第二章種子擴大培養(yǎng)

第二章種子擴大培養(yǎng)第一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

菌種擴大培養(yǎng)的目的

為發(fā)酵罐的投料提供足夠數(shù)量的代謝旺盛的種子。因為發(fā)酵時間的長短和接種量的大小有關，接種量大，發(fā)酵時間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機會。

對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢及生產(chǎn)的規(guī)模決定種子擴大培養(yǎng)的級數(shù)。第二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

二. 種子擴大培養(yǎng)(制備)階段

實驗室種子的制備：生產(chǎn)車間種子制備:

A

實驗室種子的制備：

e.g產(chǎn)黃青霉菌(P.chrysogonum)原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。第三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

對于不產(chǎn)孢子的赤霉素生產(chǎn)菌（Gibberellinefujikuroi），也可用大米固體培養(yǎng)基在茄子瓶中培養(yǎng)菌絲體，用作種子罐種子。產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S．griseus），產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S．kanamyceticu），可以用搖瓶液體培養(yǎng)法，孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖床上培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。不產(chǎn)孢子的細菌，如生產(chǎn)谷氨酸的棒狀桿菌（Corynebacterium）、短桿菌（Brevibacterium），生產(chǎn)上一般采用斜面營養(yǎng)細胞進行擴培，再轉(zhuǎn)入液體搖瓶培養(yǎng)，獲得細胞懸液再接種。第四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生產(chǎn)菌）原始菌種（出發(fā)菌種）固體試管斜面（32°C，18~24小時）

三角瓶培養(yǎng)（搖床）(flaskculture)

種子罐培養(yǎng)e.g.yeast：原始菌種（出發(fā)菌種）10ml麥汁試管250ml三角瓶培養(yǎng)（27°C~28°C，3天）（25°C，2天）5~10L卡氏罐（15°C~20°C，3~5天）第五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四B：生產(chǎn)車間種子制備：種子罐的作用：使有限數(shù)量的孢子(菌體)發(fā)芽、生長、并繁殖成大量的菌絲體(菌體)，滿足發(fā)酵罐的需要（菌體生長和產(chǎn)物形成）。實驗室種子進入種子罐有孢子進罐法和搖瓶菌種進罐法。

種子罐級數(shù)的確定：種子罐級數(shù)是指制備種子逐級擴培的次數(shù)。依據(jù)：菌種生長特性，孢子發(fā)芽及菌體繁殖的速度以及所用的發(fā)酵罐的容積。種子罐(seedingtank)的級數(shù)產(chǎn)物的品種生產(chǎn)規(guī)模工藝條件第六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四種子罐級數(shù)越少越好，原因：簡化生產(chǎn)工藝和控制減少接種帶來的染菌機會需考慮：盡量延長發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時間，縮短由于種子發(fā)芽、生產(chǎn)而占用的非生產(chǎn)時間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率［產(chǎn)物／ml·h］。e.g.Glutamatefermentation一級種子擴培實驗室種子種子罐發(fā)酵罐e.g.penicillinfermentation二級種子擴培實驗室種子一級種子罐二級種子罐發(fā)酵罐e.g.Streptomycin

fermentation三級種子擴培實驗室種子一級種子罐二級種子罐三級種子罐發(fā)酵罐

(Streptomycesgriseus)－－灰色鏈霉菌第七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

種齡與接種量：種齡(seedage)指種子罐培養(yǎng)種子從開始至結(jié)束的培養(yǎng)時間。在種子罐中，培養(yǎng)時間延長－－菌體量增加－－基質(zhì)消耗及代謝產(chǎn)物積累－－菌體量不再增加－－老化過老：生產(chǎn)能力下降，菌體自溶。過嫩：前期生長緩慢，發(fā)酵周期延長，產(chǎn)物形成時間推遲，甚至造成異常發(fā)酵。適宜時間：以菌體處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期（exponentialphase），且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時，較為適宜。

嗜堿性芽孢桿菌（Bacillusalkalophilus)生產(chǎn)堿性蛋白酶（alkalineproteinase/protease），培養(yǎng)１２小時接種，酶活最高。第八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

接種量(seedvolume)指移入的種子的體積和接種后培養(yǎng)液的體積比。Antibiotic：

7%~7.5%Glu：1%接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度。采用較大接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖到達高峰的時間，使產(chǎn)物形成提前。原因：1、種子多，種子液中含有大量的胞外水解酶，有利于對基質(zhì)的利用２、生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個培養(yǎng)環(huán)境，減少染菌機會。但過多，易使菌體（菌絲體）生長過快，培養(yǎng)液粘度增加，溶氧降低，產(chǎn)物合成受影響。

e.g.嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶接種1%，酶活最高；1.5%~4%影響不大；大于4%，酶產(chǎn)量明顯下降。第九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四制霉菌素生產(chǎn)中，1%比10%效果好，0.1%與1%效果相當。

發(fā)酵生產(chǎn)的趨勢：采取大接種量及豐富培養(yǎng)基。如谷氨酸：大接種量20%，高生物素，高青霉素的強制發(fā)酵工藝。

有的采用雙種法增大接種量：兩只種子罐一只發(fā)酵罐如卡那霉素：雙種比單種的發(fā)酵單位（fermentationtiterunit）提高8%，到達產(chǎn)量高峰的時間提前。

倒種法：將培養(yǎng)適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一個發(fā)酵罐作為種子。如鏈霉素：倒種法比單種法的發(fā)酵單位提高12%。

第十頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

三.影響種子質(zhì)量的因素

1.原材料質(zhì)量：如四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中配制孢子培養(yǎng)基的麩皮（wheatbran）、霉菌用的大（?。┟住傊呐铺柕牟煌?、蛋白胨加工原料不同等均影響種子的質(zhì)量。原料質(zhì)量的波動，起主要作用的是其中的無機鹽含量的不同，如微量元素Mg++、Ca++、Ba++能刺激孢子的形成。P含量的多少也影響種子的質(zhì)量。氨基酸發(fā)酵中，淀粉水解糖制備后，加入其他的營養(yǎng)物（麩皮水解液、豆餅水解液、玉米漿），也對種子質(zhì)量多少有些影響。

一般情況：培養(yǎng)基糖分要少，氮源要多，無機鹽所占的比例要大。種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分趨于一致也有好處，種子很快適應，但各成分的數(shù)量根據(jù)目的各自確定?？傊?，各成分選擇得當，才能發(fā)揮菌種的特征，提高產(chǎn)量。第十一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

2.培養(yǎng)條件：

溫度、pH值、濕度、培養(yǎng)時間和冷藏時間等都影響種子質(zhì)量。制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量影響很大。如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂霉菌的孢子，在北方干燥地區(qū)孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。

一般相對濕度40~45%時孢子數(shù)量最多，孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。培養(yǎng)時間和冷藏時間對種子和孢子形成都有影響。如土霉素菌種孢子斜面培養(yǎng)四天左右，即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體自溶，而培養(yǎng)五天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。鏈霉素生產(chǎn)菌，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低8%。第十二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

四.種子質(zhì)量的控制措施必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境條件，保證無雜菌侵入

1.菌種穩(wěn)定性的檢查：少量菌種--無菌生理鹽水--遞增稀釋--平板劃線培養(yǎng)。挑出形態(tài)整齊，孢子豐滿的菌落進行搖瓶試驗，測定其生產(chǎn)能力。

2.無菌檢查：顯微鏡觀察、種子液進行無菌檢驗、生化分析。種子液平板劃線、斜面培養(yǎng)用肉眼觀察是否有異常菌落、異?，F(xiàn)象及鏡檢是否有雜菌。第十三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四五.種子質(zhì)量的判斷：

考察種子在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。感官判斷：看顏色、聞氣味理化指標測定：1、pH值2、培養(yǎng)基滅菌后的糖、氨基氮3、菌體形態(tài)、濃度4、產(chǎn)物量5、殘?zhí)菨舛?、酶活力（如土霉素生產(chǎn)，淀粉酶的活力與發(fā)酵單位有一定的關系）。第十四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四六.工業(yè)微生物培養(yǎng)的類型靜置培養(yǎng)法：即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進行培養(yǎng)發(fā)酵，也稱為嫌氣性培養(yǎng)

(anaerobicculturing)通氣培養(yǎng)法：生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，也稱為好氣性培養(yǎng)

(aerobicculturing)。第十五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

1表面培養(yǎng)法（surfaceculturing)：

好氧靜置培養(yǎng)法。針對容器內(nèi)培養(yǎng)基物形態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固體表面培養(yǎng)。相對于容器內(nèi)培養(yǎng)基體積而言，表面積越大，越易促進氧氣由氣液界面向培養(yǎng)基內(nèi)傳遞。這種方法菌的生長速度與培養(yǎng)基的深度有關，單位體積的表面積越大，生長速度越快。

2固體培養(yǎng)（發(fā)酵）法(solidculturing)：

固體培養(yǎng)又分為淺盤(shallowpan)固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱曲法培養(yǎng)。它起源于我國釀造生產(chǎn)特有的傳統(tǒng)制曲技術。其最大特點是固體曲的酶活力高。第十六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四

3液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）法：(liquidsubmerged

culturing)

液體深層發(fā)酵法從罐底部通氣，進入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐的底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對于由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。液體曲(liquidkoji)、檸檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinicacid)及其他發(fā)酵產(chǎn)品先后采用此法進行生產(chǎn)。

特點：容易按照生產(chǎn)菌種對于代謝的營養(yǎng)要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度、培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。第十七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期四外循環(huán)帶升式