抗壞血酸對細(xì)菌脂多糖引起發(fā)育毒性保護(hù)作用

抗壞血酸對細(xì)菌脂多糖引起發(fā)育毒性保護(hù)作用【摘要】目的研究抗壞血酸(AA)對細(xì)菌脂多糖(LPS)引起宮內(nèi)胎兒死亡(IUFD)、生長發(fā)育遲緩(IUGR)和骨骼發(fā)育遲緩的保護(hù)作用。方法實(shí)驗(yàn)1：LPS組小鼠于妊娠第15～17d經(jīng)腹腔注射LPS,LPS+AA組在LPS處理前和/或處理后經(jīng)腹腔注射給予AA，對照組給予等容量的生理鹽水或AA。所有孕鼠于妊娠第18d處死。實(shí)驗(yàn)2：LPS組小鼠于妊娠第16d注射LPS，LPS+AA組在LPS處理前和/或處理后經(jīng)腹腔注射給予AA，對照組給予等容量的生理鹽水或AA。LPS處理后6h處死孕鼠。結(jié)果LPS+AA預(yù)處理組平均每窩死胎數(shù)明顯低于單純LPS處理組，LPS+AA后和預(yù)+后處理組平均每窩死胎數(shù)與單純LPS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AA預(yù)、后和預(yù)+后處理均顯著抑制LPS引起IUGR和枕骨骨化不全。AA預(yù)和后處理均顯著抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盤組織脂質(zhì)過氧化，但AA預(yù)處理的作用強(qiáng)于后處理。結(jié)論AA預(yù)處理通過抑制LPS引起的氧化應(yīng)激，預(yù)防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼發(fā)育遲緩；AA后處理和預(yù)+后處理對抗LPS引起IUGR和骨骼發(fā)育遲緩，但對LPS引起的IUFD無明顯保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】細(xì)菌脂多糖

細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的類脂多糖，廣泛存在于人和動物的消化道內(nèi)〔1〕。LPS引起的胚胎吸收、宮內(nèi)胎兒死亡(intrauterinefetaldeath,IUFD)和早產(chǎn)已經(jīng)得到證實(shí)〔2〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，母鼠妊娠晚期接觸LPS引起胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩(intrauterinegrowthretardation，IUGR)和骨骼發(fā)育遲緩，活性氧(ROS)可能參與了LPS引起的胚胎發(fā)育毒性〔3,4〕?？箟难?AA)是重要的水溶性抗氧化劑，本文重點(diǎn)探討AA對LPS引起小鼠IUFD、IUGR和骨骼發(fā)育遲緩的保護(hù)作用。

1材料與方法

11試劑細(xì)菌脂多糖(EschericlSiacoliLPS,serotyoe0127：B8)和抗壞血酸(ascorbicacid，AA)(美國Sigma公司)。

12動物及實(shí)驗(yàn)方法清潔級ICR小鼠(7～8周，雄性30～32g，雌性26～28g)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(自由飲食，晝夜均衡，溫度20～25℃，濕度(50±5)%。交配時(shí)，按2∶4(雄∶雌)于21：00合籠，次日7：00檢查雌鼠陰栓，查到陰栓者定為妊娠第0d。分2個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1：孕鼠隨機(jī)分為單純LPS處理組，LPS+AA預(yù)、后和預(yù)+后處理組及對照組，所有孕鼠均于妊娠第15～17d給藥。單純LPS處理組僅注射LPS(75μg/kg，ip)；LPS+AA預(yù)處理組孕鼠注射LPS前05h給予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA后處理組孕鼠注射LPS后3h給予AA(500mg/kg,ip)；LPS+AA預(yù)+后處理組孕鼠注射LPS前05h和后3h各給予500mg/kg的AA；對照組給予等容量生理鹽水或AA。所有孕鼠于妊娠第18d處死，記錄活胎、死胎、吸收胎數(shù)和流產(chǎn)數(shù)，秤量活胎體重，測量身長和尾長，并評價(jià)活胎鼠骨骼發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)2：分組同實(shí)驗(yàn)1，每組11只，所有孕鼠均于妊娠第16d給藥。單純LPS組僅注射LPS(75μg/kg，ip)；LPS+AA預(yù)處理組孕鼠注射LPS前05h給予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA后處理組孕鼠注射LPS后3h給予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA預(yù)+后處理組孕鼠注射LPS前05h和后3h各給予500mg/kg的AA；對照組給予等容量生理鹽水或AA。LPS處理后6h處死孕鼠，取母肝、胎肝和胎盤，檢測丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。

13氧化應(yīng)激水平測定用Griffith法〔5〕測定組織GSH含量。通過測定脂質(zhì)過氧化的羰基產(chǎn)物MDA含量反映組織的氧化應(yīng)激水平，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)底物(TBARS)比色法〔8〕。蛋白含量用Lowry法〔7〕測定。

14統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS120統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和兩樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

21AA對LPS引起IUFD的影響單純LPS處理組平均每窩死胎數(shù)顯著高于對照組［(01±11)與(82±20)，P001］，LPS+AA預(yù)處理組平均每窩死胎數(shù)顯著低于單純LPS處理組［(31±45)與(82±20)，P001］。LPS+AA后處理組(54±63)和預(yù)+后處理組(62±52)平均每窩死胎數(shù)與單純LPS處理組(82±20)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。

22AA對LPS引起骨骼發(fā)育遲緩的影響(表1)母鼠妊娠晚期給予LPS引起胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化不全；AA預(yù)處理、后處理和預(yù)+后處理均顯著抑制LPS引起枕骨、后掌(趾)骨骨化不全。

23AA對LPS引起IUGR的影響(表2)母鼠妊娠晚期給予LPS顯著降低活胎體重、身長和尾長，AA預(yù)處理、后處理和預(yù)+后處理均顯著抑制LPS引起IUGR。

表1AA對LPS引起骨骼發(fā)育遲緩的影響

注：e枕骨評分：1=正常，4=上枕骨未見骨化點(diǎn)；與對照組比較，aP005，bP001；與LPS組比較，cP005，dP001

表2LPS和AA對宮內(nèi)胎兒生長發(fā)育遲緩的影響

注：與對照組比較，bP001；與LPS組比較，dP001

24AA對LPS引起組織MDA水平升高的作用(表3)母鼠妊娠晚期給予單劑量LPS，母肝、胎肝和胎盤組織MDA水平顯著升高(P001)。LPS+AA預(yù)處理組母肝、胎肝和胎盤組織MDA水平顯著低于單純LPS處理組(P001)；LPS+AA后處理組胎肝和胎盤組織MDA水平明顯低于單純LPS處理組(P005)，但母肝組織MDA水平與單純LPS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)；LPS+AA預(yù)+后處理組母肝和胎盤組織MDA水平顯著高于LPS+AA預(yù)處理組(P001)。

表3AA對LPS引起MDA升高的作用

注：與對照組比較，bP001；與LPS組比較，cP005，dP001；與LPS+AA預(yù)處理比較，eP001

25AA對LPS引起組織GSH降低的影響母鼠給予單劑量LPS，母肝、胎盤和胎肝組織GSH含量分別為(225±21)，(370±160)，(124±12)nmol/(mgprot)，顯著低于對照組(P001)。AA處理后，母肝、胎肝和胎盤組織GSH水平進(jìn)一步降低。

3討論

本研究結(jié)果顯示，母鼠妊娠第15～17d經(jīng)腹腔給予LPS，平均每窩死胎數(shù)顯著增加。此外，LPS顯著降低活胎平均體重、身長和尾長，并延緩胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化。結(jié)果表明，母鼠妊娠晚期接觸LPS引起IUFD、IUGR和骨骼發(fā)育遲緩。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),LPS+AA預(yù)處理組平均每窩死胎數(shù)顯著低于單純LPS處理組，AA預(yù)處理顯著抑制LPS引起活胎平均體重、身長和尾長下降，并逆轉(zhuǎn)LPS，引起的枕骨骨化不全。這些結(jié)果提示，AA預(yù)處理明顯減弱LPS引起IUFD、IUGR和骨骼發(fā)育遲緩。AA是重要的水溶性抗氧化劑。文獻(xiàn)資料證實(shí)，AA能直接清除機(jī)體產(chǎn)生的氫氧自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O-·2)，預(yù)防氧自由基引起的氧化性損傷〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，AA預(yù)處理顯著抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盤組織脂質(zhì)過氧化。結(jié)果提示，AA預(yù)處理可能通過清除LPS刺激機(jī)體產(chǎn)生的ROS，預(yù)防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼發(fā)育遲緩。最近研究發(fā)現(xiàn)，AA具有雙向作用，在有氧微環(huán)境下可通過自氧化反應(yīng)產(chǎn)生去氫抗壞血酸負(fù)離子自由基(A-·)、O2-·和過氧化氫(H2O2)〔9〕，過多攝入AA或機(jī)體處于有氧狀況下可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并引起機(jī)體氧化性損傷〔10,11〕。本研究結(jié)果顯示，AA后處理和預(yù)+后處理對LPS引起母肝、胎肝和胎盤組織脂質(zhì)過氧化的拮抗作用顯著弱于AA預(yù)處理。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，AA后處理和預(yù)+后處理顯著減弱LPS引起IUGR和骨骼發(fā)育遲緩，但對LPS引起IUFD無抑制作用。綜上所述，AA預(yù)處理通過抑制LPS引起的氧化應(yīng)激，預(yù)防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼發(fā)育遲緩；AA后處理和預(yù)+后處理顯著減弱LPS引起IUGR和骨骼發(fā)育遲緩，但對LPS引起IUFD無抑制作用。

【參考文獻(xiàn)】

〔1〕RomeroR,EspinozaJ,Mazorendometrialinfection/inflammationexplainimplantationfailure,spontaneousabortion,andpretermbirthafterinvitrofertilization［J］

.FertilSteril,2004,82:799-804.

〔2〕RiveraDL,OlisterSM,LiuX,et10attenuatesexperimentalfetalgrowthrestrictionanddemise［J］.FASEBJ,1998,12:189-197.

〔3〕ChenYH,XuDX,WangJP,etprotectsagainstlipopolysaccharideinducedintrauterinefetaldeathandgrowthretardationinmice［J］.JPinealRes,2006,40:40-47.

〔4〕XuDX,ChenYH,WangH,etofNacetylcysteineonlipopolysaccharideinducedintrauterinefetaldeathandintrauterinegrowthretardationinmice［J］.ToxicolSci,2005,88:525-533.

〔5〕Griffithofglutathioneandglutathionedisulfideusingglutathionereductaseand2vinylpyridine［J］.AnalBiochem,1980,106:207-212.

〔6〕OhkawaH,OhishiN,Yagiforlipidperoxidationinanimaltissuesbythiobarbituricacidreaction［J］.AnalBiochem,1979,95:351-358.

〔7〕LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,etmeasurementwiththeFolinphenolreagent［J］.JBiolChem,1951,193:265-275.

〔8〕SenGuptaR,SenGuptaE,DhakalBK,etCandvitaminEprotecttherattestesfromcadmiuminducedreactiveoxygenspecies［J］.MolCells,2004,17:132-139.

〔9〕PaoliniM,PozzettiL,PedulliGF,etnatureofprooxidantactivityofvitaminC［J］.LifeSci,1999,64:PL273-278.

〔10〕HarreusU,BaumeisterP,Zieger