醫(yī)學(xué)IF克隆技術(shù)介紹課件

IF克隆技術(shù)介紹基因克隆背景簡介June21,20232

TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點：連接效率低耗時較長需要特定限制性酶切位點In-Fusion克隆產(chǎn)品June21,20233

Clontech專利In-Fusion?HDCloningSystem任意載體任意基因片段這是一款讓您隨心所欲地實現(xiàn)基因定向克隆的產(chǎn)品！In-Fusion?基因克隆特點4

主要內(nèi)容June21,20235

2In-Fusion?優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理June21,20236

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理In-Fusion?基因克隆技術(shù)原理示意圖In-Fusion專利酶Clontech專利In-Fusion是一種快速、簡單、高效的基因克隆技術(shù)！50℃，15min單管反應(yīng)7

June21,20238

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理In-Fusion?克隆技術(shù)的優(yōu)點June21,20239

不附加任何多余序列2不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制3可同時克隆兩個或多個DNA片段41簡便、快速、高效的克隆技術(shù)簡便、快速、高效的克隆技術(shù)June21,202310

快速！June21,202311

In-FusionHD無論是克隆長基因片段還是克隆多個基因片段都能保持較高的克隆效率。

高效！簡便、快速、高效的克隆技術(shù)不附加任何多余序列June21,202312

線性化載體任意載體克隆位點目的DNA片段不需要的堿基序列引物設(shè)計PCR擴增與載體相同的15個堿基序列In-Fusion連接反應(yīng)15min

不附加任何多余序列的重組載體無縫克?。翰桓郊尤魏味嘤嘈蛄蠥BC不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制June21,202313

In-Fusion克隆不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制:在cDNA序列中插入內(nèi)含子,熒光蛋白基因在cDNA序列添加UTRs

轉(zhuǎn)換純化標簽例如Myc

轉(zhuǎn)換為His

缺失蛋白表達區(qū)域…表達載體選擇插入位點PCR擴增純化目的DNA片段混合In-FusionIn-Fusion引物設(shè)計PCR擴增重組載體可同時克隆兩個或多個DNA片段June21,202314

Step2:目的DNA片段擴增Step3:一次In-Fusion連接反應(yīng)Step1:制備線性化載體片段1片段2片段3線性化載體重組載體克服傳統(tǒng)克隆技術(shù)的限制June21,202315

克服其它克隆技術(shù)的限制其它克隆技術(shù)的限制In-Fusion解決方案載體的限制不同克隆試劑盒都需要與之匹配的載體必須使用提供的載體只要載體末端和插入片段末端具有15個同源堿基，In-Fusion就可以將任意PCR片段插入任意線性化載體中。必須進行限制性內(nèi)切酶酶切和連接需要獨一無二、兼容的酶切位點極少的合適酶切位點In-Fusion不受限制性酶切位點的限制，因此在目的片段及使用的載體中是否存在合適的酶切位點并不妨礙克隆。亞克隆繁瑣多片段不能同時克隆In-Fusion能夠在一次反應(yīng)中同時克隆多個片段，無需進行亞克隆。對于大片段克隆效率較低對于插入片段有限制In-Fusion系統(tǒng)能夠高效克隆0.05-15kb

DNA片段。非定向克隆需要篩選目的片段插入方向正確的克隆In-Fusion是基因定向克隆技術(shù)，因此無需進行目的基因片段正確插入的克隆的篩選。會附加多余堿基序列In-Fusion是無縫克?。翰桓郊尤魏味嘤鄩A基序列。不適合中型和大規(guī)?？寺」こ蘄n-Fusion技術(shù)已經(jīng)成功用于多項高通量克隆工程。In-Fusion?克隆技術(shù)的應(yīng)用June21,202316

應(yīng)用多片段克隆構(gòu)建載體模型插入突變位點高通量克隆June21,202317

應(yīng)用實例實例：多個DNA片段（1kb,2kb,3kb)同時克隆【方法】使用TaKaRa高品質(zhì)PCR酶分別擴增1kb、2kb、3kb的目的DNA片段

和2.7kb的載體，并將擴增產(chǎn)物混合，使用In-Fusion?HD試劑盒完成克隆。利用高效率的感受態(tài)細胞StellarTMCompetentCells（產(chǎn)品編

號：636763）轉(zhuǎn)化并進行藍/白斑篩選。引物設(shè)計及目的基因片段擴增June21,202318

引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個堿基序列引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列載體線性化June21,202319

PCR擴增酶切處理In-Fusion連接反應(yīng)June21,202320

In-Fusion專利酶線性化載體目的基因片段反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化In-Fusion連接反應(yīng)50℃15min【結(jié)果】CloningEnhancer處理，37℃15min，80℃15min引物設(shè)計原則引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個堿基序列引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列June21,202321

引物設(shè)計原則June21,202322

引物設(shè)計網(wǎng)絡(luò)工具June21,202323

/infusion在線支持工具June21,202324

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理產(chǎn)品列表June21,202325

基礎(chǔ)款相關(guān)產(chǎn)品June21,202326

5XIn-FusionHDEnzymePremixpUC19ControlVector,linearized(50ng/μl)2kbControlInsert(40ng/μl)In-Fusion?HDCloningKit（639648/49/50)組分附帶CloningEnhancer的相關(guān)產(chǎn)品June21,202327

CloningEnhancer的作用：消除PCR反應(yīng)液中的引物二聚體和dNTP等的影響無需對PCR產(chǎn)物進行膠純化操作簡單In-Fusion?HDCloningKitw/CloningEnhancer(639633/34/35)June21,202328

Upto5XHigherEfficiency未經(jīng)處理CloningEnhancer處理CloningEnhancer的實用例June21,202329

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點及應(yīng)用實例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見問答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理In-FusionKit常見問答June21,202330

Q1.如何選擇PCR酶？A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人員進行克隆表達的實驗較多，我們推薦使用高保真的PCR酶。Q2.載體和插入的DNA片段末端結(jié)構(gòu)有限制嗎？A2.沒有特別的限制。無論是平滑末端、粘性末端或者末端有無A尾均可

進行有效的連接反應(yīng)。Q3.載體和插入的DNA片段的長度有限制嗎？A3.沒有特別的限制。載體和插入的DNA片段即使超過10kb也可以進

行連接反應(yīng)，只是連接效率會有所降低。插入的DNA片段只要不少

于50bp就可進行有效的連接反應(yīng)。Q4.線性化載體末端是否需要進行去磷酸化處理？A4.線性化載體末端磷酸基團的存在與否不會影響In-Fusion連接效率。

因