SephadexA-50柱層析純化免疫球蛋白原理：DEAE-SephadexA-50（二乙氨基一乙基-葡萄糖凝膠A-50）為弱堿性陽(yáng)離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的Y球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為pH6.85?7.5）,其余均屬酸性蛋白。PH7.2?7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有Y球蛋白不被吸附。因此，通過(guò)柱層析，Y球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG.（一）操作步驟1．DEAE-SephadexA-50預(yù)處理稱DEAE-SephadexA-50（下稱A-50）5g，懸于500ml蒸餾水內(nèi)，1h后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH15ml的比例，將A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作過(guò)程處理，最后以0.5mol/LNaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中過(guò)夜。2．裝柱（1）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開(kāi)關(guān)。（2） 將0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2?3cm高時(shí)，開(kāi)啟出水口螺旋夾，控制流速1ml/min，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。（3） 關(guān)閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過(guò)插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。3．平衡啟開(kāi)出水口螺旋夾，控制流速12?14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之pH值與離子強(qiáng)度，兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。4．加樣及洗脫啟開(kāi)上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（體積應(yīng)＜床體積2%，蛋白濃度以＜100mg為宜）。松開(kāi)出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2?3次；再放開(kāi)出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過(guò)程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12?14滴/min。5．收集開(kāi)始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3?5ml。共收集10?15管。6．測(cè)蛋白以751型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管OD280nm,與OD260nm,按公式計(jì)算各管蛋白含量。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo)，以試管編號(hào)為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。7．合并、濃縮將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG（MW6000）濃縮至所需體積，加入0.02%NaN3防腐，于4°C保存?zhèn)溆谩ｉL(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)貯于-40°C冰箱。8．A-50凝膠的再生在柱上先以2mol/LNaCl洗脫蛋白至流出液的0D280nm＜0.02,再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過(guò)程將A-50再處理一遍即達(dá)到再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中4C保存；近期不用時(shí)，以無(wú)水酒精洗2次，再置50C溫箱烘干，裝瓶?jī)?nèi)保存。（二）注意事項(xiàng)（1） 柱的選擇：從理論上說(shuō)，只要柱足夠長(zhǎng)，就能獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān)，柱長(zhǎng)增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動(dòng)的不均勻性增加，分辨率明顯下降。（2） 純化過(guò)程必須嚴(yán)格控制緩沖液的pH及離子強(qiáng)度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進(jìn)行柱層析。（3）所裝的柱床必須表面平整，無(wú)溝流及氣泡，否則應(yīng)重裝。（4）洗脫過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速，切勿過(guò)快。（5）上樣的體積要小，濃度不宜過(guò)高。（6）加樣及整個(gè)洗脫過(guò)程中，嚴(yán)防柱面變干。四、 SPA-SepharoseCL-4B親合層析純化IgG及IgG亞類（一）原理葡萄球菌A蛋白（SPA）具有與多種哺乳動(dòng)物IgG分子Fc段結(jié)合的能力，并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。改變pH及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。（二）操作步驟用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝膠，15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠，（用玻璃漏斗過(guò)濾或置燒杯中洗滌）。裝柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液平衡。標(biāo)本可用硫酸銨粗提物，先10000g離心除去雜質(zhì)，必要時(shí)用0.22ym濾膜過(guò)濾，上樣前用1mol/LpH9.0Tris液調(diào)整標(biāo)本液pH至8.1或?qū)ζ胶庖和肝鲞^(guò)夜。加樣，一般按25?30mgIgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液充分淋洗，到淋洗液OD值為＜0.02。用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫，流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH6.0;純IgG2a用PH4.0；純化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸鹽緩沖液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl緩沖液洗脫。I用pH3.0或4.0洗脫液洗脫時(shí)，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液。I收集洗脫液測(cè)OD值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要透析除鹽后進(jìn)行濃度、純度和活性測(cè)定。（三）試劑器材（1） SPA-SepharoseL-4B（pharmacia）（2） 磷酸緩沖液0.1mol/LpH8.0+0.02%NaN3（3） 枸櫞酸緩沖液0.1mol/LpH6.00.1mol/LpH4.0+0.02%NaN30.1mol/LpH3.0（4） 1mol/LpH9.0Tris溶液（5） 再生緩沖液:①0.1mol/LTris含0.5mol/LNaCl調(diào)整pH至8.5+0.02%NaN3:②。.1mol/L醋酸鈉含0.5mol/LNaCl調(diào)整pH至4.5+0.02%NaN3。（四）注意事項(xiàng)（1）SPA-SepharoseCL-4B凝膠價(jià)格昂貴，可再生后反復(fù)使用10?20次左右。方法:先用10倍柱體積0.1mol/LpH8.5Tris含0.5mol/LNaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1mol/LpH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/LNaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；0.1mol/LPH8.0磷酸緩沖液平衡，4°C貯存。（2）SPA-SepharoseCL-4B親合層析法還可用于:①除去抗體液中IgG,檢測(cè)非IgG抗體（如IgM）的生物學(xué)活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或純化免疫復(fù)合物。（3）狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結(jié)合的能力。五、 高效和液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾和親合層析等。應(yīng)用TSKDEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物學(xué)活性。（一）原理根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAbY球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上，通過(guò)增加洗脫液中的離子強(qiáng)度，洗脫并收集蛋白峰。（二）操作步驟腹水離心10000g,10min,除去細(xì)胞和雜質(zhì)，在4°C下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為40%飽和硫酸銨山攪拌20?30min離心，沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對(duì)緩沖液A（pH8.5,20mmol/LTris緩沖液）透析除鹽&4C過(guò)夜用帶有1000山樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的TSKDEAESPW離子交換層析柱I洗脫流速1ml/min0?1min:0T5%緩沖液B（20nmol/LTris,Ph8.5,含2.0mol/L醋酸鈉）1?2min（線性梯度洗脫）：5T20%緩沖液B20?22min：20T0%緩沖液BI洗脫液用紫外280nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)收集蛋白峰，進(jìn)行含量、純度和活性測(cè)定（三） 試劑和器材（1）TSKDEAESPW離子交換層析柱（75mmx7.5mm,BioRad）（2） 高效液相色譜儀（包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280nm監(jiān)測(cè)系統(tǒng)）（3） PBS，緩沖液A和Bo（四） 注意事項(xiàng)（1） 所用緩沖液和加樣粗提物均需0.2|im濾膜過(guò)濾。（2） 在本實(shí)驗(yàn)條件下，lgG1峰一般在線性梯度洗脫開(kāi)始11-12mino但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb的存留時(shí)間（retentiontime）有所差異?！靖戒洝恐苽鋯慰寺】贵w常用的試劑1.RPMT-1640培養(yǎng)液其中含2mmol/L谷氨酰胺，25mmol/LHepes,5x10-5mol/L2-巰基乙醇2.RPMT-1640完全培養(yǎng)液上述溶液加10%?20%滅活小牛血清HT母液x100次黃嘌吟(H)1.0x10-2mol/L136.1mg胸腺嘧淀核苷(T)1.6x1