乳酸菌的耐藥檢測方案

試驗方案：一、 樣品的取樣在青島膠州市的正規(guī)超市購買5種酸奶，進行實驗時均處于產(chǎn)品保質期內(nèi)。對這幾種樣品分別進行取樣。二、 樣品的稀釋在無菌工作臺上用滅菌過的移液管直接從酸奶樣品中吸取1mL裝入9ml無菌生理鹽水試管中，快速震蕩試管，，使其呈1:10的均勻稀釋液，同法繼續(xù)稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度，選取合適的三個稀釋度（如：10-1、10-2、10-3）按此操作依次制備成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的樣品稀釋液。三、 樣品的分離鑒定1、 分別用移液槍吸取A-E的樣品稀釋液250mL置于MRS固體培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫801mL，MgSO4-7H2O0.58g，MnSO4-4H2O0.25g，（瓊脂15?20g），蒸餾水1000mL）平板上，涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)結果及細菌的生長情況。用接種環(huán)在各平板上挑取出現(xiàn)不同菌落形態(tài)大小的單一黃色菌落，分別在平板上劃線，37C倒置培養(yǎng)24h。2、 根據(jù)菌落的大小、顏色、光澤和透明程度等，從培養(yǎng)24h的每個平板中選取單菌落，在MRS固體平板上反復劃線純化，反復進行此操作步驟以使最終培養(yǎng)出的每個菌落都為單一菌種菌落，37C培養(yǎng)24h。然后依次進行菌體形態(tài)觀察、過氧化氫酶試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、乙酰甲基甲醇試驗、產(chǎn)氣試驗、碳水化合物發(fā)酵試驗、乳酸定性檢測。（1） 菌體形態(tài)的觀察將劃線平板上培養(yǎng)了24h的各菌株在載玻片上涂片及固定后，進行革蘭氏染色。先用草酸銨結晶紫初染色，1分鐘后水洗載玻片，然后碘液媒染1分鐘，水洗、吸干。95%乙醇脫色直到滴加的酒精不出現(xiàn)紫色，接著水洗、吸干。最后用0.5%的番紅染色液再染色10-30秒，水洗，干燥，置于光學顯微鏡下觀察其形態(tài)特點及染色結果。選取油鏡觀察細胞呈桿狀或球狀，革蘭氏陽性菌。（2） 過氧化氫酶測定實驗取一環(huán)接種的培養(yǎng)物，涂于干凈的載玻片上，然后在其上滴加過氧化氫，有氣泡則為陽性反應，無氣泡為陰性反應。（3）淀粉水解試驗將固體淀粉培養(yǎng)基融化后冷卻至50°C左右，無菌操作制成5個平板，將劃線平板上培養(yǎng)了24h的各菌株分別在不同平板上劃線接種。將平板倒置37C恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察各種菌的生長狀況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱，即產(chǎn)生細胞外淀粉酶活力的高低。需要的試劑：H2SO4、HCl、MRS固體培養(yǎng)基（蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫801mL，MgSO4?7H2O0.58g，MnSO4?4H2O0.25g，（瓊脂15?20g），蒸餾水1000mL）盧戈氏碘液（碘5g碘化鉀10g蒸餾水加至100ml）需要的儀器：恒溫箱（4）明膠液化試驗將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22C培養(yǎng)7d，逐日觀察結果。若用35C孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察結果前，先置4C冰箱內(nèi)30min，再看結果。結果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。需要的試劑：明膠培養(yǎng)基（NaCl5g，蛋白月東10g，牛肉膏3g，明膠120g，蒸餾水1000mL 在水浴鍋中將上述成分溶化，不斷攪拌。溶化后調pH7.2~7.4，121°C滅菌30min。）需要的儀器：電磁爐恒溫箱（5）乙酰甲基甲醇試驗用接種針將劃線平板上培養(yǎng)了24h的各菌株分別穿刺接入5支葡萄糖蛋白東水培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)58h。在試管培養(yǎng)液中直接加入10~20滴的40%KOH和5%a-萘酚乙醇溶液，用力振蕩。結果：如果出現(xiàn)紅色，則為陽性；若仍呈黃色，則為陰性。需要的試劑：蛋白東水培養(yǎng)基（氯化鈉0.5克，蛋白東1克，水加至100ml）40%KOH5%a-萘酚乙醇溶液）需要的儀器：電磁爐恒溫箱（6） 產(chǎn)氣試驗用記號筆在各支試管外壁上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 6支，分別接入劃線平板上培養(yǎng)了24h的各菌株，第六支不接種，作為對照。接種后，輕輕搖動試管使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。將接種過的 6支試管均置于37°C培養(yǎng)基中培養(yǎng)24?48h。觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。結果：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結果為陰性。表明該菌不能利用該種糖，記錄用“一”表示：如培養(yǎng)液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應，表明該菌能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用（+）表示：如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應，記錄用（一）表示。需要的試劑：乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（其中含有哪些成分，需要用到的試劑？）需要的儀器：杜氏小管恒溫箱（7） 碳水化合物發(fā)酵試驗用記號筆在各支試管外壁上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基6支，分別接入劃線平板上培養(yǎng)了24h的各菌株，第六支不接種，作為對照。接種后，輕輕搖動試管使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。將接種過的 6支試管均置于37C培養(yǎng)基中培養(yǎng)24?48h。觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。結果：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結果為陰性表明該菌不能利用該種糖，記錄用“一”表示：如培養(yǎng)液呈黃色，反應結果為陽性，表明該均能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應，表明該菌能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用（+）表示：如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應，記錄用（一）表示。需要的試劑：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基（其中含有哪些成分，需要用到的試劑？）需要的儀器：杜氏小管恒溫箱（8） 乳酸定性檢測部分用10%的硫酸1毫升，2%的高錳酸鉀1毫升在10毫升發(fā)酵液中先將乳酸轉化成乙醛，再以硝酸銀溶液浸濕濾紙搭于試管口，加熱試管中的發(fā)酵液，如果發(fā)酵液中有乳酸，與硫酸和高錳酸鉀反應生成的乙醛在加熱時就會揮發(fā)，在管口處遇硝酸銀就會使試紙變黑。三、 乳酸菌的藥敏性實驗利用紙片擴散法對分離自市售泡菜的乳酸菌進行10種左右抗生素包括卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、青霉素、四環(huán)素、氯霉素、頭孢唑林等的藥敏試驗。具體操作方法：將鑒定出的乳酸菌分別在MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，用生理鹽水校正菌液濃度至與0.5麥氏比濁管相同。用移液器吸取稀釋好的菌液1ml，注入已滅菌的培養(yǎng)平皿中央位置，然后傾注15ml40-5O°C左右的或MRS固體培養(yǎng)基，充分搖勻。待培養(yǎng)基凝固后貼上藥敏紙片，用無菌鑷子壓一下紙片使其與培養(yǎng)某表面貼牢。每個100mm平板貼3-4張，紙片與其中心距離不得少于30mm，紙片中心與平皿壁間距不得少于15mm，標記抗生素名稱。經(jīng)37C培養(yǎng)后，用卡尺從平皿背面測量抑菌圈直徑，記錄結果。抑菌環(huán)內(nèi)有任何生長都判斷為耐藥。附：麥氏比濁管配制方法：麥氏比濁管是McFarland發(fā)明的一種用于微生物比濁的不同濁度的標準濁度管。具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的，有表可查的.這樣不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值.做藥物敏感實驗采用MIC法，所需細菌濃度要稀釋成0.5麥氏管，其菌液濃度為1.5x108個/ml。配法舉例：麥氏濁度標準(0.5號)將0.5mL0.048mol/L的BaCL2(1.175%w/vBaCL2-2H2O)加到99.5mL0.18mol/L(0.36N)的H2SO4(1%v/v)中并不斷攪動以維持混懸狀態(tài)。按每管4-6mL將硫酸鋇懸液分裝于帶懸蓋的管子中，管子尺寸應與培養(yǎng)或稀釋接種菌所用的管子一致。這些管子應密封并貯存于室溫避光處。每次使用前，應將濁度標準管置于旋轉混勻器上劇烈振動，目測其外觀濁度應均勻一致。若有大顆粒