高通量拉曼成像儀

拉曼散射：是指一定頻率的激光照射到樣品表面時(shí)，物質(zhì)中的分子吸收了部分能量，發(fā)生不同方式和程度的振動（例如：原子的擺動和扭動，化學(xué)鍵的擺動和振動），然后散射出較低頻率的光。頻率的變化決定于散射物質(zhì)的特性，不同原子團(tuán)振動的方式是惟一的，因此可以產(chǎn)生特定頻率的散射光，其光譜就稱為“指紋光譜”，可以照此原理鑒別出組成物質(zhì)的分子的種類。拉曼光譜（Ramanspectra）是一種分子結(jié)構(gòu)檢測手段。拉曼光譜是散射光譜，通過與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動、轉(zhuǎn)動方面信息。以橫坐標(biāo)表示拉曼頻移，縱坐標(biāo)表示拉曼光強(qiáng)，與紅外光譜互補(bǔ)，可用來分析分子間鍵能的相關(guān)信息。拉曼光譜儀的工作原理：當(dāng)一束頻率為v0的單色光照射到樣品上后，分子可以使入射光發(fā)生散射。大部分光只是改變光的傳播方向，從而發(fā)生散射，而穿過分子的透射光的頻率，仍與入射光的頻率相同，這時(shí)，稱這種散射稱為瑞利散射；還有一種散射光，它約占總散射光強(qiáng)度的10八-6?10E0,該散射光不僅傳播方向發(fā)生了改變，而且該散射光的頻率也發(fā)生了改變，從而不同于激發(fā)光（入射光）的頻率，因此稱該散射光為拉曼散射。在拉曼散射中，散射光頻率相對入射光頻率減少的，稱之為斯托克斯散射，因此相反的情況，頻率增加的散射，稱為反斯托克斯散射，斯托克斯散射通常要比反斯托克斯散射強(qiáng)得多，拉曼光譜儀通常大多測定的是斯托克斯散射，也統(tǒng)稱為拉曼散射。散射光與入射光之間的頻率差v稱為拉曼位移，拉曼位移與入射光頻率無關(guān)，它只與散射分子本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。拉曼散射是由于分子極化率的改變而產(chǎn)生的（電子云發(fā)生變化）。拉曼位移取決于分子振動能級的變化，不同化學(xué)鍵或基團(tuán)有特征的分子振動，AE反映了指定能級的變化，因此與之對應(yīng)的拉曼位移也是特征的。這是拉曼光譜可以作為分子結(jié)構(gòu)定性分析的依據(jù)。一、拉曼光譜原理拉曼效應(yīng)：起源于分子振動（和點(diǎn)陣振動）與轉(zhuǎn)動，因此從拉曼光譜中可以得到分子振動能級（點(diǎn)陣振動能級）與轉(zhuǎn)動能級結(jié)構(gòu)的知識。拉曼效應(yīng)是光子與光學(xué)支聲子相互作用的結(jié)果。光照射到物質(zhì)上發(fā)生彈性散射和非彈性散射。彈性碰撞：光子和分子之間沒有能量交換，僅改變了光子的運(yùn)動方向，其散射頻率等于入射頻率，這種類型的散射在光譜上稱為瑞利散射。非彈性碰撞：光子和分子之間在碰撞時(shí)發(fā)生了能量交換，即改變了光子的運(yùn)動方向，也改變了能量。使散射頻率和入射頻率有所不同。此類散射在光譜上被稱為拉曼散射。'Laser *圖1：拉曼散射示意圖物質(zhì)與光的相對作用分為三種：反射，散射和透射。根據(jù)這三種情況，衍生出相對應(yīng)的光譜檢測方法：發(fā)射光譜（原子發(fā)射光譜（AES）、原子熒光光譜（AFS）、X射線熒光光譜法（XFS）、分子熒光光譜法（MFS）等），吸收光譜（紫外一可見光法UV-Vis）、原子吸收光譜（AAS）、紅外觀光譜（IR）、核磁共振（NMR）等），聯(lián)合散射光譜（拉曼散射光譜（Raman））。拉曼光譜應(yīng)運(yùn)而生。

表1:光譜種類區(qū)分表光點(diǎn)半甲業(yè)成用sir酒:AES),JH子豆心治AFS),區(qū)師宜洗土話疽*3). fMFS]物吸枚光諂素A-用!0刑點(diǎn)(內(nèi)&|,暇手暇曜南(MS；.叮期0：充譜(IR),垂]心節(jié).朽罪譜1Hanun)拉曼頻移(Ramanshift):拉曼光譜的橫坐標(biāo)稱作拉曼頻移。拉曼散射分為斯托克斯散射和反斯托克斯散射，通常的拉曼實(shí)驗(yàn)檢測到的是斯托克斯散射，拉曼散射光和瑞利光的頻率之差值稱拉曼頻移(Ramanshift):Av=|v0-vs|,即散射光頻率與激發(fā)光頻之差。Av取決于分子振動能級的改變，所以他是特征的，并且拉曼光譜與入射光波長無關(guān)，適應(yīng)于分子結(jié)構(gòu)的分析。三、拉曼測試InlensityerfRamanpwiknifitfi迎characleris^c：RamAhInlensityerfRamanpwiknifitfi迎characleris^c：RamAh檢mgq“n叩ofRama^peal柚尊峰忙由委隊(duì)即沽血眥inn&RamanGt街JS的taasryitgJsjfnmetryendcificntaliarii晶悻專寐性利隼向egSItQwn"ihkllprar，或rainegorientali^nofCVDd-amondgrainse.g響河ntoFpl弗M如口叩alien昭thinnessMtransparentCQalliig圖2：拉曼光譜的檢測內(nèi)容拉曼光譜與紅外光譜的比較：拉曼光譜與紅外光譜都能獲得關(guān)于分子內(nèi)部各種簡正振動頻率及有關(guān)振動能級的情況，從而可以用來鑒定分子中存在的官能團(tuán)。但兩者產(chǎn)生的原理和機(jī)制都不同，在分子結(jié)構(gòu)分析中，拉曼光譜與紅外光譜相互補(bǔ)充，一些在紅外光譜無法檢測的信息在拉曼光譜能很好地表現(xiàn)出來。紅外光譜側(cè)重于檢測基團(tuán)，適用于極性鍵，多用于測有機(jī)物，拉曼光譜檢測分子骨架，適用于非極性鍵，有機(jī)無機(jī)均可測試。表2：拉曼光譜與紅外光譜對比表尤吊泠4000tmL31JOO??4000c*r1水可作為酬水；F翊樣為離到不畦葉心暑路用定J!]P述林句直磐曹匏W肆F墅制瘴X&r壓，1催與手刷戲不時(shí)嶄孑的10理爆虢的OH.C■0,CX金闈于研克IW孑6TI"母怔謎5N,?C S樣品要求：拉曼光譜測試對象與紅外光譜類似，多用于檢測有機(jī)官能團(tuán)和鍵能之間的信息(對金屬類檢測意義不大，但也有部分文獻(xiàn)提到以拉曼光譜檢測反應(yīng)產(chǎn)物)。信號強(qiáng)一些的固體樣品可直接測定，樣品制備時(shí)稍微壓一下即可。拉曼信號比較弱的材料就需要做增強(qiáng)處理。測試液體的話,就要注意容器的材料，最好是避免產(chǎn)生熒光。四、疑難解答如何用拉曼光譜儀測透明的有機(jī)物液體，測試時(shí)放到玻璃片上測出來的結(jié)果是玻璃的光譜。答：聚焦位置不對，聚在玻璃上了，用凹面載玻片，液體量會比較多，然后用顯微鏡聚焦好就可以了，如果液體有揮發(fā)性，最好液體上用蓋玻片，然后焦點(diǎn)聚焦到蓋玻片以下。做生物樣品的拉曼光譜，獲得的圖里面有很強(qiáng)的熒光，有人說，如果拉曼得不到就用其熒光譜。那么在拉曼譜里面得到的熒光背景，是真正的熒光特征譜嗎?這和熒光光譜儀里面的熒光圖有什么區(qū)別？答：拉曼譜中的熒光和熒光譜中的熒光是一樣的，只要激發(fā)波長和功率密度相同。但有一點(diǎn)要注意，不同波長的激發(fā)光照射樣品，得到的拉曼相近，但熒光可以有很大不同，甚至相同波長不同功率激發(fā)，熒光譜都大不一樣