天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)全文

/天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)天然藥物化學(xué)試驗(yàn)的特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期長,所用溶劑和試劑品種多,而且用量較大。許多有機(jī)溶劑具有易燃、有毒、腐蝕性，刺激性和爆炸性等特點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)操作過程中又經(jīng)常需要加熱或減壓等操作,學(xué)生將接觸各種熱源和電器。如果操作不慎，易引起中毒、觸電、燒傷、燙傷、火災(zāi)、爆炸等事故。所以要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)操作者,必須加強(qiáng)愛護(hù)國家財(cái)產(chǎn)和保障人民生命安全的責(zé)任心，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，樹立嚴(yán)密的科學(xué)實(shí)驗(yàn)態(tài)度,提高警惕，消除隱患,預(yù)防事故的發(fā)生。為了確保實(shí)驗(yàn)的安全進(jìn)行，特作如下要求:一、實(shí)驗(yàn)前要必須充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,明確實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟及注意事項(xiàng).實(shí)驗(yàn)開始前應(yīng)檢查儀器是否完整無損,裝置是否正確，經(jīng)檢查合格后方可開始實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)時(shí)要保持室內(nèi)整齊、清潔、安靜.不準(zhǔn)做與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的事情，不得擅自離開崗位。在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)密切觀察實(shí)驗(yàn)進(jìn)程是否正常，儀器又無漏氣,破裂等現(xiàn)象。三、倒取和存放易燃性有機(jī)溶劑時(shí)，要遠(yuǎn)離火源。不得隨意將易燃性、易爆性的有機(jī)溶劑及藥品倒入水槽或污水缸內(nèi)。不得在烤箱內(nèi)烘烤留有易燃性有機(jī)溶劑的儀器或物品。四、使用精密儀器及電氣設(shè)備時(shí)，應(yīng)先了解其原理及操作規(guī)程，檢查好電路,按操作規(guī)程進(jìn)行.遇到不明了的問題應(yīng)及時(shí)向老師請教,切忌自作主張,亂倒以儀器。電線及儀器不應(yīng)放在潮濕處,不要用濕手接觸電器。電器用完后,應(yīng)立即清理，關(guān)好電源。五、回流或蒸餾易燃性有機(jī)溶劑時(shí)，應(yīng)檢查冷凝水是否暢通，儀器裝置是否漏氣.不得用明火直接加熱,應(yīng)根據(jù)其沸點(diǎn)選用水浴、油浴或砂浴.蒸餾溶劑時(shí)要加入沸石，否則將發(fā)生爆沸.添加溶劑時(shí)要移開水浴，待溶劑冷卻后再加,并應(yīng)重新加沸石。六、實(shí)驗(yàn)室中常用的苯、鹵代苯、苯酚、苯胺、甲醇、二硫化碳、氰化物、汞和鉛鹽等化合物均為有毒或劇毒藥品。人體中毒的途徑一般為消化道、呼吸道或皮膚吸收。所以取用毒劇藥時(shí)要注意切勿灑在容器外，不要接觸皮膚或口腔.室內(nèi)要通風(fēng)良好，產(chǎn)生毒氣的操作應(yīng)在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。毒物及廢液不得隨意亂倒。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁進(jìn)食。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)將水、電、門窗關(guān)妥后，方能離開實(shí)驗(yàn)室.八、實(shí)驗(yàn)時(shí)一旦不慎起火，應(yīng)沉著冷靜,積極滅火。首先立即切斷實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有電源及火源，搬走易燃易爆物品,同時(shí)針對起火點(diǎn)情況,選用適當(dāng)滅火器材進(jìn)行滅火.九、急救常識。(一）外傷：及時(shí)取出傷口中的碎玻璃屑或固體物質(zhì)，用蒸餾水沖洗后涂上紅藥水,用消毒紗布包扎。大傷口則先按緊主血管,急送醫(yī)院治療。（二)火傷：輕傷可在傷面涂以硼酸凡士林。重傷則須請醫(yī)生診治.（三）試劑灼傷:1．酸灼傷:立即用大量水沖洗,然后用3%碳酸氫鈉溶液蘸洗。2。堿灼傷:立即用大量水沖洗,然后用１％醋酸溶液蘸洗。

實(shí)驗(yàn)一薄層板的制備、活度測定及薄層層析、紙層析的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的目的要求：掌握ＴLC、PＣ的原理。掌握薄層層析板的制備及薄層層析、紙層析操作的基本方法。了解展開劑、吸附劑的選擇以及與被分離物質(zhì)的關(guān)系。應(yīng)用薄層層析法、紙層析法檢識中藥草中的化學(xué)成分。層析分類與應(yīng)用概述中草藥的研究、鑒定工作中，對探討中草藥中含有哪些化學(xué)成分，如何將中草藥中的有效成分提取、分離、精制，并鑒定結(jié)晶純度等等.除常用的經(jīng)典方法外,仍因中草藥中化學(xué)成分復(fù)雜，許多成分結(jié)構(gòu)類似，有效成分含量極少，僅僅采用經(jīng)典方法往往難以達(dá)到分離的目的,所以必須配合各種近代的分離方法，其中常用分離效率高、操作較簡便的層析分離法(Chroｍatｏgｒａｐhｙ）。由于有效成分的類型不同、性質(zhì)不同，因此選擇層析法的種類也不同.可參閱教科書第二章第二節(jié)層析法的內(nèi)容.本實(shí)驗(yàn)著重介紹薄層層析法（Thiｎ－LayerＣhromａt(yī)ｏgrap-hｙ，TＬC）以及紙層析法(PａｐerChｒoｍaｔogｒap、ＰC）的應(yīng)用.這些方法主要用于選擇粗提取物的分離條件;化合物純度的鑒定；制備一定量的某些化合物；或在薄層選用不同配比的混合溶劑。吸附層析主要考慮的是展開劑的極性；但被分離物質(zhì)在展開劑中的溶解度也要影響到它的層析行為.在一種吸附上用多種展開劑試驗(yàn)后如果分離不成功，可改用另一種吸附劑來試驗(yàn)。分離的化合物在板上的比移值(Rｆ）在0.2-0.8之間為好。二組分之間Rf差值＞0．0５，以免斑點(diǎn)重疊。（展開劑選用舉例見教科書第19頁表2－8)。在吸附層析中，吸附劑的活度,展開劑的極性，被分離物質(zhì)的極性，是層析條件三要素,這三者的關(guān)系是相互聯(lián)系的，見圖。當(dāng)A指向中極性物質(zhì)時(shí),則B就指向選用中等活度的吸附劑，Ｃ就指向選用中等極性的展開劑。如分別轉(zhuǎn)到A'Ｂ'C＇的位置，則又是另一種情況。分配薄層層析—有些強(qiáng)極性化合物，能被吸附劑強(qiáng)烈吸附,用洗脫能力很強(qiáng)的溶劑仍很難推動(dòng)。這時(shí)就必須選用分配層析。它是利用被分離物質(zhì)在兩相中（如水和非極性有機(jī)溶劑中）分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的目的.分配薄層層析常用的擔(dān)體有硅膠、硅藻土、纖維素等。選擇展開劑的根據(jù)是被分離的物質(zhì)在展開劑（固定相、流動(dòng)相）中的溶解度相差最大的溶劑組成不同的比例，為首用試劑。化合物在流動(dòng)相中的溶解度愈大，則它在分配層上移動(dòng)得愈遠(yuǎn)，比移值就愈大。流動(dòng)相應(yīng)先用固定相飽和，固定相種類有水、不同PH的緩沖溶液、親水有機(jī)相(甲酰胺、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等)。流動(dòng)相為含固定相(常用如水）的有機(jī)溶劑，有時(shí)為了防止弱酸、弱堿的解離,加入少量的酸和堿.薄層層析展開后的斑點(diǎn)檢出，通常先在可見光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置，然后在紫外光分析燈下觀察有無吸收或熒光斑點(diǎn),并記錄其顏色、位置及強(qiáng)弱，最后利用各化合物的特性反應(yīng)，用噴霧器均勻地噴灑適當(dāng)?shù)娘@色劑，使層析譜顯色。各類化合物所用的顯色劑見附錄4。絡(luò)合薄層層析-在絡(luò)合劑處理的吸附劑上進(jìn)行吸附薄層層析行為時(shí),不飽和化合物（絡(luò)合物的供體）與絡(luò)合劑（金屬離子既絡(luò)合物的受體）形成π絡(luò)合物。 在層析時(shí)可按照被分離的化合物不飽和度的位置、幾何異構(gòu)等情況，所形成絡(luò)合物的絡(luò)合強(qiáng)度不一，導(dǎo)致比值不同達(dá)到相互分離的目的.飽和脂肪酸不與受體絡(luò)合,推向薄層的最前沿;含雙鍵的比含三鍵的吸附牢；末端雙鍵或環(huán)外雙鍵比不是這種類型的吸附牢.由于硝酸銀的存在影響一些顯色劑的靈敏度,如碘蒸氣很少用于該法的顯色.有關(guān)絡(luò)合層析各類化合物的溶劑系統(tǒng)及顯色劑見附錄４.一般操作技術(shù)（一）薄層層析薄層板的制備1.不加粘合劑的薄層板涂布法氧化鋁薄層將吸附劑置于薄層涂布器中，調(diào)節(jié)涂布器的高度，向前推動(dòng),即得均勻薄層。本實(shí)驗(yàn)主要用下述簡易操作涂布薄層,取表面光滑，直徑均一的玻璃棒一支，依據(jù)所制備薄層的寬度、厚度要求,在玻璃棒套上厚度為0。3-1mｍ的塑料圈或金屬環(huán)，以使玻璃棒向前推動(dòng)時(shí)能保持平行方向,操作時(shí)，將氧化鋁粉均勻地鋪在玻璃板上，按下圖所示方式推動(dòng)。22413(2）纖維素薄層，一般取纖維素粉1份加水約5份，在研缸中混合均勻后,倒在玻璃板上,輕輕振動(dòng)，使涂布均勻，水平放置,待水分蒸發(fā)至近干，于１00２℃干燥30-60分鐘即得。(3）聚酰胺薄層,取錦綸絲（無色干凈廢絲即可）用乙醇加熱浸泡2-３次,除去蠟質(zhì)等。稱取洗凈得錦綸絲1g，加85%甲酸5ml,在水浴上加熱使溶,再加７0%乙醇6ml，繼續(xù)加熱使完全溶解成透明膠狀溶液.將此溶液適量倒在水平放置的、用清潔液洗凈的玻璃片上，并自然向周圍攤勻,厚度約為0.3mm,薄層太厚時(shí),干后會(huì)裂開.將鋪好的薄層水平放在盛溫水的盤上，使盤中的水蒸氣能熏濕薄層,盤子加玻璃板蓋嚴(yán)密。薄層放置1小時(shí)完全固化變不透明白色,再放數(shù)小時(shí)后，再泡在流水中洗去甲酸，先在空氣中晾干，后在烘箱中80℃恒溫加熱活化15２。加粘合劑薄層的涂布法（１）硅膠G薄層,取硅膠G或硅膠GF1份，置研缽中加水約5份,研磨均勻，放置片刻，隨即用藥匙取一定量，分別倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中，推動(dòng)涂布）均勻涂布成0。２5－0.5ｍm厚度，輕輕震動(dòng)下玻璃板,使薄層面平整均勻，在水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中110℃烘干活化1-2（2)硅膠（Ｈ）羧甲基纖維素（CＭC—Na）薄層，取羧甲基纖維素０。2g,溶于２5mｌ水中，在水浴上加熱攪拌，使完全溶解，倒入研缽中加硅膠細(xì)粉(一般硅膠細(xì)粉過300目篩的，約6-８g,過２００目篩的，約需１0-20g，）研磨成稀糊,照硅膠G薄層涂布法制備薄層。或?。矇K2。5mm厚度的玻璃長板，中間夾一至幾塊2．2mm厚的薄層用玻璃片，將適量硅膠糊倒在中間,用藥匙適當(dāng)涂勻，另取一塊邊緣較平整的玻璃片將硅膠糊刮平，推出薄層板，水平放置，自然晾干后再活化貯存。氧化鋁G薄層、氧化鋁羧甲基纖維素鈉薄層的制備方法同上，一般所需氧化鋁量比硅膠稍多。硅膠燒結(jié)薄層采用硅膠細(xì)粉混合一定量的玻璃細(xì)粉,涂布在玻璃板上，在高溫下將薄層燒結(jié)在玻璃板上，一般薄層厚度0．25mm,薄層用后經(jīng)過處理，可以多次重復(fù)使用.3．特制薄層的制備根據(jù)分離工作的特殊需要,可制成以下幾種特制薄層。（1)酸、堿薄層和PH緩沖薄層為了改變吸附劑的酸堿性，以改進(jìn)分離效果,可在吸附劑中加入稀酸溶液（如0．1N-0．2N草酸溶液）代替水制成酸性氧化鋁薄層使用.硅膠微呈酸性，可在鋪層時(shí)用稀堿溶液（如0.１N—0.5N氫氧化鈉溶液）代替水制成堿性的硅膠薄層.當(dāng)用乙酸鈉,磷酸鹽等不同PH的緩沖薄層。（２)絡(luò)合薄層硝酸銀薄層的制法，可在吸附劑中加入5—25％硝酸銀水溶液代替水制成均勻糊狀,在按常法鋪成薄層。制成薄層避光陰干,于10５℃也可先把硝酸銀用少量水溶解，再用甲醇稀釋成10%溶液。把預(yù)先制好的硅膠Ｇ薄層浸入此溶液中約1分鐘，取出避光陰干按上法活化、貯存。（二）點(diǎn)樣將樣品溶液滴到已制備好的薄層上，點(diǎn)的直徑不大于2－3mm,樣品滴加在距離薄層一端1－1．5cm的起始線上,點(diǎn)與點(diǎn)之間距離0．5—１cｍ，展開劑用量以浸沒薄層起始線這邊約為0.5cｍ的高度的量。一般定性時(shí)可用普通毛細(xì)管，定量可用微量注射器（1、10、５0μl）。樣品溶液應(yīng)盡量選用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑,以便點(diǎn)樣后溶劑迅速揮發(fā)，以減少空氣中水分對吸附劑活度的影響。如果樣品為水溶液或不易揮發(fā)的溶劑,此時(shí)可用電吹風(fēng)或紅外燈加熱，要注意遇熱不要破壞化合物。點(diǎn)樣量一般為幾到幾十微克。斑點(diǎn)要集中,所以點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)點(diǎn)在原點(diǎn)上，直徑要小。（三）展開劑選擇的方法前面已提到選擇展開劑的原則。在實(shí)際工作中大都還要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)而確定合適的展開劑。微量圓球技術(shù)(見柱層析)可對吸附薄層的展開劑進(jìn)行初選。好的展開劑應(yīng)要求是能把混合物的成分很好的分離。展開劑的質(zhì)量對于展開結(jié)果的影響較大.溶劑要用三級（CＰ)或二級(ＡR）純規(guī)則的溶劑?；?qū)⒐I(yè)級的溶劑精制后應(yīng)用。薄層的展開必須在一個(gè)密閉的層析缸中進(jìn)行。層析缸內(nèi)預(yù)先用展開劑蒸氣飽和,飽和后才能進(jìn)行展開.實(shí)際應(yīng)用小層析缸時(shí)由于空間較小很快達(dá)到了飽和，同時(shí)展開時(shí)間短,對分離效果影響較小.邊緣效應(yīng)不明顯.常用溶劑性質(zhì)表(附錄３）、共沸混合溶劑表(附錄5)。供選擇展開劑時(shí)參考.展開方式最常用的是上行法,它比下行法分離效果好,因展開劑移得較慢,除了單向展開外，由于單向展開第一次展開后幾種成分分離得不太開，經(jīng)過第二次轉(zhuǎn)向展開后,就有可能分得更開些。對成分復(fù)雜和化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的混合物，常用這種雙向展開法來分離.展開時(shí)一般在室溫進(jìn)行。當(dāng)被分離物質(zhì)見光易分解,則應(yīng)用黑布（紙)罩上避光展開。展開完畢后，取出薄層板，用鉛筆或小針劃出展開劑的前沿位置，待展開劑揮散后進(jìn)行斑點(diǎn)檢出。※羧甲基纖維素鈉的溶液一般用０。5－1％濃度，宜預(yù)先配制后靜置，取其上層澄清溶液應(yīng)用，則所制備的薄層表面較為細(xì)膩平滑。鑒定未知成分時(shí)是用已知的標(biāo)準(zhǔn)品對照,書本上常見的Rf值都是多次實(shí)驗(yàn)的平均值,只有在基本相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行層析,才能得到相近的Rf值。書本上的Rf值可以作為一系列化合物在薄層上的相應(yīng)位置以及它們之間分離的難易程度的參考.（四)氧化鋁、硅膠活度的測定1．氧化鋁活度的測定：一般可用4-５種偶氮染料以薄層層析法進(jìn)行測定.（1)染料試劑的配制取偶氮苯（Azobenzene)6０mg,對甲氧基偶氮苯（Pnethoｘyａzｏbenzene），蘇丹黃(SｕｔｄanIBeneｎe—ａｚo－β—naphｔhoｌ）,蘇丹紅（SuｄanⅢTｅｔrazｏ—beｎzｏｌ-β-ｎaphtheｌ），對氨基偶氮苯（P—Amｉnc-azcbeｎｚｅne)各40ｍｇ,分別溶于１00ml重蒸的四氯化碳中。實(shí)驗(yàn)方法常用制備氧化鋁薄層，以鉛筆尖或毛細(xì)管尖在薄層板一端2—3cm處間隔１cｍ左右點(diǎn)上5個(gè)可以看清的小點(diǎn)，各吸取約0.02ｍl染料試劑分別點(diǎn)滴于原點(diǎn)上，以四氯化碳為展開劑,展開時(shí)薄層板與容器底部交角為10－40°研究空間。展開后測出各斑點(diǎn)的Ｒｆ值，從表Ⅰ確定氧化鋁活度（一般高活度氧化鋁使用本法時(shí)，結(jié)果往往偏低）。另取氧化鋁薄層板一塊,置于水蒸氣飽和的容器２、3小時(shí)后取出，按下述方法測定活度，觀察有無變化.表1氧化鋁活度與偶氮染料Rf值關(guān)系偶氮染料氧化鋁活度純Rｆ值Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級Ⅴ級偶氮苯0.５９0.7４0.8５0。９5對甲氨基偶氮苯０。160。490。６90.89蘇丹黃0．010．２50．５70。78蘇丹紅0.000．100.53０．5０對氨基偶氮苯0。０００。０３0。080.１92.硅膠活度的測定一般選用三種染料，用薄層層析法進(jìn)行測定.歐洲藥典19６9年記載用0.01%二甲基黃（Meｔhyl－yelｌow,Ｐ－Ｄimetｈylamｉｎoａzobｅnzene）,蘇丹紅(SudanⅢ），靛酚蘭（Indophenｏｌｂlｕe,1,4-Ｎaｐｈoqｕｉnonｅ—4－Naｐｈｔhｏq-unione－4-dｉｍethｙlaｍｉnｅaniｌｉnｅ）的苯溶液各10μｌ，點(diǎn)滴于硅膠G或硅膠H薄層上，以苯為展開劑，展開1０cｍ(約2０分鐘）,三種染料應(yīng)明顯分離。靛酚蘭斑點(diǎn)接近于起始線，二甲基黃斑點(diǎn)在薄層的當(dāng)中,蘇丹紅斑點(diǎn)在靛酚蘭斑點(diǎn)與二甲基黃斑點(diǎn)之間，則認(rèn)為薄層板活性符合要求。3。毛細(xì)管測定氧化鋁、硅膠活度的測定法取1.0×７５mm的毛細(xì)管，將毛細(xì)管的一端封閉,另一端開口，另取一個(gè)滴帽在底部打個(gè)小洞，將毛細(xì)管開口端穿入滴帽內(nèi)部,然后將滴帽內(nèi)充滿吸附劑，輕輕拍打滴帽，使毛細(xì)管很快充滿吸附劑（或似裝測熔點(diǎn)法加入吸附劑），滴一滴苯在毛細(xì)管開口端（目的防止吸附劑從毛細(xì)管中掉出來），將毛細(xì)管倒轉(zhuǎn)，并切掉封尾端，濕端以0．５％適當(dāng)染料的苯溶液中沾一下，直至一滴染料溶液被吸附，然后將毛細(xì)管放入含有幾毫升的苯溶液中，展開計(jì)算Rf值，從表中查出活性級別。染料對氨基偶氮苯(Ｐ—Amiｎc—aｚcbenzｅne）用于氧化鋁對二氨甲基偶氮苯(Ｐ－diｍethyl—aminｃ—azcbenzene）用于硅酸。氧化鋁含水量(％)Ｒｆ值級別硅膠含水量(％）Ｒf值級別0３６８１0０0.１20.240。460.54ⅠⅡⅢⅣⅤ０３691215０.150.220.330.440。５50．66ⅠⅡⅢ國內(nèi)青島海洋化工廠出售層析用的硅膠在吸附劑名稱之后加幾個(gè)字標(biāo)明的意思是：硅膠G(G是Gypsu石膏的縮寫，表示加了石膏)、硅膠Ｈ(H表示不加石膏)、硅膠GF（GＦ表示加石膏和波長為25４nm顯綠色熒光的硅膠鋅錳)、硅膠GＦ（ＧF表示加石膏和波長為365nm顯黃色熒光的硫化鋅）。氧化鋁則類推.薄層層析應(yīng)用實(shí)例(一）定性點(diǎn)滴反應(yīng)1。樣品(1)氨基酸混合液(2）薄荷油(3）苦參乙醇液(4)蘆丁甲醇溶液甘草次酸乙醇液大黃乙醇液2。檢出試劑（1）三氯化鐵(2）氨性硝酸鹽（3)氫氧化鉀(４）茚三酮（５）碘化鉍鉀(７）香草醛—硫酸（應(yīng)在薄層板或白磁板穴內(nèi)進(jìn)行）3.實(shí)驗(yàn)方法取硅膠CMC－Nａ薄層板1－2塊或?yàn)V紙片一方條，用軟鉛筆按下圖劃線，將各樣品滴加于相應(yīng)的格子中,再將各試劑分別自空白起逐格滴加試劑，觀察并記錄反應(yīng)變化。具腐蝕性試劑也可用帶穴白磁板，有的檢出在試管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 試劑樣品（1)(２）(３)（４）（5)（6)（7）（1）（2)(３）(4）（二)鑒別中草藥中的化學(xué)成分單向展層例一（1）硅膠CMC－Na薄層（載玻片板)（2）樣品薄荷油薄荷腦的乙醇溶液（３）展開劑①石油醚②乙酸乙酯③石油醚—乙酸乙酯（85：１5）(４）顯色劑香草醛—硫酸※（壓板法)點(diǎn)樣展開后，稍干,反扣在一塊同樣大小并已涂布一層顯色劑的玻璃板上，稍稍轉(zhuǎn)一下,連玻璃片反轉(zhuǎn),使薄層面向上，觀察顏色變化。由結(jié)果判斷何種展開劑最適合分離薄荷油。例二(1）硅膠CＭC—Na薄層（載玻片板）（2)樣品龍膽提取物（3）展開劑①石油醚②氯仿③甲醇④氯仿—丙酮(8:2）⑤氯仿—乙酸乙酯-甲醇—水(35:5：1０：0。5）（4)顯色UV2５4下觀察由展開結(jié)果判斷選用何種展開劑最為合適。香草醛—硫酸※為1g香草醛溶于100ml濃硫酸，或0.5ｇ香草醛溶于100ｍl硫酸—乙醇（４：1）中,噴灑時(shí)須加熱至120℃雙向展層ⅠⅠⅡ(１）硅膠ＣMC-Ｎａ薄層板（８×8cm）,不活化,在薄層板距兩邊各1.5ｃｍ交點(diǎn)的地方點(diǎn)樣品。（2）樣品混合氨基酸（精氨酸、脯氨酸、亮氨酸的1％水溶液）。（3）展開劑第Ⅰ向?yàn)檎〈肌姿?水(４：1：1）（V/Ｖ）第Ⅱ向?yàn)楸椒印?5:25)(W／W）第Ⅰ向展開劑展層后，加熱風(fēng)使溶劑揮發(fā),再將樣品已展層的一向作起始線,在第Ⅱ向溶劑系統(tǒng)中展層。（4）顯色劑０。2％茚三酮乙醇液,噴灑后,以電吹風(fēng)加熱(６０℃—100℃3．硝酸銀—硅膠薄層（1)硝酸銀硅膠糊的制備:用20ｇ硅膠G和55ml水中含5g硝酸銀(８%）的溶液調(diào)制成，按常法鋪成板（4×7cm、約3０塊）。避光陰干后,于105℃（2)樣品轉(zhuǎn)化后的α—細(xì)辛醚粗品（３）展開劑環(huán)己烷-醋酸乙酯(1：1或7:3）（4)顯色點(diǎn)將薄層板展層后置紅外燈下加熱使其出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)檢出。（三）原位反應(yīng)薄層本法使直接在薄層上進(jìn)行有機(jī)反應(yīng)。先將樣品滴加在薄層板上，然后再滴上試劑進(jìn)行反應(yīng)，再用適當(dāng)?shù)娜軇┱归_反應(yīng)物.有時(shí)先在試管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。而后在薄層板上進(jìn)行層析檢識.根據(jù)原來化合物的Rf值、再聯(lián)系反應(yīng)產(chǎn)物的層析行為、Rf值,可供鑒別一個(gè)化合物或者提供鑒定一個(gè)化合物極有價(jià)值的線索.應(yīng)用這些特殊反應(yīng)只消耗未知物極微量的樣品卻提供了大量的有關(guān)結(jié)構(gòu)鑒別的情報(bào)，操作簡單.如氧化、還原、脫水、水解、鹵代、酶的催化作用、酯化、硝化、衍生物的制備、混合反應(yīng)等均可在薄層板上進(jìn)行。1。酯化反應(yīng)(1）取原兒茶酸乙醇溶液，在薄層上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn),其中一份點(diǎn)在原點(diǎn)上，再點(diǎn)加試劑:醋酐—吡啶（3：1），待溶劑揮散，再重復(fù)點(diǎn)加試劑幾次,干后，以氯仿—丙酮(8：2）展層，(用碘蒸氣熏顯色,可見其中點(diǎn)加醋酐吡啶試劑的樣點(diǎn)已展開在前,而未加試劑的樣點(diǎn)仍近起始線）。(2)取原兒茶酸乙醇溶液，在同一薄層上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn)，其中一份樣點(diǎn)在原點(diǎn)上，再點(diǎn)加醋酐—吡啶(3：1），待試劑揮發(fā)后,再重復(fù)點(diǎn)加試劑數(shù)次，用氯仿—丙酮（8:2）展層。用２，4—二硝基苯肼顯色。2。成鹽反應(yīng)取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層板上的起始線上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn)，其中一份樣點(diǎn)在原點(diǎn)上，再點(diǎn)加1０%碳酸氫鈉溶液（另一份不加)，以氯仿—丙酮—甲醇（8:2：1）展層,并用三氯化鐵乙醇溶液噴霧顯色，可見其中點(diǎn)加碳酸氫鈉的樣點(diǎn)的Rf值已有明顯變化，未加堿的樣點(diǎn)照常展開。苯腙反應(yīng)取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層上點(diǎn)加兩個(gè)相同樣點(diǎn)，其中一份樣點(diǎn)在原點(diǎn)上，再點(diǎn)加2，4-二硝基苯肼試劑,給以熱風(fēng)以促進(jìn)成腙反應(yīng)，然后以氯仿—丙酮（8：２)展層，可見出現(xiàn)兩個(gè)棕紅色斑點(diǎn)。在紅棕色斑點(diǎn)下，再噴以三氯化鐵試劑,又出現(xiàn)紫藍(lán)色斑點(diǎn).上面的紅色斑點(diǎn)是原兒茶醛與2,4—二硝基苯肼所形成的,下面的紫藍(lán)色斑點(diǎn)是剩下的部分未成腙的原兒茶醛。由原位反應(yīng)的結(jié)果判斷原來化合物的結(jié)構(gòu)上有何基團(tuán)特征？并繪出圖譜。紙層析原理、一般操作及運(yùn)用紙層析是以濾紙為支持劑,樣品點(diǎn)樣后在固定相與流動(dòng)相通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開。被分離物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的層析方法。展開劑選擇與分配薄層層析類似。被分離物質(zhì)在展開劑系統(tǒng)中Ｒf值在0.０5—0。85之間，兩個(gè)化合物之間Rf值之差最好大于0.05。單個(gè)化合物的Rf值最好在0．4—0.６之間.一般操作按展開劑展開劑展開方向可分為上行、下行、徑向。上行法又分為單向、雙向。點(diǎn)樣用的毛細(xì)管應(yīng)細(xì)些使點(diǎn)樣斑點(diǎn)呈小圓形，直徑在2-3ｍm.點(diǎn)樣濃度、數(shù)量不宜過大，防止斑點(diǎn)拉長、Ｒｆ值偏低?？捎脴?biāo)本缸展開,必須使缸內(nèi)為展開劑飽和后再將濾紙放入（展開劑用量以浸沒濾紙起始線一邊約為1ｃm高度的量）展開.展開完畢，取出，溶劑前沿用鉛筆劃線作記號,濾紙陰干后斑點(diǎn)檢測，除了不可用腐蝕性顯色劑外其余同薄層層析。應(yīng)用在中草藥化學(xué)成分的定性點(diǎn)滴反應(yīng)同薄層層析（腐蝕性酸不可在濾紙上檢出)苯胺—鄰苯二甲酸試液為苯胺0．93g和鄰苯二甲酸1.６6g溶于100ml正丁醇（用水飽和）中。鑒別中草藥中化學(xué)成分5%NaOH5％NaCＯ3／5%NaOＨPH９PH8ＰＨ５1。5cm2。0ｃm第一混合單糖的PC層析濾紙按纖維長絲方向（縱向）切成適當(dāng)大小的紙條，在一端2cm處用鉛筆劃一條線為起始線,在起始線上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑小于０.３cｍ，點(diǎn)之間間距1-1.５cm。（２)樣品：2。5%葡萄糖,鼠李糖混合水溶液。(３）展開劑:正丁醇-醋酸—水（4:１:1或４：1:5上層)。（4）顯色劑：鄰苯二甲酸—苯胺試劑，噴霧后于１0５℃,加熱10第二多緩沖液和堿液紙層析(１）緩沖濾紙的制備：取新華濾紙（３×１2cm)一張,距下端2cm處劃一起始線，向上每隔1。5cｍ劃一平行線按右圖在各條帶上涂布PH緩沖液和堿液，然后將其夾在兩片濾紙中吸至半干使?jié)駶欀笖?shù)為１。5（指濕濾紙為干濾紙重的1。5倍）備用。（2)樣品:大黃素，大黃素甲醚,蘆薈大黃素,大黃酸的氯仿溶液》（3）展開劑:氯仿（4）顯色劑:熒光檢出;氨熏（5）結(jié)果：記錄圖譜，并說明這些化合物酸度的強(qiáng)弱。涂緩沖溶液時(shí),PＨ順序相反會(huì)怎樣？［附]PH緩沖溶液的配制：PH3：取0.2M磷酸氫二鈉溶液4.１ｍl加0.1M檸檬酸1５.89mｌ配成.PH５:取０。2M磷酸氫二鈉溶液１0．30ｍｌ加0。1Ｍ檸檬酸9．7０ml配成。PH８:取０.２M磷酸氫二鈉溶液19。45ｍｌ加0.１Ｍ檸檬酸0。55mｌ配成。PＨ９。9：取0．1M碳酸鈉溶液5ml加0．1M碳酸氫鈉5ml配成。0。2M磷酸氫二鈉溶液含35。61g0．１M檸檬酸溶液含2１．０１g/L0.1M碳酸鈉溶液含2８.62g／Ｌ0。1M碳酸氫鈉溶液含８。40g六、參考文獻(xiàn)1、上海藥物研究所中草藥有效成分的提取和分離上海人民出版社2、中國醫(yī)科學(xué)院藥物研究所薄層層離及其在中草藥分析中的應(yīng)用科學(xué)出版社3、北京醫(yī)學(xué)院等中草藥成分分析人民衛(wèi)生出版社?實(shí)驗(yàn)二洋金花生物堿的提取分離洋金花又稱山茄花、曼佗羅花、馬蘭花等。洋金花為茄科曼佗羅屬植物白曼佗羅（Ｄａt(yī)uraｍｅｔelL)及毛曼佗羅（DｉnnoxiaＭiu）的花。所含成分主要有東莨菪堿、莨菪堿等.《本草綱目》中記載：諸風(fēng)及寒濕腳氣,煎湯洗之。又主驚厥及脫肛,并入麻藥。現(xiàn)代民間用于止咳平喘、解痙止痛作用,還用于外科手術(shù)麻醉劑。實(shí)驗(yàn)的目的要求1。掌握莨菪堿、東莨菪堿的提取分離方法。2.掌握生物堿的一般理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系。３.掌握生物堿及其鹽類溶解度規(guī)律及其應(yīng)用。掌握反流分布法(CCD）的原理及基本操作。掌握紙層析及沉淀反應(yīng)在生物堿檢識中的應(yīng)用。洋金花中已知成分的理化性質(zhì)1。東莨菪堿(Scoｐoｌamｉne、Hyosｉne）為黏稠的液體,其一分子水合物為針狀結(jié)構(gòu)，熔點(diǎn)５9℃，溶于冷水(1：95），易溶于熱水、乙醇、乙醚、氯仿或酮中，難溶于苯、石油醚中。堿性較弱,Pkａ=７。502.莨菪堿(Ｈyoscyamine)為四角針晶,熔點(diǎn)108。5℃,[α]－2１0°（乙醇）難溶于堿水（1:２81)，能溶于苯（1：1５0）、醚(1:6９），易溶于氯仿（1：1）及醇和稀酸中。莨菪堿在光、熱和堿的作用下，易消旋化成阿托品。與酸水或堿水共熱時(shí)，則極易水解，生成莨菪醇和(一）莨菪酸.生物堿的提取分離1。原理利用脂溶性生物堿在酸性條件下成鹽后，溶于水不溶于極性小的有機(jī)溶劑,在堿性條件下成游離生物堿,溶于極性小的有機(jī)溶劑，不溶于水，反復(fù)處理，籍以使脂溶性的莨菪堿和東莨菪堿與雜質(zhì)分開。2。工藝洋金花（磋碎)1０g置１00ml燒杯中，加水8０ml，用濃鹽酸調(diào)PH為２左右，浸泡24小時(shí)，過濾。濾液留5—７ml（A）做生物堿沉淀反應(yīng)用濃氨水堿化至ＰH8-9,分別用氯仿20、15、1５ｍｌ振搖提取三次。?氯仿液水液留取15ml（B）供層析用其余氯仿液回收氯仿?總堿（Ｃ)注：［1］PH8－９足可以使莨菪堿和東莨菪堿游離，切不可使PＨ值過高,以盡量減少生物堿的水解速度.此步操作最好是先將溶液和氯仿加入分液漏斗中,然后再堿化，振搖，以減少生物堿在堿水中的停留時(shí)間.［2］振搖時(shí)注意防止乳化，不宜做猛烈振搖，以適度旋轉(zhuǎn)式萃取為以宜，一旦乳化，可用加熱或用玻璃棒摩擦容器內(nèi)壁，以破壞乳化層,［3]所得總堿（C）用5ｍl氯仿(預(yù)先已用PH6．５緩沖液飽和）分次沖洗轉(zhuǎn)移到小錐形瓶中,供分離用。3。莨菪堿和東莨菪堿的分離（１)分離條件的考察取一條15×５cｍ層析濾紙，用鉛筆劃出起××××始線（距底端２ｃm)、垂直于起始線再劃三條縱線，將濾紙分四等分（如圖2－1)。用棉球蘸取不同的ＰH緩沖液，依次(按PH５、6。5、7．5、9)的順序,涂布于濾紙條帶上,涂布操作要求均勻、快速、盡量減少緩沖液向鄰近區(qū)間擴(kuò)散.涂畢，將濕濾紙夾于兩張干濾紙之間,吸取多余的水分。然后用毛細(xì)管取總堿溶液圖2－１(Ｂ)，點(diǎn)于各條的原點(diǎn)處以水飽和過的氯仿展開5—10cm,取出，以改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色。記錄各種PＨ條件下的Rf值，并據(jù)此選擇圖2－１分離這兩種生物堿的適宜PH值。(２)CCD法操作方法取三支小分液漏斗,分別編號，每只內(nèi)盛PH6.5的緩沖溶液或PH6。5的水（它們要和流動(dòng)相相互飽和）5ｍl,然后將總堿(C)的氯仿溶液5ml轉(zhuǎn)入第一個(gè)分液漏斗中，振搖，分層,然后將氯仿層再轉(zhuǎn)移到第二部分分液漏斗中，此時(shí)，第一個(gè)分液漏斗加入新的流動(dòng)相氯仿（用緩沖溶液飽和過的）。二個(gè)漏斗分別振搖,分層轉(zhuǎn)移。分別將第一、二漏斗中的流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到第二、三個(gè)漏斗中，那么第一個(gè)漏斗中再加新的流動(dòng)相氯仿5mｌ，再振搖，如此完成了CＤD基本操作。以后的操作繼續(xù)同上轉(zhuǎn)移，但在第一個(gè)漏斗中不再加入新的流動(dòng)相。從第三個(gè)分液漏斗轉(zhuǎn)移出的流動(dòng)相放入收集瓶中，如此進(jìn)行三次，即可得到三個(gè)氯仿相及三個(gè)水相.流動(dòng)相（氯仿）（分液漏斗)固定相(PH6.５緩沖液）收集瓶圖２圖２—2四。生物堿的檢識１。生物堿的沉淀反應(yīng)取洋金花酸水液(A)每份1ｍl,置于試管中,分別滴加下列各試劑2—4滴，觀察并記錄有無沉淀產(chǎn)生及顏色變化。(1）碘化鉍鉀試劑（2）硅鎢酸試劑(3)苦味酸試劑(樣品液需調(diào)至中性）（4）鞣酸試劑2.薄層層析硅膠吸附劑—硅膠G薄板展開劑-氯仿：甲醇（8：2)樣品:３個(gè)水相,3個(gè)氯仿相，總生物堿（B）對照品：東莨菪堿氯仿液莨菪堿氯仿液顯色劑：改良碘化鉍鉀記錄:薄層層析圖譜，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：總堿中含有何種生物堿，哪種含量高些?CCD法中東莨菪堿和莨菪堿各集中于哪些符號中？該分離結(jié)果與其紙層析值的大小有何相關(guān)性？五。預(yù)習(xí)要求及思考題:１．預(yù)習(xí)要求充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)提綱,領(lǐng)會(huì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的操作方法及其原理，并能初步判斷其可能出現(xiàn)的結(jié)果。結(jié)合教材有關(guān)內(nèi)容：（1)生物堿及其鹽類溶解度的規(guī)律及其在提取分離工作中的應(yīng)用,（2）CＣＤ法的原理及操作，它與PPC的關(guān)系。２。思考題（１）莨菪堿與東莨菪堿的堿性何者較強(qiáng)？試在理論上進(jìn)行解釋，并提出實(shí)驗(yàn)根據(jù)。（2)CCD法的基本原理是什么?怎樣加入樣品？怎樣轉(zhuǎn)移？怎樣鑒定分離結(jié)果？怎樣選擇適當(dāng)?shù)腃CD條件（包括固定相和流動(dòng)相）?（３)本實(shí)驗(yàn)中用水提總堿時(shí),為什么調(diào)PH2-3？用氯仿提總堿時(shí)為什么調(diào)PH8－9,分離總堿時(shí)為什么又調(diào)ＰH６.5?（4)生物堿沉淀反應(yīng)時(shí),應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？在下結(jié)論時(shí)應(yīng)注意哪些問題？六、記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告１.記錄總堿的提取工藝(流程式）,總堿的沉淀反應(yīng)現(xiàn)象及總堿的層析結(jié)果。2．記錄分離條件考察結(jié)果（繪層析圖），說明分離莨菪堿和東莨菪堿的最佳條件為何？３．記錄分離結(jié)果４.記錄在實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)三大黃中蒽醌類成分的提取、分離和鑒定大黃為蓼科植物掌葉大黃ＲheuｍPaｌmａｔclml,唐古特大黃R.tangutiumMaxim。etRegll及藥用大黃R．offｉcinalｅBａｉlｌ的干燥根及根莖。大黃中含有多種游離的羥基蒽醌類化合物及它們與糖結(jié)合成的甙.其中主要有大黃酸（Ｒhein）、大黃素(Eｍoｄｉn)，蘆薈大黃素（Ａloｅ—eｍodｉn）、大黃素甲醚(Physciｏn）、大黃酚（Cｈrｙso—phanaｌ）。大黃記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》等許多文獻(xiàn)中，用于瀉下、健胃、清熱、解毒等。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?。學(xué)習(xí)緩沖紙層析的基本操作技術(shù)，并能根據(jù)紙層析結(jié)果，設(shè)計(jì)液—液萃取法分離混合物的實(shí)驗(yàn)方案。2．掌握ＰH梯度萃取法的原理及操作技術(shù)。3。學(xué)習(xí)蒽醌類化合物的鑒定方法。二、大黃中已知主要成分的理化性質(zhì)名稱晶形熔點(diǎn)－H-CＯＯH大黃酸（Ｒhein)黃色針晶３1８-320—ＣＨ—ＯH大黃素（Ｅmodiｎ)橙色針晶２56-25７-H蘆薈大黃素(Aloe－emodｉn)橙色細(xì)針晶21６－220-CH大黃素甲醚（Ｐhyscion)磚紅色針晶207-H大黃酚(Ｃhrysｏ—phaｎal)金色片狀細(xì)晶196大黃中蒽醌甙元，其結(jié)構(gòu)不同,因而酸性強(qiáng)弱不同。大黃酸聯(lián)有,酸性最強(qiáng)；大黃素聯(lián)有β，酸性第二；蘆薈大黃素聯(lián)有,酸性第三；大黃素甲醚聯(lián)有，大黃酚聯(lián)有，該基團(tuán)不為酸性基團(tuán)，但因母核中具有１，8—二酚羥基,也具有一定的酸性,酸性第四。蒽醌類化合物在植物體內(nèi)主要以甙的形式存在，有單糖甙，也有二糖甙。其中主要有大黃酸葡萄糖甙，大黃素－1-Ｏ—β—D葡萄糖甙、蘆薈大黃素ω—O—β-D葡萄糖甙、大黃酚雙葡萄糖甙，大黃素甲醚葡萄糖甙。此外,新鮮大黃中還有屬于雙蒽醌的番瀉甙Ａ及番瀉甙B等。本實(shí)驗(yàn)先用酸水將蒽醌甙充分水解成總蒽醌甙元，再用不同PＨ緩沖紙層析為先導(dǎo)，選用適宜的不同的ＰＨ緩沖液分步萃取，以分離不同酸度的蒽醌甙元。三、大黃中蒽醌類成分的提取分離1。原理大黃中的蒽醌類成分大部分和糖結(jié)合，以蒽醌甙的形式存在于植物組織中,所以要用酸水水解使其生成甙元,蒽醌甙元可溶于苯，故用苯提取.2.工藝（1)大黃中總蒽醌甙元的提取大黃粗粉（10０g)?加20％30ml，苯４0ml，水浴回流2小時(shí)，用棉花過濾?殘?jiān)?苯提取液(2)總蒽醌甙元分離方法的設(shè)計(jì)①大黃總蒽醌甙元的紙層析為了了解總蒽醌甙元所含成分，進(jìn)行如下紙層析實(shí)驗(yàn)取新華濾紙，距離下端2cｍ處劃一起始線,點(diǎn)加總提取液，用甲苯為展開劑上行展開，用０．5%醋酸鎂甲醇液噴霧，并在１00℃下加熱5分鐘顯色，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出共有4個(gè)組分，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對照得知，Ｒf=0。96是大黃酚和大黃素甲醚的混合物；Rf＝0.7８是蘆薈大黃素；Rｆ=0。58是大黃素;Rf=0．１8②蒽醌類成分的緩沖紙層析實(shí)驗(yàn)為了分離以上四種化合物，進(jìn)行緩沖紙層析實(shí)驗(yàn)，以確定最佳分離條件。緩沖濾紙制備：取新華濾紙,22×14cm離下端2cｍ處劃一起始線，再每隔1cｍ劃縱向平行線稱重,在每一條帶處順次涂布不同PH的緩沖液和堿液,涂完后，將濕濾紙夾在兩張濾紙中間,然后取出稱重,使其濕潤指數(shù)為1．5（即濕重為干重1．5倍）。在每一條帶原點(diǎn)處,點(diǎn)總蒽醌甙元提取液，用水飽和過的氯仿為展開劑上行展開，當(dāng)展開劑上升至5－7cm時(shí),取出,烘干，其結(jié)果如圖－２所示。在圖-2中，可以看到有三條“S"形曲線，其中Ⅰ為大黃酸；Ⅱ?yàn)榇簏S素；Ⅲ為蘆薈大黃素；余下的是大黃素甲醚和大黃酚的混合物.緩沖濾紙各條分別依次用下述緩沖液或堿液處理:1—ＰH3．2０,2—ＰH1。68,3—PH5。80,4—PH6．01，5-PH６。５5，6—PＨ7．１2，7-PH7.88（以上為檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液），8—PＨ9.１8(硼酸緩沖液),9—5%，1０-PH9.9０,11—PH1０.50（10、11為-緩沖液），1２—0。5％，13—２．５％，1４-５%，15、１６、17分別為５％:5％（9：1,1：1，1:９），１8—5％水溶液.注:配好的緩沖溶液,用PH酸度計(jì)測定PH值。③最佳萃取劑的確定根據(jù)圖-2紙層析結(jié)果可以確定a。萃取大黃酸時(shí)以ＰH７.12緩沖液最為合適,因?yàn)樵诖藯l件下，總蒽醌中的大黃酸留在原點(diǎn)不動(dòng)，而其它成分幾乎被推至前沿，說明大黃酸對PH7．１2緩沖液親合力強(qiáng),在萃取時(shí)易轉(zhuǎn)溶于緩沖液中，其余成分對苯親合力大,萃取時(shí)仍留在苯液中，從而得到分離。b。萃取大黃素時(shí),以PH9.９0緩沖液為宜，理由同上。c.萃取蘆薈大黃素時(shí),則以5％:5％（9：1）為宜。d。大黃酚和大黃素甲醚留在苯母液中，可被5％提出。④各種萃取劑用量的計(jì)算確定a.分離組分Ⅰ（大黃酸)，PH7.1２緩沖液的用量計(jì)算如下：在PＨ7。12條帶處,Ⅰ號組分(大黃酸）=０。02，Ⅱ以上（其余甙元）＝0.90大黃酸的分配系數(shù):＝0。０1其余的甙元分配系數(shù)：=４．5由此計(jì)算容積比：分離因子：=4５0R=1/0．21說明在分離大黃酸時(shí),苯總提取液與萃取劑的容積比應(yīng)為1：０.21，又由于β值很大(450）,因此可做一次簡單萃取。ｂ．分離組分Ⅱ(大黃素）,PH=9。90緩沖液的用量計(jì)算如下:在PH9。９0條帶處，Ⅱ號組分（大黃素）,Ⅲ號以上成分大黃素的分配系數(shù):=0。０２其余的甙元分配系數(shù):=4.５由此計(jì)算容積比：分離因子:=225由此可知，用PＨ９．90緩沖液萃取大黃素時(shí)，用量應(yīng)為苯萃取液的０.３倍，又由于β值很大（225)，因此可做一次簡單萃取。c。分離組分Ⅲ（蘆薈大黃素）,堿液用量計(jì)算如下:在5％:5％（9:１）條帶處：Ⅲ號組分(蘆薈大黃素）＝０.21Ⅳ號以上組分=0.９6蘆薈大黃素的分配系數(shù)：=0。1３1=１2由此計(jì)算容積比：分離因子:=９1。6由此可知，用5％：5％(9：1)的堿液萃取蘆薈大黃素時(shí),用量應(yīng)為苯總提取液的1.２5倍,又β〉50，仍做簡單萃取，（３)蒽醌類成分的分離和精制工藝苯總提取液(30mｌ)?加ＰH=7.１2緩沖液１5ml,振搖萃取一次。 緩沖液層（下層）? 苯層（上層）?加鹽酸酸化至 加PH=９.９0緩沖液20ml，ＰH＝３沉淀過濾?振搖萃取一次濾液 沉淀(Ⅰ）? 苯層 緩沖液層 干燥后用用5％KOH15ml?加鹽酸酸化至?２ｍl冰乙酸萃取2次?PH=3沉淀過濾?結(jié)晶 ??大黃酸?苯液 ?堿水層 ?濾液 ?沉淀（Ⅱ) (黃色針晶)??用少量?用鹽酸酸化?冰乙酸 至PH=3沉淀? 結(jié)晶 經(jīng)磷酸氫鈣層析?過濾 大黃素 石油醚洗脫 (橙色結(jié)晶) 濾液?沉淀(Ⅲ）先流出部分?后流出部分 干燥后，用乙酸（大黃酚）?（大黃素甲醚) ?乙酯結(jié)晶?蘆薈大黃素 （黃色針晶）注：由于溫度對分配系數(shù)影響很大,所以最佳萃取劑的確定要以實(shí)驗(yàn)溫度下紙層析結(jié)果為準(zhǔn)，選擇和計(jì)算。一般萃取大黃酸時(shí)在PH7—8范圍,萃取大黃素則在PＨ9。5—11范圍內(nèi)均可。2、操作方法ａ、大黃酸的分離與精制將含有總游離蒽醌的苯提取液移置２00ml的分液漏斗中，加7。１２緩沖液〉1５mｌ,充分振搖，靜置至徹底分層，放出苯液后,倒出緩沖液置燒瓶中,加HCＬ酸化至PH３，黃色沉淀析出完全后,過濾、沉淀、干燥,干燥后的樣品加少量醋酸加熱使其溶解，趁熱過濾，濾液靜置，析出黃色針晶為大黃酸，過濾得到純品,可供鑒定.ｂ.大黃素的分離與精制將提過大黃酸的苯液繼續(xù)移置分液漏斗中，用ＰH9．9緩沖液２１ml振搖萃取,徹底分層后,分出緩沖液層,用HＣL酸化至PH３，析出棕黃色沉淀，過濾,沉淀經(jīng)干燥后，用少量冰醋酸加熱使其溶解，趁熱過濾,濾液靜置,析出橙色大針晶，過濾后,即得到大黃素純品，可供鑒定用。大黃素的結(jié)晶溶劑最好是吡啶，但因吡啶臭味難聞，故用冰醋酸。C、蘆薈大黃素的分離與精制余下苯液移置分液漏斗后,用5％Na2ＣO3：5%ＮaOH(9:1）堿水液８８ml分兩次萃取或用0．5％KOＨ88ml分兩次振搖萃取，分出堿水液加HCL酸化，析出的沉淀過濾干燥,用少量的乙酸乙酮結(jié)晶，得到黃色針晶的蘆薈大黃素純品，可供鑒定用.D、大黃酚和大黃素甲醚的分離—磷酸氫鈣柱層析(1）裝柱：取11５℃活化１0小時(shí)的磷酸氫鈣５ｇ放入100ｍl燒瓶中，加入一定體積的石油醚，攪拌均勻,取一潔凈的層析柱,底部放入一小塊脫脂紗布,松緊適宜,稍稍打開底部的螺旋夾，將伴有溶劑的CaＨP4（２）樣品上柱：將萃取后余下的氯仿液,回收至2-3ml，左右，過濾，濾液加適量的CaHP4拌勻,并于紅外燈下?lián)]散溶劑,然后加入層析柱的頂端，滴加石油醚,是樣品均勻濕潤，然后加少量CaHＰ４至柱頂，再加一小片濾紙至頂部，以防加入吸脫劑是將樣品沖起。(3）洗脫：由柱頂加入石油醚洗脫,先洗出的淺黃色流份為大黃酚,后流出的黃色流份為大黃素甲醚,分段手機(jī)，交叉段棄去.將收集的兩組溶劑回收至小體積時(shí),可分別析出大黃酚,和大黃素甲醚，用乙酸乙酯結(jié)晶得到大黃酚的片狀結(jié)晶，供鑒定用.大黃素甲醚如混有大黃酚時(shí)，可多次重結(jié)晶,即可得到大黃素甲醚純品。［說明]1。進(jìn)行洗脫操作時(shí)，應(yīng)注意控制洗脫液的流速，如流速太快，難以建立平衡,太慢則譜帶容易擴(kuò)散,都影響分離效果。2．應(yīng)選用層析規(guī)格。四、蒽醌類成分的鑒定本實(shí)驗(yàn)練習(xí)用ＰC的熔點(diǎn)及IR鑒定蒽醌類成分。1。紙層析鑒定取樣品的氯仿溶液，用新華濾紙上行展開,用０。5％的甲醇溶液噴霧,并在1０0℃下加熱5分鐘。展開劑:Ⅰ：石油醚（60℃-70℃Ⅱ：石油醚，以水飽和Ⅲ：丙酮：苯:水(3:4:2）取下層液.根據(jù)層析結(jié)果，初步判斷樣品的結(jié)構(gòu)類型。［附注說明]紙層析對蒽醌類化合物的鑒定是很有幫助的。在不同溶劑系統(tǒng)中層析，并用堿或醋酸鎂等試劑顯色,根據(jù)Rf值的大小及斑點(diǎn)的色澤,可初步獲知蒽醌衍生物的結(jié)構(gòu)概貌。尤其是對混合物中已知成分的鑒定(與標(biāo)準(zhǔn)品對照）。PC是一種簡單而迅速的手段.早已用于研究蒽醌衍生物在植物中的分布情況,并用于探討蒽醌成分與植物分類的相關(guān)性,即化學(xué)分類問題。（１）游離羥基蒽醌衍生物的紙層析,常用的展開劑有：①石油醚（６0℃-70℃②石油醚（４０℃-5０℃):丙酮:水（1:1③丙酮：苯：水(3:４:2），取下層溶劑.④石油醚(40℃⑤正丁醇,以２８%氨水飽和。⑥甲苯⑦苯,以97％甲醇飽和。（2)顯色劑:0.５%甲醇溶液噴霧，于１0０℃加熱顯色，或噴以5％氫氧化鈉溶液.（3）結(jié)構(gòu)與Rｆ值的關(guān)系甲:用溶劑①展開時(shí)，蒽醌母核上的取代基種類，數(shù)目與Rｆ值的關(guān)系如下表所示：取代基數(shù)目取代基種類1234０.０00．01—0.070。07—0。5００.00—0．010.75左右0．０5－0。2３０.200。030．98０.980．９7—0。980。97由上表可知：a。α-OH蒽醌因與Ｃ=O形成分子氫鍵，故極性最小。Rｆ皆在0。97—0.98。b．促使蒽醌Rf降低的取代基，以降低程度大→小的順序排列為－COOH>－＞＞分子中只要有一個(gè)-COOＨ,Rｆ值即為0。０0，如大黃酸等。分子中只要有一個(gè),會(huì)使Ｒf值降至0。07。如蘆薈大黃素。β—酚羥基也有較大極性,故β羥基蒽醌的Ｒｆ也明顯降低。當(dāng)分子中有兩個(gè)β－OH時(shí)，Rf值可降至0附近。若分子中只有一個(gè)β-OＨ時(shí)，Rf值可降至０.0７-0.50左右，其中尤以鄰二羥基蒽醌的Rf值更低，間二羥基蒽醌Rf稍高。如：茜草素[1，２－２（OH）］Rf０。1７紫草素［１,２,4—3（OH）］Rf0.13大黃素［1，６,8－3(OH)－３—]Rf0.３0茜黃素[1,3－3（ＯH）-2—]Rf0.48α位的甲氧基對Rf值也有一定影響.如果分子中有四個(gè)α—甲氧基會(huì)使Rf降至0．０3左右，有二個(gè)α－甲氧基，Ｒf為0.05-０．28，只有一個(gè)α甲氧基，Ｒｆ為0。75左右。ｃ．甲基、β-甲氧基對Rf值影響較小。d。β－ＯH甲基化后，化合物的Ｒf值應(yīng)升高；相反，α-OH甲基化后，蒽醌衍生物的Rf值則降低。乙：用溶劑系統(tǒng)③展開時(shí)，與①恰好相反,因?yàn)橛玫氖窍聦铀嗳軇?極性高。故極性強(qiáng)的化合物（含－COＯＨ及二個(gè)β－ＯH者)在本系統(tǒng)中得到展開并相互分離。含－CＯOＨ基者Rf0.6５以上，含雙β-OＨ者Rf0.4５左右。如：化合物溶劑系統(tǒng)①溶劑系統(tǒng)②大黃酸［1,8－2（OH)－3—COOH]0０.74大黃素［1,6，8-３(ＯH)－3-COOH]00.6５2，7－2(OＨ）-蒽醌00。452,３－2（ＯＨ）－蒽醌00。4６丙:溶劑系統(tǒng)④的極性最小，因此極性小的蒽醌衍生物（分子中只含α或β－OH、－及甲基的衍生物）可用本溶劑系統(tǒng)分離。例如大黃酚與大黃素甲醚在其它溶劑系統(tǒng)中是難以區(qū)分的,但在本溶劑系統(tǒng)中卻可以較好的分離。化合物溶劑系統(tǒng)①溶劑系統(tǒng)④溶劑系統(tǒng)⑥大黃酚[1，8-２（OH)—3-］0.980.950。９８大黃素甲醚[1,8-2（ＯＨ）—3-—6-］０。970.７８0．98丁:溶劑系統(tǒng)⑤可以分開有—CＯＯH,羥甲基、和β－ＯH、—OH的蒽醌。如：化合物溶劑系統(tǒng)⑤大黃素［１，6，８—3（OH)—3-］０。82蘆薈大黃素[1，8—2(OH）—3—］0.69大黃酸[１，８-２（OH）—3－COOH］0．40戊：溶劑系統(tǒng)⑥為單一的甲苯，使用方便，其層析規(guī)律與系統(tǒng)①相仿.但β—OH及—取代蒽醌的Rf值與①相互顛倒?；衔锶軇┫到y(tǒng)①溶劑系統(tǒng)⑥大黃酚［１，8—2(OH）－３-]0。980.98大黃素甲醚[1，８-2（OH）—3－－６—]0.9７0。６8蘆薈大黃素［１，８—2（OH)-3—］0。07０．65大黃素［１,６,8－3（OH）-3-］０.30０。40大黃酸[１，8—2（OH）-３－COOH]0.０0０．００蒽醌結(jié)構(gòu)與Ｒｆ值的關(guān)系,除了上面所述的規(guī)律，還有許多人運(yùn)用不同的溶劑系統(tǒng)做了大量的探討.其中尤以月田潔(藥學(xué)雜志，74,388，１9５４）的工作引人重視，他用多種溶劑系統(tǒng)測定了近2０種的蒽醌衍生物,并得出了結(jié)構(gòu)與Rf值的關(guān)系,可供參考。2．熔點(diǎn)的測定:把重結(jié)晶后的純品，分別用裝有濃硫酸的b形熔點(diǎn)測定器進(jìn)行熔點(diǎn)測定。大黃酸黃色針晶318－３20大黃素橙色針晶２5６-257蘆薈大黃素橙色細(xì)針晶216—220大黃素甲醚磚紅色針晶2０7大黃酚金色片狀結(jié)晶196ＩR光譜取檢品,用KBr壓片,測得其紅外光譜如圖：cmcm-1320028001700160013001100700400大黃酸的紅外光譜4000320016001400110080040040003200160014001100800400cm-1大黃素的紅外光譜cmcm-1320016001100800根據(jù)上面三張圖譜，判斷蒽醌的結(jié)構(gòu)類型，特別注意Vc=o與結(jié)構(gòu)的關(guān)系.具體解析參考教科書。大黃素甲醚、大黃酚的IＲ光譜從略.五、預(yù)習(xí)要求、思考題預(yù)習(xí)要求:ａ。初步掌握液、液萃取法選擇溶劑的理論及操作。b.預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)所用的方法及原理。2。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求:記錄大黃總蒽醌的提取方法?？傒祯腜C檢查結(jié)果(附層析譜)總蒽醌的緩沖紙層析結(jié)果，并說明.它對總蒽醌分離方案設(shè)計(jì)有何意義?記錄總蒽醌的分離程序（包括溶劑用量)；記錄大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素的精制方法及PＣ和IR鑒定結(jié)果.3。思考題PＨ梯度萃取法的原理是什么？適用于哪些中草藥成分的分離?b．大黃種五種蒽醌類成分酸性和極性應(yīng)如何排列？?實(shí)驗(yàn)四蘆丁的提取、分離與鑒定蘆丁（Ｒｕtim）亦稱蕓香甙（Rｕｔinoside），廣泛存在于植物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含蘆丁的植物至少70種以上，如煙花、槐花、蕎麥和蒲公英均含有，其中以槐米和蕎麥葉含量較高，可作為提取蘆丁的原料。槐花米系六科植物Sophoｏｒaｊaponｉｃa的花蕾，自古作為止血藥.槐米中所含主要成分蕓香甙，又減少毛細(xì)血管的通透性作用。臨床主要用于防治高血壓病的輔助治療藥物。此外,蘆丁對于放射線傷害所引起的出血癥亦有一定作用。一、試驗(yàn)?zāi)康囊?、以蘆丁為例學(xué)習(xí)黃酮類成分的提取分離方法。2、掌握黃酮類成分的主要性質(zhì)及黃酮甙，甙元和糖部分的鑒定方法.３、掌握含羥基化合物進(jìn)行以酰化的操作方法。4、通過槲皮素紫外吸收光譜的測定及應(yīng)用化學(xué)位移試劑確定黃酮類羥基位置的方法。5、通過槲皮素與其五乙?；衔锏募t外光譜測定,確定該化合物的光能團(tuán)，并與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對照。二、槐米中已知主要成分的理化性質(zhì)槐花米中蘆丁的含量可高達(dá)２0%，另含少量皂甙.皂甙水解后，可得到華皮醇(Betｕｌｉn,C30H5０O２).

1、蘆丁（蕓香甙Ratiｎ)R=HR=H槲皮素R=蕓香糖蘆丁本品為淺黃色細(xì)小針狀結(jié)晶，含有3個(gè)結(jié)晶水熔點(diǎn)為1７7—178℃，無水物熔點(diǎn)190溶解度溶劑H2ＯMeＯHEtＯH吡啶熱１：2001：１0１:60易溶冷1:30001:１00１：6５01：1２易溶于熱水，難溶于冷水,溶于甲醇、乙醇，難溶于乙酸乙酯,丙酮；不溶于苯，乙醚、氯仿、石油醚等溶劑,易溶于堿液呈黃色,酸化后又析出。2、槲皮素(Quercetｉn）即蕓香甙元,為黃色結(jié)晶，Ｃ15Ｈ10Ｏ７.2H2Ｏ熔點(diǎn)３13-３14℃,無水物熔點(diǎn)31６℃。溶于熱乙醇（１:23）、冷乙醇（3、皂甙易溶于水、吡啶、能溶于甲醇。經(jīng)酸水解后得到華皮醇及槐二醇，均溶于苯、乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中。三、白槐花米中提取蘆丁1、原理：黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，能與堿反應(yīng)生成鹽而溶于水,溶液調(diào)至酸性后，又游離析出。此法為堿提—酸沉淀法，提取黃酮類成分常用的方法，此外，還可以采用水或醇的提取方法２、工藝注：[1]加入石灰乳即可達(dá)到堿溶解提取蘆丁的目的，還可以除去槐米中殘存的大量多糖類粘液質(zhì)，但用量不宜過大,PH值不能過高，否則鈣能與蘆丁形成鰲和物而析出沉淀,此步為關(guān)鍵步，一定注意。［2]ＰH值過低會(huì)使蘆丁形成佯鹽而降低收率。［3］利用蘆丁在冷熱水中溶解度的差別來達(dá)到結(jié)晶目的。得到的沉淀要粗稱一下,按照蘆丁在熱水中1：200的溶解度加蒸餾水進(jìn)行重結(jié)晶。蘆丁蘆丁石灰乳（大約1.5g左右）調(diào)至PH至8-9，加熱煮沸，保持30分鐘（注意維持PH8-9）趁熱過濾殘?jiān)鼮V液在60-70℃濾液沉淀（粗制蘆?。┲亟Y(jié)晶將沉淀懸浮于蒸餾水中，加熱煮沸15分鐘后趁熱過濾殘?jiān)鼮V液充分靜置，過濾60-70℃蘆?。ň破罚┧?、蘆丁的鑒定１、蘆丁的定性反應(yīng)取蘆?。?4mg，加乙醇5－6ml溶解,分成3分做下述試驗(yàn)：（1）取上述溶液１－2ml,加２滴濃艷算，在酌加少許鎂粉，注意觀察顏色變化情況。（2)取上述溶液1－2ml,然后滴加2%的甲醇溶液，注意觀察顏色變化情況，在繼續(xù)向試管中加入２·檸檬酸的甲醇溶液，并詳細(xì)記錄顏色變化情況。［1](3）α—萘酚反應(yīng)（Mｏlｉｓｈi'sReaction)取上述溶液1—2ｍｌ，然后再加等體積的10％α-萘酚乙醇溶液，搖勻,沿管壁滴加濃硫酸，注意觀察兩液界面產(chǎn)生的顏色變化。注：［1］在樣品溶液中加入20％ＺrＯCl2的甲醇溶液之后，如溶液呈黃色示可能有C３-OH或C5-OＨ。如再加入2％檸檬酸甲醇溶液,黃色不褪示有C3—ＯH;如黃色退去,加水稀釋后轉(zhuǎn)為無色,示無C3－ＯH但有C5－OH。（上述兩種條件下生成的絡(luò)合物因?qū)λ岬姆€(wěn)定性不同,其中Ｃ３－ＯH，４-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性）C５－OH，4-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性)。２、蘆丁的紫外光譜解析取蘆丁溶于光譜純甲醇中,加入各種診斷試劑測定其UV光譜,如果入土6－１所示,試解析光譜并初步判斷其結(jié)果。200300400500λ200300400500λnmMeOH+AlCl3——MeOH+AlCl3/HCl…200300400500λnmMeOH+NaOAc——MeOH+NaOAc+H3BO3…蘆丁的UＶ圖，其數(shù)據(jù)如下ＭeOH２59266sh2９9ｓh3５9NａOMe272327410AｌＣl3２７530３sh４33AlＣl3/HＣL２713003６4sh4０2NａOAC27１32５3９3ＮaOAC／Ｈ3BO3262２983873、蘆丁的三甲基硅醚NＭＲ波普解析取蘆丁的三甲基硅醚衍生物30mg,溶于０。５CCＬ４中,測得NMR圖譜如下是分析其結(jié)構(gòu).（圖6-2）注:1）δ０.8（d，3Ｈ為鼠李糖末端甲基）2)δ3．0—4.0（m,10H，為鼠李糖基質(zhì)子)３)δ4。２（S,1Ｈ為鼠李糖H-1)４）δ5.8（d1HJ=7H)為葡萄糖基H-１J=7H2說明Ciｌucose的結(jié)構(gòu)型為B型５）δ6．1５（d1HＪ＝2H）與6。35(ｄ1HＪ=2H）構(gòu)成A,B系統(tǒng)，分別為Ｈ－6,H—８６)δ6。9（d1HJ＝７H2)為Ｈ—５δ7。3（２Ｈ為H-６`H-2`(2）十乙?；J丁的NMR光譜分析NMＲoｆTＭSEｔherofRｕtininＣＣl48.07.06.05.04.03.02.01.008.07.06.05.04.03.02.01.00H-6H-2H-5H-8H-6H-1H-2glusosylrhamnosyCH3rhamnosyRhamnoglusosylprotonsTMSＰPＭ（g)取精制蘆丁(不得混有甙元）1００ｍg置于5０ml干燥的錐形瓶中,然后加入少量無水吡啶（大約１—２ｍl)振瑤使之溶解。在冰水冷卻下滴加8－10lml醋酸酐，接上空氣冷凝管,水浴上加熱3０分鐘。放冷，再攪拌下將反應(yīng)液頃入１０0mｌ冰水中，一直攪拌至油滴消失，白色沉淀析出為止。放置過夜,抽濾并洗滌沉淀，干燥后，將沉淀溶于少量95%乙醇中過濾，放冷，緩慢滴加蒸餾水?dāng)?shù)滴至剛剛混濁為止.然后加熱使之溶解,放置即得白色粉晶。（按同樣條件在重結(jié)晶一次）然后再槍式干燥器中干燥6小時(shí)即得蘆丁的乙酰化合物。取上述十乙?；J丁３0mg，溶于０。５mｌCDCl３中，以TMS為內(nèi)標(biāo)，測定NMR光譜(結(jié)果圖6－３）是與蘆丁三甲基硅醚衍生物的NMR進(jìn)行比較,尤其要注意乙?；馁|(zhì)子數(shù)目,借此判斷分制種ＯH的數(shù)目以及糖的數(shù)目。4、蘆丁水解后于甙元的鑒定（1）水解方法精密稱取蘆丁1ｇ(±0．3g），加1%硫酸３０ｍl，加熱40分鐘,放冷靜置過濾，所得沉淀用少量水洗滌出酸,干燥稱重,計(jì)算甙元于糖的重量比(1）,然后再用乙醇（95％大約１0ml）重結(jié)晶即得甙元。（母液可供做糖的紙層析鑒定）。8.07.06.05.04.03.02.01.008.07.06.05.04.03.02.01.00H-6H-2H-5’H-8H-6H-1,2,3,4–slucosylH-2,3,4-hamnosylH-2H–5,6(2protons)GlucosylH-S-rhamnosylrhamnosylCH3memonsylreduledspertomTMSＰPＭ（ｇ）(1)干燥稱重的甙元0．5g（次時(shí)干燥得的甙元含2個(gè)結(jié)晶水）。若按照甙元于糖的比例為１：2時(shí)；應(yīng)得甙元的理論值為０。５086g。若在9５-97℃之間干燥則得脫水甙元的理論值為0.４５４g（2）甙元的鑒定通過甙元的化學(xué)講解，ＵV光譜以及以?；苌锏闹苽?檢識其結(jié)構(gòu)。１）甙元的堿降解與降解產(chǎn)物的紙層析鑒定。++槲皮素間苯三酚原兒茶酸（ｑuerｃｅthn）(pｈｌoroｇlucｉnol）(proｔocａt(yī)e－ｃhｕriｃａciｄ）取甙元5０ml,加水和95％乙醇各5mｌ，以氫氧化鉀４g在石棉網(wǎng)上直火加熱回流5小時(shí)反映后揮去醇。然后，用稀鹽酸調(diào)成酸性(PH大約在2左右)用乙醚振瑤萃取，取醚層回收醚，殘液進(jìn)行緩沖紙層析。然后用Sulphanilicacid（1)試劑顯色，并與間苯三酚和原兒茶酚的標(biāo)準(zhǔn)品對照層析結(jié)果如注（2）所示。注（1）SulphanilｉcaciｄT。S間苯三酚降解液原兒茶酚Ａ液：10%Nａ２CＯ３水溶液間苯三酚降解液原兒茶酚B液：0.5％SuｌphaｎilicaｃidC液：0．5％Na２CO3水溶液顯色程序：先噴A液,然后再噴B和Ｃ的等量混合液(B與Ｃ用時(shí)臨時(shí)混合)注（2)甙元堿降解產(chǎn)物的層析結(jié)果如圖所示（展開劑:水飽和正丁醇，濾紙,在展開前要用ＰH＝9的緩沖液處理）（圖6-4）２）甙元的ＵV光譜解析取甙元溶于甲醇中，加規(guī)定試劑（見附錄）測得UV光譜如下圖（圖6—5），判斷其結(jié)構(gòu)。并根據(jù)甙元的UV光譜的差異判斷糖與甙元的聯(lián)結(jié)位置。200300400500λ200300400500λnmMeOH——MeOH+NaOMe…200300400500λnmMeOH+AlCl3MeOH+AlCl3+HCl…圖6-5其數(shù)據(jù)如下:甙元λmaｘaｍMｅOＨ255269sｈ301sh37０NaＭＥ2４7sh321(deｃ)AｌＣl３272304ｓｈ３3３4５8AｌＣl3／HCｌ26530１sｈ３5９428NaＯAc257sh２7４329390(dec）NaOＡc/Ｈ3ＢO3２613０3sｈ３88（程序Ⅲ）３)甙元乙?；锏娜埸c(diǎn)測定取甙元2０0mｇ,置于干燥的５０mｌ錐形瓶中,加５ｍl醋酐用滴管滴加濃硫酸1滴，振瑤是完全溶解，接上空氣冷凝管，水浴上加熱三十分鐘,放冷，在攪拌下將反應(yīng)液頃入10０ml冰水中一直攪拌至油滴消失為止。抽濾并洗滌沉淀,干燥后以95％乙醇重結(jié)晶。測得甙元乙?；锏膍p于槲皮素五一酰化物的熔點(diǎn)（１93℃)200300400500200300400500λnmMeOH+NaOAc——MeOH+NaOAc+H3BO3…（3)糖的鑒定將上得水解母液1０mｌ小心用Ｂa(OＨ）2（大約1－1。5g）細(xì)粉中和之中性,濾出生成的BaＳO４沉淀濾液小心濃縮至小體積（約１-2mｌ),此時(shí)注意防止炭火）取樣點(diǎn)于濾紙上,并用葡萄糖、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品對照以正丁醇—醋酸－水(４:1：5）作徑向展開。顯色劑:鄰苯二甲酸苯胺，噴灑后在105℃下加熱３—５五、預(yù)習(xí)要求及思考題：（1)預(yù)習(xí)要求：1、掌握堿酸法提取蘆丁的原理及注意事項(xiàng)2、定性反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理3、了解黃酮類UV與ＮMR波譜特點(diǎn)4、乙?；磻?yīng)的實(shí)驗(yàn)方法（2）思考題１、蘆丁的提取工藝中影響產(chǎn)量和質(zhì)量因素是什么?２、甙類結(jié)構(gòu)的檢識大體程序如何3、甙類水解有幾種方法?４、怎樣證明蘆丁分子中只含有一個(gè)葡萄糖和一個(gè)鼠李糖?５、甙元的結(jié)構(gòu)是怎樣確定的？6、怎樣證明蘆丁結(jié)構(gòu)中糖基是聯(lián)結(jié)在3－O上?7、槲皮素乙?；苌锏闹苽鋺?yīng)注意什么？六、紀(jì)錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告１、詳細(xì)記錄定性反應(yīng)結(jié)果2、繪制層析結(jié)果模擬圖并計(jì)算R值3、分析UV及NMR光譜4、分析討論試驗(yàn)結(jié)果（成功、失敗原因)

實(shí)驗(yàn)五人參皂甙的提取及甙元的分離鑒定人參為五加科（Ａｒaliaceaｅ）人參屬植物人參(Ｐａｎaxgin-seｎgＣ.A．Mｅyｅr）的干燥根，為我國特產(chǎn)名貴中藥.具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、固脫生津、安神益智的功效。主治虛咳喘促、食少倦怠、驚悸健忘、久虛不復(fù)等癥，療效顯著。有關(guān)人參化學(xué)成分的研究已有很多報(bào)道,近年來取得了較大進(jìn)展。日本學(xué)者Sｈibata等從人參根中分離出10多種皂甙,命名為人參甙皂（genseｎoｓidｅ)Ｒ。Ra,和等,并測定了這些皂甙得化學(xué)結(jié)構(gòu).近年來對人參地上部分也進(jìn)行了研究，葉、花、總皂甙中除了含有皂甙類成分外，還有黃酮類成分，主要為山奈酚（Kａｍpfｅrol）、三葉甙(Tｒifｅlin）和人參黃酮甙（Pａｎa－senｏsｉde）藥量及生化實(shí)驗(yàn)證明，人參皂甙有人參相同的藥理作用，目前認(rèn)為人參皂甙是人參中主要有效成分。人參中除含有多種人參皂甙外，還含有少量揮發(fā)油、脂肪油、膽堿、β谷甾醇、多種氨基酸和多種維生素等。人參皂甙的皂甙元有三種，即原人參二醇（Proｔｏpanaｘaｉol）、原人參三醇（Proｔoanａxｔｒiol）及齊墩果酸（Oｉeanolicacid）。前兩種皂甙元在水解過程中側(cè)鏈環(huán)合,故水解后實(shí)際得到的是人參二醇(Pａｎaxdｉol）及人參三醇（Pａnaxｔｒiol）。一、目的要求①通過實(shí)驗(yàn)掌握人參皂甙的提取、精制方法,進(jìn)一步鞏固和熟悉人參皂甙的性質(zhì)。②熟悉和掌握人參皂甙的水解條件和方法。③熟悉和掌握柱層析分離人參皂甙元的原理方法及基本操作技術(shù)。二、人參中已知主要成分的理化性質(zhì)人參皂甙：多數(shù)為白色無定形粉末或無色針狀結(jié)晶，味微甘苦，具有較強(qiáng)引濕性。易溶于水、甲醇、乙醇；可溶于正定醇和乙酸乙脂，不溶于乙醚、苯中。本品具有光學(xué)活性,在甲醇中多呈現(xiàn)右旋性。其水溶液經(jīng)振蕩能產(chǎn)生持久泡沫。人參皂甙類一般對酸極不穩(wěn)定，通常在稀的礦酸中即可水解，生成三種皂甙元，即齊墩果酸、人參二醇和人參三醇。各種主要單體人參皂甙的性狀及物理常數(shù)見表９－１表９-１10種人參皂甙的性狀及物理常數(shù)皂甙性狀（結(jié)晶溶劑)熔點(diǎn)(℃）甲醇分子式(結(jié)晶水)無色針晶(甲醇）2３9－241＋15。３3（0。9１)(2）白色粉末(乙醇:正定醇1:1５）197－19８＋12.12(０.91）(３）白色粉末（乙醇：正定醇1：５)22０-223＋3.０５（0。98）白色粉末(乙醇:正定醇1：５)199－20１—1．93(１.03７)(3)白色粉末（乙醇:正定醇１：1）2０6-209－19.３8(1.０3）無色針晶（50％乙醇)2０1—2０3－1．０0（１．００)白色粉末（丙酮)197-19８－６.９9（1.０0)無色甙水晶（正定醇－丁酮)194-196．5＋320（吡啶）（2）無色針晶（乙醇）18７－１8９-5.00-6．00（1．00)白色粉末(異丙醇）１８２－１8４+2１.00(１。01)三、人參中人參皂甙元的提取和甙元的分離鑒定１.原理:人參皂甙元與多個(gè)分子糖結(jié)合成甙，具有較強(qiáng)的親水性,易溶于水和低級醇類，實(shí)驗(yàn)室采用熱水提取人參皂甙，提取液加堿（CaO）除雜。再用酸調(diào)至中性，上大孔樹脂柱，先用水洗去色素至無色，再用７0%的氨性醇洗至無色,人參皂甙便溶于乙醇洗脫，回收乙醇，便得到人參總皂甙。人參總皂甙和?。菴ｌ在醇液中進(jìn)行溫和酸水解，可得到三種皂甙元，齊墩果酸、人參二醇和人參三醇。而不能得到原人參二醇和原人參三醇,這是因?yàn)樵谒崴膺^程中側(cè)鏈的２0－位碳原子上的羥基(－OH）與該鏈上的雙鍵（C＝C)易閉環(huán),而形成帶有三甲基四氫吡喃環(huán)的人參二醇和人參三醇.水解后，除去醇、氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離即可得到三種單體皂甙元,經(jīng)重結(jié)晶獲得純品,分別與已知皂甙的紅外光譜相一致.2．人參皂甙提取和甙元分離工藝流程①人參皂甙提取工藝:人參莖葉粗粉20g?熱水提取1小時(shí),粗濾，（棉花）?提取液藥渣?加０。6ｇ是會(huì)乳沉淀，并調(diào)至PH9-10，放置10分鐘,抽濾 沉淀物 濾液?濃硫酸調(diào)PH7,放置１0分鐘。 中性提取液?回收后,上大孔樹脂柱,先用水洗至無色，再用?70%氨性醇洗至綠色。?乙醇洗脫液 回收乙醇 人參總皂甙（黃白色)人參皂甙元的水解和甙元的分離流程人參總皂甙 加含5%ＨCl的５０％乙醇液,加熱回流２小時(shí) 沉淀?水解液?（酸性皂甙元部分） ?加水稀釋，水浴蒸去醇,氯仿萃取?3次（1０，5，5ｍl） 水層?氯仿層 無水ＮaＳO干燥，回收氯仿?總皂甙元 少量苯溶解,硅膠柱?層析，用苯－乙酸乙脂?(8:２）洗脫組分Ⅰ組分Ⅱ組分Ⅲ ９5%乙醇重95％乙醇重 丙酮結(jié)晶 結(jié)晶3次 結(jié)晶3次?2次齊墩果酸?人參二醇 人參三醇mp299—30１℃?mp245-250℃操作方法（1）人參總皂甙的提?。喝∪藚⑶o葉粗粉２０ｇ，放入燒杯用熱水（80℃－９0℃）提取1小時(shí)，然后用棉花粗濾,在所得濾液中加入０.６g水石灰乳除雜并調(diào)PH9－10放置10分鐘左右，過濾，再將濾液用濃硫酸（少量）調(diào)ＰH7，放置10分鐘左右，回收提取液至少量（5—10mｌ)，再上大孔樹脂柱(注：此柱應(yīng)提前洗好，清洗辦法略)先用蒸餾水洗至無色,再用（２）人參皂甙的水解稱取人參皂甙4－5g（不足時(shí)由老師提供），加２0倍量含５％HCl的50％乙醇溶液,加熱回流2小時(shí)，放冷，加0.5倍水,水浴去醇，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用氯仿萃取3此（1０，5，5mｌ），合并氯仿層，加少量無水硫酸鈉干燥，回收氯仿即得總皂甙元.（3)甙元柱層析分離稱取100－200目硅膠（105℃活化30分鐘）50g，用苯做洗脫劑濕法裝柱,柱頂放一層脫脂棉,壓上數(shù)個(gè)玻璃球，放出多余的苯（至高于吸附劑1ｃm），計(jì)算保留體積?？傇磉霸蒙倭勘饺芙馍现?，用苯-乙酸乙脂（８：2）洗脫,薄層檢識(與甙元標(biāo)準(zhǔn)品對照）相同組分合并，回收溶劑。齊墩果酸、人參二醇用９５％乙醇重結(jié)晶,人參三醇用丙酮重結(jié)晶，純品８0注：由于人參花、葉中人參皂甙含量高且廉價(jià),所以本實(shí)驗(yàn)可用人參地上部分作原料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，脫脂3—4次，由綠變棕紅即可，其它操作同前。如果用人參根總皂甙元進(jìn)行柱層析，要求學(xué)生精制人參二醇進(jìn)行紅外光譜鑒定。若用人參花、葉總皂甙元進(jìn)行柱層析分離，則要求學(xué)生精制人參三醇進(jìn)行紅外光譜鑒定。四、人參皂甙的檢識(一）顯色反應(yīng)1。醋酐—濃硫酸反應(yīng)（Lｉｅｂｅrmamm-Bｕrｃhand反應(yīng)）取人參皂甙樣品少許，溶于冰醋酸中，加醋酐—濃硫酸試劑（19:1)數(shù)滴,混勻,呈紅紫色.2。泡沫反應(yīng):取人參皂甙樣品少許于試管中，加水2-3ml溶解,密塞,用力振搖1分鐘，產(chǎn)生大量持久泡沫。(二）薄層層析1.人參皂甙TLC：吸附劑:硅膠G板展開劑：Ⅰ正定醇—乙酸乙脂—水(８:２：10）上層。Ⅱ氯仿-甲醇-水(13：7：2)下層。對照品:根、葉、花甲醇液（10mｇ/mｌ)顯色劑:10%乙醇液（V/V）,1１0℃加熱10分鐘，至棕紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。2．人參皂甙元TLC吸附劑:硅膠Ｇ板展開劑:苯—乙酸乙脂(１：1)對照品：人參二醇、人參三醇、齊墩果酸甲醇液顯色劑：同皂甙（三）光譜數(shù)據(jù)齊墩果酸：ＩR:330１，1700NMR（）δ：５。30,1.85，1.63，1.24，0.９1，0.７５人參二醇:ＩＲ:３301,1６26NMＲ（）δ:3。60,3.13，1。8８，1.6５，1。３3,0。９0人參三醇：IＲ：33４0,１617NMＲ(）δ:6．3２，4．60,3。６2,1．９5，１.60,1.3０,1．1