第三章高效液相色譜

第三章高效液相色譜1第一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點(diǎn)二、流程及主要部件三、固定相和流動(dòng)相四、主要分離類型五、影響分離的因素第二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四以液體作為流動(dòng)相的色譜過(guò)程HPLC定義第三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四高效液相色譜法的特點(diǎn)高壓

---150~350x105Pa高效---3萬(wàn)塔板/米高靈敏度---10-9~10-11g高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法第四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四

GCHPLC流動(dòng)相惰性氣體（無(wú)親和性，只起運(yùn)載作用）氣體、沸點(diǎn)較低的化合物不同極性的液體（有一定親和作用）溫度較高一般室溫分析對(duì)象高沸點(diǎn)、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子化合物GC與HPLC比較第五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四（一）分配色譜（二）吸附色譜（三）離子交換色譜法（四）排阻色譜法高效液相色譜法的類型第六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四分配色譜液液分配色譜(LLPC)鍵合固定相分配色譜(LSPC)

分配色譜法(PartitionChromatography)液體固定相通過(guò)物理吸附固定于載體表面有機(jī)分子通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面第七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四分配色譜–分離原理不同組分在兩相間分配系數(shù)不同第八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四固定相

---物理吸附（擔(dān)體+固定液）全多孔型擔(dān)體薄殼型微珠擔(dān)體分配色譜固定相固定相

---化學(xué)鍵合R---極性基團(tuán)疏水基團(tuán)離子交換基團(tuán)第九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四固定相的化學(xué)構(gòu)造非鍵合相表面鍵合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN第十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四正相HPLC（normalphaseHPLC）：

是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：

由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。ODS（OctaDecyltrichloroSilane)第十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四正相分配色譜反相分配色譜固定相性質(zhì)極性非極性鍵合基團(tuán)

極性基團(tuán)疏水基團(tuán)流動(dòng)相性質(zhì)非極性極性出峰順序極性小先出極性大先出第十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四吸附色譜法分離原理溶質(zhì)與流動(dòng)相分子在吸附劑表面上的吸附競(jìng)爭(zhēng)第十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四吸附色譜固定相

以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。第十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。

各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。分離原理固定相分離對(duì)象離子或可離解的化合物（無(wú)機(jī)離子、氨基酸、蛋白質(zhì)等）第十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四分離原理根據(jù)樣品分子尺寸大小分離

大分子不能進(jìn)入多孔中，不被保留，隨Vm流出中分子部分進(jìn)入多孔中，一般保留小分子完全進(jìn)入多孔中，長(zhǎng)時(shí)間保留。排阻色譜法

(凝膠色譜法)第十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四1.軟凝膠：鉸鏈葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝膠。（凝膠過(guò)濾色譜）2.半硬凝膠：聚苯乙烯珠（凝膠滲透色譜）高硬凝膠和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，經(jīng)化學(xué)鍵合處理，不隨壓力及溶劑改變尺寸，（高效排阻色譜）

排阻色譜固定相第十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四高分子化合物分子量及分子量分布DNA碎片不同堿基支鏈分離。應(yīng)用第十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四流動(dòng)液貯存提供脫氣輸液泵進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)控制與記錄系統(tǒng)

高效液相色譜儀第十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四日本島津公司第二十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四美國(guó)Waters公司第二十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四（1）真空泵抽濾系統(tǒng)（2）低溶性惰性氣體導(dǎo)入替換（3）超聲脫氣（4）在線脫氣流動(dòng)相脫氣方法第二十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四輸液系統(tǒng)高壓輸液泵：高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

活塞泵注射泵氣動(dòng)泵第二十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四進(jìn)樣系統(tǒng)不使整個(gè)壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱，通常使用所謂六通閥第二十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四色譜柱色譜柱泵泵12進(jìn)樣

不使整個(gè)壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱，通常使用所謂六通閥進(jìn)樣系統(tǒng)第二十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四色譜柱色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。第二十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四檢測(cè)器

用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器第二十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四單波長(zhǎng)UV檢測(cè)器，光源用Hg燈，加濾光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。多波長(zhǎng)光度計(jì)類似，光柵或棱鏡分光A＝lg（I0/It)=εbc紫外-可見檢測(cè)器第二十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四熒光檢測(cè)器 許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、被一定強(qiáng)度和波長(zhǎng)的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的熒光。但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測(cè)。

特點(diǎn)：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高23個(gè)數(shù)量級(jí)，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。第二十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四熒光檢測(cè)器結(jié)構(gòu)示意圖光源檢測(cè)器濾光片檢測(cè)室第三十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。第三十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四電化學(xué)檢測(cè)器（以電導(dǎo)檢測(cè)器為例）電導(dǎo)儀電極電極第三十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四標(biāo)準(zhǔn)樣品法譜庫(kù)

HPLC-FTIRHPLC-MS定性分析定量分析峰面積∝濃度或質(zhì)量第三十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四小結(jié)四種色譜分離模式的分離機(jī)理及應(yīng)用范圍反相色譜的概念紫外可見檢測(cè)器常用的固定相和流動(dòng)相第三十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四高效液相色譜應(yīng)用實(shí)例第三十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四

柱后pH調(diào)節(jié)電導(dǎo)檢測(cè)對(duì)有機(jī)酸具有高選擇性和高靈敏度第三十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四有機(jī)酸分析系統(tǒng)流程圖2348756

9101

1、2泵3進(jìn)樣器4柱溫箱5電導(dǎo)檢測(cè)器6數(shù)據(jù)處理機(jī)7混合室8柱子9流動(dòng)相10緩沖液第三十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四分析條件分離條件

色譜柱：Shim-packSCR-102H(8mmI.D．×300mmL.)1個(gè)或2個(gè)分析柱連接

保護(hù)柱SCR-102H(6mmI.D.×50mmL.)流動(dòng)相：5mMp-甲苯亞磺酸水溶液流量：0.8mL/min溫度：40℃或45℃檢測(cè)條件緩沖液：20mMBis-tris水溶液

含

5mMp-甲苯亞磺酸和100μＭEDTA流量：0.8mL/min檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器

polarity;+第三十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四樣品的分析實(shí)例食品啤酒，清酒，葡萄酒，醬油等體液血清，尿等醫(yī)藥品腎的透析液，鈣制劑等發(fā)酵微生物培養(yǎng)液，酸奶等環(huán)境工廠廢水等第三十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖1一個(gè)分析柱

1.磷酸

2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸第四十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四啤酒的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸10.碳酸前處理振蕩除去碳酸氣后，過(guò)濾10μＬ進(jìn)樣第四十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四清酒的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.乙酸8.焦谷氨酸前處理過(guò)濾后，進(jìn)樣10μＬmin.第四十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四葡萄酒的色譜圖

1.磷酸

2.檸檬酸3.酒石酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸前處理用水稀釋10倍后過(guò)濾進(jìn)樣量10μＬ

min.第四十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四

醬油的色譜圖

1.磷酸

2.檸酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸前處理用水稀釋10倍后過(guò)濾進(jìn)樣量10μＬ第四十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四血清的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸7.焦谷氨酸8.未知物前處理加高氯酸用離心法去沉淀物，取上清液5uL進(jìn)樣第四十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四尿樣的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.乳酸4.甲酸5.未知物6.焦谷氨酸7未知物前處理過(guò)濾后，進(jìn)樣10μＬ第四十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四酸奶的色譜圖

1.磷酸

2.檸檬酸3.琥珀酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸前處理用水稀釋10倍后過(guò)濾進(jìn)樣量10μＬ第四十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四工廠廢水的色譜圖

1.甲酸2.乙酸3.丙酸4.碳酸5.丁酸6.戊酸前處理過(guò)濾后，進(jìn)樣10μＬ第四十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四食品安全是所有國(guó)家的每個(gè)消費(fèi)者關(guān)心的基本問(wèn)題。殘留農(nóng)藥和獸藥是食品中主要的污染物世界上許多國(guó)家制定并實(shí)施食品安全法規(guī)，但是在美國(guó)、加拿大、歐盟以及日本食品安全法規(guī)更加嚴(yán)格的完善。在食品和農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中，殘留農(nóng)藥和獸藥的檢測(cè)中非?？量痰摹Ｊ称钒踩c污染物

第四十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四農(nóng)產(chǎn)品 -谷物：大米等 -豆類：大豆、豌豆等。 -水果：橘柑，蘋果，葡萄等。 -蔬菜：洋白菜（甘藍(lán)）、菠菜等 -茶葉，種子，蜂蜜等。食品中殘留檢測(cè)

審查農(nóng)藥殘留家畜及水產(chǎn)品 -牛肉，豬肉等 -雞肉、鵪鶉等 -魚類：黃尾魚、虹鱒魚，大馬哈魚等 -蝦，對(duì)蝦審查獸藥殘留第五十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四全世界使用的農(nóng)藥超過(guò)700種：殺蟲劑，除草劑，殺菌劑，脫葉劑，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。殘留：殘存在農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥（降解緩慢）及其代謝物由以下原因所致：-使用更穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)作農(nóng)藥。-農(nóng)藥的過(guò)度使用以及不合理使用。最大殘留限量(MRL)：食品安全的指標(biāo)，通常MRL≤0.01-0.05mg/kg(ppm)食品中的農(nóng)藥殘留第五十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四農(nóng)藥的殘留（1）有機(jī)氯化物：

硫丹、莢蟥醚、克菌丹、抑菌靈、乙酯殺螨醇、溴螨酯、六六六、滴滴涕、異狄氏劑、敵菌丹、狄氏劑、六氯苯、七氯有機(jī)磷化物：

苯硫磷，乙硫磷，滅線磷，乙嘧硫磷，硫線磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒蟲畏，蔬果磷，敵敵畏，樂果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，殺螟硫磷，豐索磷，倍硫磷，稻豐散，丙硫磷，仗殺硫磷，馬拉硫磷，殺撲磷，異稻瘟凈，敵瘟磷，甲基立枯磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，對(duì)硫磷，甲基對(duì)硫磷，甲拌磷第五十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四氨基甲酸酯：

滅除威，異滅威，甲萘威，滅殺威，抗蚜威，仲丁威，殘殺威，惡蟲威，速滅威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹擬除蟲菊酯

氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯含氮化合物：

甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，惡霜靈，滅螨猛，三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙環(huán)唑，聯(lián)苯三唑醇，滅銹胺，滅草靈，莠去津，雙苯酸草胺，敵稗，二甲戊靈，氟樂靈，多效唑。農(nóng)藥的殘留（2）第五十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四在過(guò)去幾年中，相關(guān)法規(guī)已完成或修訂，控制程度更加嚴(yán)格。在歐盟和美國(guó)已建立起完整的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)（參考實(shí)驗(yàn)室；參考材料及標(biāo)準(zhǔn)；計(jì)算機(jī)監(jiān)視小組等）在樣品凈化，色譜分離和檢測(cè)中使用改進(jìn)的和新的分析技術(shù)及方法，如GC/MS和LC/MS，就會(huì)產(chǎn)生更靈敏，更準(zhǔn)確和更可靠的結(jié)果。公眾比以前更加關(guān)注食品安全。歐盟和美國(guó)現(xiàn)在的形勢(shì)第五十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四

滅除威，異滅威，甲萘威，滅殺威，抗蚜威，仲丁威，殘殺威，惡蟲威，克百威

(呋喃丹),速滅威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹

氨基甲酸酯類農(nóng)藥第五十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四丁醛肟威草肟威呋喃丹CPMC殘殺威（PHC，Arprocarb）苯噁威

二甲殺威（MPMC）乙硫甲威滅定威甲萘威（NAC）XMC苯氧丁威（BPMC）甲硫威（Mercaptodimethur）異丙威（MIPC）乙肟威甲氧威（MTMC）氨基甲酸酯類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)第五十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四N-甲基氨基甲酸酯的HPLC分析方法流程圖

1、脫氣裝置10、反應(yīng)試劑輸液機(jī)構(gòu)2、低壓梯度裝置11、混合裝置3、流動(dòng)相輸液機(jī)構(gòu)12、熒光檢測(cè)器4、梯度混合器13、阻尼盤管5、自動(dòng)進(jìn)樣器14、反應(yīng)盤管6、柱溫箱15、反應(yīng)盤管7、分析柱M1，M2：流動(dòng)相8、化學(xué)反應(yīng)箱R1，R2：反應(yīng)試劑液9、脫氣裝置第五十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四N-甲基氨基甲酸酯的HPLC分析方法

N-氨基甲酸甲酯類農(nóng)藥的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)式它們的化合物在堿的條件下加水分解生成甲胺。這里生成的甲胺與一級(jí)胺的熒化衍生化試劑O-苯二甲醛（OPA）反應(yīng)，可進(jìn)行較高靈敏度的熒光檢測(cè)。第五十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四氨基甲酸酯前處理過(guò)程第五十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四8成分的N-氨基甲酸甲酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)試樣同時(shí)分析的色譜圖

1994年6月9日官報(bào)上登載的成分的分析例

第六十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四16成分的N-氨基甲酸甲酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)試樣同時(shí)分析的色譜圖第六十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四甲硫威及其代謝物甲硫威代謝物高靈敏度分析例

（例如在橘子汁中不得含50ppb以上）

甲硫威的檢測(cè)限（S/N=3）為2ppb

第六十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四離子色譜離子色譜過(guò)渡金屬分析系統(tǒng)CN-離子分析系統(tǒng)第六十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四氨基酸分析系統(tǒng)

第六十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四氨基酸分析系統(tǒng)

NH2

RCCOOH