油茶種子抗腫瘤有效部位群化學(xué)成分含量的分析方法

油茶種子抗腫瘤有效部位群化學(xué)成分含量的分析方法【摘要】目的建立準(zhǔn)確簡便測(cè)量油茶種子中抗腫瘤有效部位群化學(xué)成分含量的分析方法。方法采用分光光度法。結(jié)果油茶種子60%丙酮-水提物中總皂苷純度為%，總黃酮含量為%，總酚含量為%(其中鞣質(zhì)占%)。結(jié)論分光光度法測(cè)定以上3種物質(zhì)簡便易行，準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性和回收率都較理想。

【關(guān)鍵詞】油茶種子；抗腫瘤；總皂苷；黃酮；多元酚；鞣質(zhì)

Abstract：ObjectiveToestablishtheaccurateandconvenientmethodfordeterminingthecontentsoftotalsaponin,totalflavonoids,totalpolyphenolandtannininCamelliaoleiferacontentsweredeterminedbyspectrophotometry.ResultsThecontentsoftotalsaponin,totalflavonoids,totalpolyphendandtanninwererespectively%,%,%and%.ConclusionThemethodisconvenientandreliableforthedeterminationofthethreesubstances,anditsreproducibilityandrecoveryratearefairlywell.

Keywords：CamelliaoleiferaAbel.;Anti-tumor;Saponins;Flavonoids;Polyphenols;Tannin

油茶CamelliaoleiferaAbel屬于山茶屬山茶亞屬油茶組植物。中國有油茶面積3660000ha，年產(chǎn)油茶種子645000t［1］，資源非常豐富。但長期以來，對(duì)油茶藥用價(jià)值方面的研究，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。我們課題組在對(duì)油茶藥用價(jià)值進(jìn)行研究的過程中，采用MTT比色法對(duì)其種子和油粕的石油醚、乙醇、水、60%丙酮-水的梯度溶媒提取物進(jìn)行體外抗癌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明油茶種子60%丙酮-水提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞株、人胃癌細(xì)胞株(SGC－7901)和人黑色素細(xì)胞瘤具有非常強(qiáng)的抑制作用。定性分析結(jié)果表明其含有大量皂苷、黃酮及多元酚類成分。為進(jìn)一步明確其抗腫瘤的有效部位及有效成分,本文對(duì)該有效部位群中的三大類成分進(jìn)行了定量分析,為抗腫瘤有效部位的分離純化提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

unico7200可見分光光度計(jì)；Laborata4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；BP210S十萬分之一電子天平；Jascov-560紫外可見分光光度計(jì)；油茶總皂苷對(duì)照品；蘆丁對(duì)照品；沒食子酸；所用試劑均為分析純；水為蒸餾水；油茶種子。

2方法與結(jié)果

總皂苷的測(cè)定［2］

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的油茶總皂苷對(duì)照品50mg，置100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得濃度為mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

供試品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的樣品20mg，甲醇溶解并定容至10ml容量瓶中，制得濃度為mg/ml的樣品溶液，備用。

測(cè)定波長的選擇取ml的對(duì)照品溶液及樣品溶液，分置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛溶液ml，高氯酸ml加塞，于60℃水浴中反應(yīng)15min，取出，冰水中冷卻至室溫，精密加入冰乙酸ml，搖勻立即在紫外分光光度計(jì)450～700nm波長下掃描，同時(shí)空白溶液做參比，確定檢測(cè)波長為588nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對(duì)照品溶液,,,,,ml，分置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛溶液ml，高氯酸ml加塞，于60℃水浴中反應(yīng)15min，取出，冰水中冷卻至室溫，精密加入冰乙酸ml，搖勻，隨行做空白實(shí)驗(yàn)，588nm波長下測(cè)吸光度。計(jì)算得回歸方程為：Y=2(r=9)。線性范圍為～mg/ml。

樣品測(cè)定精密吸取供試品溶液ml，置于具塞試管中，揮去甲醇，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中總皂苷的量，計(jì)算，即得。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液ml置于具塞試管中，揮去甲醇，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算總皂苷的含量。結(jié)果見表1。表1總皂苷測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已知總皂苷含量的供試品溶液ml置于具塞試管中，分別加入mg/ml的油茶總皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液ml,揮去甲醇,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定5次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。表2總皂苷測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黃酮的含量測(cè)定［3］

對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20mg，置100ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻，得濃度為mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

供試品溶液的制備精確量取油茶60%丙酮-水提取物7g置100ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20ml置100ml容量瓶中加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為4mg/ml的供試品溶液。

測(cè)定波長的選擇蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，用分光光度計(jì)在200～600nm區(qū)間進(jìn)行掃描。均在500nm處有最大吸收，因此選擇500nm為測(cè)定波長。測(cè)得的結(jié)果以蘆丁為基準(zhǔn)計(jì)算總黃酮的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液，，，，，ml分別置于試管中，各加甲醇至ml，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液ml，搖勻，室溫放置5min后，再加10%硝酸鋁溶液ml，搖勻，室溫放置5min后，加入4%的氫氧化鈉溶液ml，搖勻，室溫放置15min。以相同試劑為空白在500nm處測(cè)吸光度，以A值為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=+8(r=9)，線性范圍為2～mg/ml。

樣品測(cè)定精密吸取供試品溶液ml置于試管中，加入甲醇至2ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中蘆丁的量，計(jì)算，即得。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液ml置于試管中，加入甲醇至2ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果見表3。表3總黃酮測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已知總黃酮含量的供試品溶液ml置于試管中，分別加入蘆丁對(duì)照品溶液ml，余下部分按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定5次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表4。表4加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

多元酚及鞣質(zhì)的含量測(cè)定［4］

對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對(duì)照品10mg，置100ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25ml，置100ml棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

供試品溶液的制備精密量取油茶種子60%g丙酮-水提取物干浸膏0g置于200ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液20ml。精密吸取續(xù)濾液5ml置50ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液Ⅰ(mg/ml)。精密吸取續(xù)濾液5ml置于50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，倒入已盛有600mg干酪素的具塞錐形瓶中，30℃水浴加熱1h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，過濾，棄去初濾液10ml，續(xù)濾液作為供試品溶液Ⅱ，備用。

測(cè)定波長的選擇沒食子酸對(duì)照品溶液和供試品溶液經(jīng)磷鉬鎢酸-碳酸鈉顯色后，用紫外可見分光光度計(jì)在400～1000nm區(qū)間進(jìn)行掃描。結(jié)果表明最大吸收波長為754nm，因此選擇754nm做為測(cè)定波長。測(cè)得的結(jié)果以沒食子酸為基準(zhǔn)計(jì)算總酚和鞣質(zhì)的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，，，，，ml分別置于10ml棕色量瓶中，各加水至5ml再分別加入1ml磷鉬鎢酸試液，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。搖勻，以相同試劑為空白，30min后在754nm處測(cè)定吸光度，以A值為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=+9，r=8。線性范圍為7～2mg/ml。

總酚的測(cè)定精密吸取供試品溶液Ⅰml置于10ml棕色容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法，自“加入1ml磷鉬鎢酸試液”起，同法測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量，計(jì)算，即得。

不被吸附的多元酚測(cè)定精密吸取供試品溶液Ⅱml置于10ml棕色容量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法，自“加入1ml磷鉬鎢酸試液”起，同法測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中不被吸附的多酚的量，計(jì)算，即得。

鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液Ⅰml置于10ml的棕色容量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算總酚的含量，結(jié)果見表5；精密吸取供試品溶液Ⅱ2ml置于10ml的棕色容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算不被吸附的多酚的含量。結(jié)果見表6。表5總酚測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表6不被吸附多酚的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率實(shí)驗(yàn)精確吸取已知總酚含量的供試品溶液Ⅰ1ml和已知不被吸附的多酚含量的供試品溶液Ⅱ2ml置于10ml棕色容量瓶中，分別加入mg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液ml，余下部分照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定5次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表7～8。表7總酚測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表8不被吸附多酚的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3討論

皂苷的分析測(cè)定有多種方法，但分光光度法操作簡便、靈敏，屬于經(jīng)典、成熟的方法。采用分光光度計(jì)法測(cè)定其總皂苷的含量，其結(jié)果為%。

以蘆丁為對(duì)照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系為顯色劑，利用分光光度法測(cè)定總黃酮含量，操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。研究結(jié)果表明油茶種子60%丙酮-水提物種總黃酮含量為%。

總酚與鞣質(zhì)含量測(cè)定方法主要是參考了《中國藥典》鞣質(zhì)測(cè)定方法，以沒食子酸為對(duì)照品穩(wěn)定性好，干酪素吸附作用具有專屬性，操作簡便，且重復(fù)性和回收率都較理想。測(cè)定結(jié)果：總酚含量為%，其中鞣質(zhì)為%。

對(duì)于在這一有效部位群中，具體是哪一類成分為抗腫瘤的有效成分及其作用的機(jī)理，本研究組正在