基因工程藥物干擾素的制備

基因工程藥物干擾素的制備第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日中文名稱：干擾素英文名稱：interferon;IFN定義1：細胞因子中的一個家族，以干擾病毒復制而得名。根據(jù)產(chǎn)生細胞不同可分為α干擾素、β干擾素和γ干擾素三類。應用學科：免疫學（一級學科）；免疫系統(tǒng)（二級學科）；免疫分子（三級學科）定義2：脊椎動物受多種因素(如微生物)誘導產(chǎn)生的一組抗病毒蛋白質(zhì)?？捎绊懠毎倪\動和免疫過程，也可干擾多種病毒的復制而得此名。干擾素有Ⅰ型和Ⅱ型，以及干擾素樣細胞因子，Ⅰ型干擾素有7種：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ，人類沒有IFN-δ和IFN-τ；Ⅱ型僅有IFN-γ。應用學科：生物化學與分子生物學（一級學科）；激素與維生素（二級學科）定義3：抑制病毒在細胞內(nèi)增殖的一類活性蛋白質(zhì)。應用學科：水產(chǎn)學（一級學科）；水產(chǎn)生物病害及防治（二級學科）定義4：因最初發(fā)現(xiàn)某一種病毒感染的細胞能產(chǎn)生一種生物學活性物質(zhì)可干擾另一種病毒的感染和復制而得名。是最早發(fā)現(xiàn)的細胞因子。根據(jù)干擾素產(chǎn)生的來源和結構不同可分為α干擾素、β干擾素和γ干擾素三類。應用學科：細胞生物學（一級學科）；細胞免疫（二級學科）干擾素概述第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。。第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日干擾素發(fā)現(xiàn)發(fā)展歷程干擾素的生產(chǎn)企業(yè)干擾素的藥理作用、臨床應用及不良反應干擾素的制備路線第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日50年前，英國的病毒學家艾力克·伊薩克斯(AlickIsaacs)在流感病毒研究時發(fā)現(xiàn)，在雞胚中注射滅活流感病毒后，雞胚細胞中生成了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)可以反過來“干擾(interfere)”流感病毒的生長，于是就將這種物質(zhì)稱為干擾素(interferon)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它是一個非常重要的細胞因子，不僅具有直接抗病毒作用，更重要的是它還具有免疫增強作用。干擾素獨具的雙重作用讓科學家們興奮不已。顯然它具備了成為攻克乙肝的利器的必要條件。但干擾素的人工合成、工業(yè)化生產(chǎn)乃至最后真正為攻克疾病作出貢獻，又經(jīng)歷了漫長而艱辛的過程。一、干擾素的發(fā)現(xiàn)發(fā)展歷程第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日早期的干擾素是從人體白細胞中通過純化技術提取的，不僅量少，且含有很多雜質(zhì)，導致作用有限。直到70年代中期，隨著生物醫(yī)學的發(fā)展和基因重組技術的出現(xiàn)，科學家們逐漸開始嘗試通過基因重組技術合成干擾素。1978年，瑞士羅氏公司的科學家帕斯特卡(Pestka)成功克隆了干擾素cDNA，為后來干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。1990年，基因重組技術正式應用于干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)，于是今天所說的“普通干擾素”開始批量生產(chǎn)。但是，普通干擾素也給患者和醫(yī)生帶來困擾：它注射后吸收入血過快且從血液中清除過快會導致很大的血藥濃度波動，濃度過高時會導致較為嚴重的不良反應，但濃度過低又會導致病毒重新復制和反彈；此外，一旦注射了普通干擾素，它廣泛分布于全身，腎臟清除率很高，也極易被免疫系統(tǒng)識別其血清半衰期只有2至5小時，必須頻繁注射用藥，因而干擾素的臨床應用受到了很大限制。到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技術的出現(xiàn)使干擾素終于成為人類與乙肝斗爭中的真正利器。2002年，羅氏研究生產(chǎn)的聚乙二醇化干擾素α-2a(派羅欣)正式上市，聚乙二醇與干擾素的結合，大大改善了干擾素的藥物特性，使血藥濃度變得更加穩(wěn)定，同時聚乙二醇分子支鏈對干擾素有效成分的保護作用，大大降低了它的抗原性，血清半衰期大大延長可以每周一次注射用藥臨床療效得以明顯提高，副反應顯著減少。第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日干擾素發(fā)現(xiàn)者AlickIsaacs

1957年，英國醫(yī)生AlickIsaacs在進行流感病毒試驗時，發(fā)現(xiàn)雞胚中注射滅活流感病毒后生成了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)具有“干擾”流感病毒感染的作用，于是Isaacs將這種物質(zhì)稱之為“interferon”，也就是今天我們所說的干擾素。干擾素抗病毒作用機理的發(fā)現(xiàn)者RobertM.Friedman在1966到1971年期間，美國醫(yī)生RobertM.Friedman發(fā)現(xiàn)了干擾素對病毒的抑制作用主要是干擾素干擾了病毒信使RNA功能，而抑制了蛋白的合成。從此，關于干擾素抗病毒的作用機理的深入研究才被逐漸展開。干擾素從實驗室到臨床的重要人物DerekC.Burke美國病毒學專家DerekC.Burke致力于干擾素的生產(chǎn)流程的研究，并在1980年實現(xiàn)了通過人類白細胞進行干擾素量化生產(chǎn)，雖然這種生產(chǎn)方式無法與基因技術出現(xiàn)后的生物工程生產(chǎn)方式相比，但對干擾素從實驗室成功地走向臨床卻是有著非常重要的意義。干擾素免疫調(diào)節(jié)機制的證實者SamuelBaron美國人SamuelBaron與Isaacs的共同研究證實了干擾素在機體免疫系統(tǒng)對抗病毒感染中的起著非常重要的作用，也正是他們的研究為干擾素在臨床的應用提供了更多的證據(jù)，并為干擾素抗病毒的雙重作用機理奠定了基礎。使干擾素的臨床應用成為可能SidneyPestka美國科學家SidneyPestka在羅氏研究院里成功克隆出了干擾素cDNA，為后來干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日上海生物制品研究所北京三元基因工程有限公司長春海伯爾生物技術有限責任公司深圳科興生物工程有限公司哈藥集團生物工程有限公司天津華立達生物工程有限公司沈陽三生制藥有限責任公司安徽安科生物工程(集團)股份有限公司……

二、干擾素生產(chǎn)企業(yè)第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日干擾素在病毒細胞表面與特殊膜受體結合發(fā)揮抗DNA和RNA作用，包括對某些酶的誘導作用，阻止受病毒感染細胞中病毒的復制，抑制這些細胞的繁殖。本品具有免疫調(diào)節(jié)作用，可增強巨噬細胞的吞噬作用，增強淋巴細胞對靶細胞的特殊細胞毒性。1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒都有抑制作用。當病毒感染的恢復期可見干擾素的存在，另一方面用外源性干擾素亦可緩解感染。2.抑制細胞增殖：干擾素抑制細胞分裂的活性有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的活性比正常細胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細胞增殖，或通過宿主機體的免疫防御機制限制腫瘤的生長。3.干擾素對體液免疫、細胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對巨噬細胞及NK細胞也有一定的免疫增強作用。三、干擾素藥理作用第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日干擾素防治感冒干擾素治療非典(SARS)干擾素治療慢性乙肝(CHB)

干擾素治療腫瘤干擾素治療皰疹病毒感染干擾素對狂犬病毒的作用干擾素治療亞急性硬化性全腦炎(SSPF)干擾素治療多發(fā)性硬化(MS)及肌萎縮性側(cè)索硬化……臨床應用第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日1.全身反應：主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。2.骨髓抑制：在用藥中可出現(xiàn)白細胞、血小板和網(wǎng)狀紅細胞減少。3.局部反應：部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24h后即可消退。4.其他：脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過性肝損傷。偶見過敏性休克，用藥前應做過敏試驗。5.呼吸困難、肝功能降低、白細胞減少、過敏反應、轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐升高、全身乏力、脫發(fā)、鼻塞、鼻出血、上皮萎縮、嗜睡甚至癲癇發(fā)作。6.罕見有抑郁、意識障礙、體重減輕、皮疹、禿發(fā)、給藥局部反應、感覺異常、呼吸困難、單純皰疹、眼痛、心動過速、焦慮、瘙癢、鼻出血、咳嗽、高血壓、感覺減退、腹痛、咽炎等。7.心血管系統(tǒng)不良反應特別是心律失常似與原有心血管疾病及以前有心臟毒性的治療有關。劑量大于每天1000萬U時，出現(xiàn)肝功能指標AST、ALT上升，粒細胞和血小板計數(shù)減少，停藥或減量時可迅速恢復。其他尚有白細胞減少和血清肌酐、LDH、堿性磷酸酯酶上升。不良反應第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日處理好各種不良反應，包括必要時減量、對癥處理或終止治療。（1）流感樣癥狀的處理：發(fā)熱時可給予乙酰氨基酚或其他解熱鎮(zhèn)痛藥，干擾素用藥時機掌握在就寢前或者傍晚給藥或休息日給藥；多飲水，吃平衡膳食。（2）頭痛的處理：服用鎮(zhèn)痛藥，盡量避免強光和噪聲，不飲酒、少食富含酷氨酸和苯丙氨酸的食物，限制咖啡因的攝入，保證每日足夠睡眠及充足的水分。（3）發(fā)熱、乏力、肌肉疼痛的處理：干擾素注射前口服對乙棧氨基酚，或其他非處方退熱藥，就寢前或者傍晚給藥，使患者在睡眠中度地發(fā)熱期；冷敷、熱水浸泡或理療、按摩。（4）失眠或興奮的處理：保持良好的睡眠衛(wèi)生習慣，規(guī)律的作息時間，睡前保持放松狀態(tài)，有睡意時才睡覺，限制午睡時間；定期進行鍛煉，限制咖啡因的乙醇的攝入。（5）脫發(fā)的處理：避免用損發(fā)產(chǎn)品、電吹風機、束發(fā)帶和每日洗發(fā)；使用柔和的洗發(fā)劑和護發(fā)劑；避免染發(fā)和燙發(fā)，留短發(fā)或者戴假發(fā)。（6）食欲減退的處理：保持良好的口腔衛(wèi)生，適當?shù)男菹⒑湾憻挘簧倭慷嗖?，多食水果、蔬菜。?）注射局部反應的處理：注射前冰敷注射部位至產(chǎn)生麻木感；注射部位消毒，待乙醇干燥后再注射；藥物達到室溫后注射，以45°~90°進針；不要搓揉注射部位；交替部位注射。（8）抑郁癥的處理：治前評估心理健康穩(wěn)定性，預測治療期間癥狀的強度，根據(jù)抑郁的嚴重程度，調(diào)整干擾素劑量或停止治療，需要時可以酌情給予抗抑郁藥。（9）甲亢的處理：暫停干擾素治療，適當給予甲亢藥物治療，疾病穩(wěn)定后可謹慎繼續(xù)治療。如何應對干擾素的不良反應第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市存在問題：產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞，來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性四、干擾素的制備路線干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：細胞培養(yǎng)，分泌表達缺點：產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）?上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆?表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結構和生物活性?工藝特點：發(fā)酵周期短（幾個小時），無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過程：淘汰抗體親和層析干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期日我們生活的環(huán)境是被微生物包圍著的，時時刻刻都要接觸到許多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少?？茖W家猜測，人的血液細胞里本身就存在干擾素。后來研究證明，這種猜測是有道理的，通過精密的血液分析，在人和許多動物的細胞中都