鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT

鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT-PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨肝炎病毒1型（DHV-1）和鴨肝炎病毒3型（DHV-3）雙重RT-PCR檢測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨病變肝組織、接種疑似病料的鴨胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物中DHV-1型和/或DHV-3型核酸的檢測。2縮略語下列縮略語適用于本文件。DHV：鴨肝炎炎病毒（duckhepatitisvirus）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸緩沖液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液（trisacetate-EDTAbuffer）EB：溴化乙錠（ethidiumbromide）3主要儀器3.1PCR擴(kuò)增儀。3.2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（最大離心力12000g以上）。3.3電泳儀。3.4凝膠成像系統(tǒng)。3.5冰箱（-20℃；-80℃）。3.6微波爐。3.7分析天平（準(zhǔn)確度0.01g以上）。3.8水浴鍋。3.9微量移液器（2.5μL；10μL；200μL；1000μL）。4試劑和材料4.1RNA抽提試劑：Trizol或其他商品化RNA提取試劑。4.2氯仿、異丙醇、無水乙醇。4.3M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。4.4RNA酶抑制劑。4.5DEPC處理的滅菌水。4.6TaqDNA聚合酶。4.7dNTP。4.8DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）。4.9RT-PCR反應(yīng)試劑。4.10EB（10μg/μL）或核酸染料。4.11磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），見附錄A中的A.1。4.1250×TAE電泳緩沖液，見附錄A中的A.2。4.131%X脂糖凝膠，見附錄A中的A.3。4.14引物：DHV-1擴(kuò)增上游引物，5’-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3’，下游引物，5’-TTCAATTTCCAGATTGAGTTCAAA-3’；DHV-3擴(kuò)增上游引物，5’-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3’，下游引物，5’-ACGAACCAGCCATTGACG-3’，引物濃度均為10pmol/μL。4.15陽性對(duì)照樣品：DHV-1和DHV-3鴨胚接種尿囊液毒；陰性對(duì)照樣品：正常鴨胚尿囊液。5樣品的采集及處理5.1采樣工具15mL離心管、1.5mL離心管、剪刀、鑷子和研缽，經(jīng)121（±2）℃，15min高壓滅菌并烘干。5.2采樣方法5.2.1鴨病變肝組織采取病死或剖殺鴨的肝組織1g左右，按1:5倍體積加入PBS，研磨凍融3次，裝入15mL滅菌離心管中，8000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2鴨胚尿囊液和細(xì)胞培養(yǎng)物鴨胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?RT-PCR檢測6.1RNA提取6.1.1用Trizol或其他商品化RNA提取試劑提取待測樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照樣品的RNA。6.1.2200μL的樣品和800μLTrizol置于一個(gè)1.5mL離心管，反復(fù)顛倒混勻，室溫靜置5min。6.1.312000g4℃離心5min，吸取上清液移入新的離心管中，加入200μL氯仿，用手劇烈振蕩15s，室溫靜置5min。6.1.412000g4℃離心15min，吸取上清液移入新的離心管中（注意不要吸出中間層），加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min。6.1.512000g4℃離心10min，小心棄去上清液，加入75%乙醇1mL（DEPC水配制）。6.1.612000g4℃離心5min，棄去乙醇，室溫干燥2~5min，加入適量DEPC水，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2反轉(zhuǎn)錄6.2.1在PCR反應(yīng)管中依次加入：OligodTPrimer1μL，dNTPs（10mM）1μL，檢測樣品RNA3μL，DEPC水6μL。6.2.2水浴鍋或PCR儀中，65℃作用5min，冰上急冷2min。6.2.3在上述反應(yīng)管中再依次加入：5×RTBuffer4μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，DEPC水3.5μL。6.2.4PCR儀中，42℃作用60min，再70℃作用15min，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3PCR反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2.5μL，DHV-1和DHV-3上游引物各1μL，DHV-1和DHV-3下游引物各1μL，dNTPs（2.5mml/L）2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，滅菌去離子水11.25μL。6.4PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min后；94℃1min，52℃50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。6.5電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL與2μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1%X脂糖凝膠板加樣孔中，X脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DNAMarker=3\*ROMAN，緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳30min左右。7結(jié)果判定XX性對(duì)照在預(yù)期大小的位置720bp和642bp出現(xiàn)特異性條帶，陰性對(duì)照均未出現(xiàn)預(yù)期大小目的條帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品在720bp位置出現(xiàn)特異性條帶為DHV-1核酸陽性，被檢樣品在642bp位置出現(xiàn)特異性條帶為DHV-3核酸陽性。_________________________________附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制A.10.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.6g，先加適量滅菌去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）27.6g，先加適量滅菌去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液36mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液14mL，稱取氯化鈉8.5g，加滅菌去離子水800mL，調(diào)pH值至7.2，最后定容至1000mL，4℃保存。A.2電泳緩沖液（50倍）A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉（分析純）調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE電泳緩沖液（50×）羥基甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）242g冰乙酸（分析純）57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）