微生物的鑒定(精)

微生物的鑒定(精)第一頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。微生物的鑒定

實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法實(shí)驗(yàn)3-4微生物大小測(cè)定與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

第二頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。

2.掌握微生物的簡(jiǎn)單染色法。

3.熟悉細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌在形態(tài)上的主要區(qū)別。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物的細(xì)胞小而透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須借助于染色，使菌體著色以增加菌體的顯示力，從而更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。第三頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察在微生物形態(tài)觀察中，根據(jù)不同的種類，需采用不同的染液和染色方法。染色前必須固定微生物，其目的有二：一是殺死微生物并使菌體粘附于載玻片上；二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法，固定時(shí)應(yīng)盡量維持細(xì)胞的原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。第四頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種與染料根據(jù)不同的菌種采用不同的染液，見表3-1和附錄Ⅳ。

2.儀器和其他用品顯微鏡，接種環(huán)，解剖刀，鑷子，酒精燈，載玻片，蓋玻片，石蠟油，吸水紙，擦鏡紙。表3-1不同微生物種類所使用的染液

微生物類群細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌菌種大腸桿菌細(xì)黃鏈霉菌米酒酵母根霉染液番紅石炭酸復(fù)紅呂氏美蘭乳酸石炭酸棉藍(lán)第五頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察四、實(shí)驗(yàn)方法（一）細(xì)菌、酵母菌的染色染色操作程序?yàn)椋和科稍铩潭ā旧础稍铩顽R觀察。

1.涂片取干凈載玻片，于中央加蒸餾水一小滴，將接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌，冷卻后，取試管斜面一支，按無菌操作法用接種環(huán)從菌種斜面表面挑取細(xì)菌少許(注意不要挑破培養(yǎng)基)，涂在載玻片水滴中，涂面約為1cm2的均勻薄膜。如果是液體培養(yǎng)物則不必加水，直接取菌液1～2環(huán)涂片，接種環(huán)經(jīng)滅菌后放回原處。無菌操作及做涂片的過程見圖3-1。第六頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察圖3-1無菌操作及做涂片的過程第七頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察

2.干燥將涂片自然風(fēng)干或?qū)⑤d玻片置于酒精燈火焰高處微熱烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形。

3.固定手執(zhí)涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通過火焰2～3次，使菌體固定于載玻片上，待載玻片冷卻后，再加染料。

4.染色將涂片置于玻片擱架上，加適量(以蓋滿菌膜為度)番紅染液或呂氏美蘭染液于菌膜部位，染色1～2分鐘。

5.水洗傾去染色液，用洗瓶中的自來水自載玻片一端輕輕沖洗，至流下的水中無染色液的顏色時(shí)為止。

6.干燥和鏡檢讓其自然干燥或用吸水紙吸去載玻片上多余的水分后。先用低倍鏡找到物像后再用油鏡觀察。第八頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-1微生物的形態(tài)觀察（二）放線菌、霉菌的染色

1.制片及染色用解剖刀從菌落的邊緣連同培養(yǎng)基一起挑取少量帶有孢子的菌絲，置于載玻片中央，先用另一載玻片使勁擠壓有菌部分，使得菌群鋪成一薄層，然后將載玻片中央置于酒精燈火焰上方加熱，使培養(yǎng)基融化，冷卻后，在載玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸復(fù)紅或乳酸石炭酸棉藍(lán)染液，再輕輕蓋上蓋玻片，注意避免產(chǎn)生氣泡。

2.鏡檢先用低倍鏡觀察，再換高倍鏡觀察。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪出所觀察到的各種微生物的形態(tài)。返回第九頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握芽孢染色的方法；

2.學(xué)習(xí)并初步掌握鞭毛染色法，觀察細(xì)菌鞭毛的形態(tài)特征；

3.學(xué)習(xí)并掌握莢膜染色的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，著色、脫色都比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞困難。芽孢染色法就是根據(jù)這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)的：采用一著色力強(qiáng)的染料，并用微火加熱，使菌體和芽孢同時(shí)著色后再用水洗，使菌體脫色而芽孢仍保留已著的顏色。第十頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，其直徑通常為10～20nm，只能用電子顯微鏡觀察。要用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染劑處理，使媒染劑沉積在鞭毛上，鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外面的一層粘液性物質(zhì)，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，莢膜與染料之間的親和力弱，不易著色，且可溶于水，易在水洗時(shí)被除去。但莢膜的通透性較好，一些染料可透過莢膜而使菌體著色，故常采用負(fù)染色法，使菌體和背景著色，莢膜不著色；因而莢膜在菌體周圍呈一透明圈。莢膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色時(shí)不用熱固定，以免莢膜皺縮變形。第十一頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種根據(jù)觀察目的的不同，選用不同的實(shí)驗(yàn)菌種，見表3-2。

2.染料及試劑孔雀綠染色液，硝酸銀鞭毛染色液，黑色素水溶液（見附錄Ⅳ），番紅溶液，甲醇。

3.儀器和用品顯微鏡，木夾子，載玻片，酒精燈等。表3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)觀察所選用的菌種

觀察目的芽孢鞭毛莢膜實(shí)驗(yàn)菌種枯草芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌褐球固氮菌第十二頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

四、實(shí)驗(yàn)方法（一）芽孢的染色

1.涂片取培養(yǎng)24h左右的枯草桿菌，涂片、干燥、固定。

2.初染加3～5滴孔雀綠染色液于已固定的涂片上，用木夾夾住載玻片，用微火加熱至染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算時(shí)間，約維持5min。加熱中應(yīng)隨時(shí)注意補(bǔ)加染液，切勿使標(biāo)本干涸。

3.水洗待玻片冷卻后傾去染液，水洗至不再褪色為止。

4.復(fù)染加番紅液1滴，染色1min，水洗。

5.鏡檢干燥后用油鏡觀察。第十三頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

（二）鞭毛染色

1.菌種的準(zhǔn)備冰箱保存的菌種要連續(xù)移種1～2次，取新配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面接種，28～32℃培養(yǎng)10～14h。

2.載玻片的準(zhǔn)備玻片要求光滑，潔凈，忌帶油跡。將載玻片在含適量洗衣粉的水中煮沸約20min，取出用清水充分洗凈，瀝干水后置于95%乙醇中，用時(shí)取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。

3.菌液的制備取斜面或平板菌種培養(yǎng)物數(shù)環(huán)于盛有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液用于制片。第十四頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

4.制片取一滴菌液于載玻片的一端，然后將玻片傾斜，使菌液緩緩流向另一端，用吸水紙吸去玻片下端多余菌液，室溫(或37℃溫箱)自然干燥。

5.染色涂片干燥后，滴加硝酸銀染色A液覆蓋3～5min，用蒸餾水充分洗去A液。用B液沖去殘水后，再加B液覆蓋涂片染色約數(shù)秒至1min，當(dāng)涂面出現(xiàn)明顯褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗。

6.鏡檢干后用油鏡觀察。菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色，通常呈波浪形。第十五頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

（三）莢膜染色

1.制片在載玻片一端加一滴無菌水溶液，取少許培養(yǎng)72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌懸液，取一滴碳素繪圖墨水與菌懸液充分混勻。另取一塊載玻片作推片，將推片一端平整的邊緣與菌液以300角接觸后順勢(shì)將菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，風(fēng)干。

2.固定用純甲醇浸沒涂片，固定1min，立即傾去甲醇，文火干燥，勿使玻片發(fā)熱。

3.染色滴加番紅溶液，染色1～2min，細(xì)水流適當(dāng)沖洗，自然干燥。

4.鏡檢背景黑灰色，莢膜呈一清晰透明圈，菌體紅色。

第十六頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.繪圖表示枯草芽孢桿菌茵體的形狀與芽孢的形狀、大小及其著生位置。

2.繪圖表示有鞭毛細(xì)菌的形態(tài)特征。

3.繪圖說明你觀察到的細(xì)菌的菌體和莢膜的形態(tài)。返回第十七頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解革蘭氏染色的原理。

2.掌握革蘭氏染色的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中的一個(gè)重要的鑒別染色法。由于應(yīng)用了結(jié)晶紫和番紅兩種不同性質(zhì)的染料進(jìn)行染色，故又叫復(fù)染色法。根據(jù)細(xì)菌對(duì)此種染色法的反應(yīng)不同，可將細(xì)菌分為兩大類，菌體呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為革蘭氏陰性菌。第十八頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

其原因是由于這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。革蘭氏陽性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量低，經(jīng)用乙醇（或丙酮）脫色等處理主要發(fā)生脫水作用，而使孔徑縮小，通透性降低，初染劑結(jié)晶紫和媒染劑碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈紫色；而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，類脂含量高，當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細(xì)胞壁通透性增大，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物較容易被洗脫出來，用番紅復(fù)染后，細(xì)胞被染上紅色。第十九頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。

2.染料和器材顯微鏡，載玻片，草酸銨結(jié)晶紫染色液，盧戈氏碘液（見附錄Ⅳ），95%乙醇，番紅染液，香柏油，二甲苯，擦鏡紙。第二十頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.涂片挑取少許大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，分別涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三區(qū)”涂片法：在玻片中央偏左和偏右方各加一滴無菌水，先挑取少量的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在左右一方分別涂片后，再將左右方的菌液延伸于中間區(qū)，使大腸桿菌、金黃色葡萄球菌相互混合。

2.干燥室溫自然干燥。

3.固定涂面朝上，在火焰上過2～3次。第二十一頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

4.染色(圖3-3)

(1)初染加草酸銨結(jié)晶紫染色液一滴，染色1～2min，水洗。

(2)媒染滴加盧戈氏碘液沖去殘水，覆蓋約1min，水洗。

(3)脫色斜置玻片于一燒杯上方，并在載玻片背面襯一白紙，滴加95%乙醇脫色，并輕輕搖動(dòng)載玻片，直洗至流出的乙醇剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)即停止(約0.5min)。立即用水洗凈乙醇，并輕輕吸干。

(4)復(fù)染加番紅染液一滴染色2min，水洗。第二十二頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

實(shí)驗(yàn)圖3-3革蘭氏染色程序1.加草酸銨結(jié)晶紫染1～2分鐘；2.水洗；3.加碘液媒染1分鐘；4.水洗；5.乙醇脫色約30s；6.水洗；7.番紅復(fù)染約2分鐘；8.水洗。第二十三頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-3革蘭氏染色法

5.干燥先用吸水紙輕輕吸干，再晾干。

6.鏡檢先用低倍鏡找到物像后，用油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告簡(jiǎn)述觀察到的兩種細(xì)菌革蘭氏染色的結(jié)果并繪圖（說明各菌的形態(tài)、顏色和革蘭氏染色反應(yīng)）。返回第二十四頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解用測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法；

2.了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)，掌握使用和計(jì)算方法。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物細(xì)胞的大小，是微生物重要的形態(tài)特征之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下測(cè)量。用于測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。目鏡測(cè)微尺是一塊圓形的玻片，在載玻片中央有一條把5mm長(zhǎng)度刻成50等分或把10mm長(zhǎng)度刻成100等分的線(圖3-2)。第二十五頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

測(cè)量時(shí)，將其放在接目鏡隔板上來測(cè)量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物像。目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際表示的長(zhǎng)度隨顯微鏡放大倍數(shù)的不同而異。即目鏡測(cè)微尺上的刻度只是代表相對(duì)長(zhǎng)度，所以在使用前須用鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以求得在一定放大倍數(shù)下實(shí)際測(cè)量時(shí)的長(zhǎng)度。鏡臺(tái)測(cè)微尺是一個(gè)中央部分刻有一條長(zhǎng)為lmm刻度的載玻片(比一般載玻片厚)，其上鑲有一圓形玻片，其中l(wèi)mm的刻度被精確等分為100小格，每格長(zhǎng)0.01mm(圖3-3)。因此長(zhǎng)度固定不變，所以用鏡臺(tái)測(cè)微尺的已知長(zhǎng)度，在一定放大倍數(shù)下，即可求出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度(圖3-4)。第二十六頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

圖3-2目鏡測(cè)微尺圖3-3鏡臺(tái)測(cè)微尺圖3-4鏡臺(tái)測(cè)微尺校準(zhǔn)目鏡測(cè)微尺情況第二十七頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

血球計(jì)數(shù)板可用于計(jì)數(shù)一定體積內(nèi)的微生物個(gè)體數(shù)量。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，玻片上有4條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表面比兩個(gè)平臺(tái)的表面高0.1mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央lmm2面積上刻有400個(gè)小方格(見圖3-5)。第二十八頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

圖3-5血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造

1-蓋玻片2-計(jì)數(shù)室第二十九頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

血球計(jì)數(shù)板有兩種規(guī)格，一種是將lmm2面積分為25個(gè)大格，每個(gè)大格再分為16個(gè)小格(25×16)。如在血球計(jì)數(shù)板上刻有一些符號(hào)和數(shù)字(見圖3-5a)，其含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25大格：即0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；(1/400)mm2表示計(jì)數(shù)室面積是lmm2，分400個(gè)小格，每小格面積是(1/400)mm2。另一種是16個(gè)大格，每個(gè)大格再分為25個(gè)小格(16×25)。兩者都是總共有400個(gè)小格。當(dāng)專用蓋玻片置于兩條嵴上，從兩個(gè)平臺(tái)側(cè)面加入菌液后，400個(gè)小方格(1mm2面積)計(jì)數(shù)室上形成0.1mm3(10-4mL)的體積。通過對(duì)一定大格內(nèi)微生物數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，可計(jì)算出lmL菌液所含的菌體數(shù)(見圖3-6)。第三十頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

圖3-6兩種不同刻度血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造第三十一頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.標(biāo)本釀酒酵母，枯草桿菌染色標(biāo)本片。

2.儀器和用品顯微鏡，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，血球計(jì)數(shù)板，移液管，香柏油，二甲苯，蓋玻片，擦鏡紙等。四、實(shí)驗(yàn)方法（一）微生物大小的測(cè)定

1.目鏡測(cè)微尺的校正（1）將目測(cè)微尺裝入目鏡的隔板上，使刻度朝下；（2）把物測(cè)微尺放在載物臺(tái)上，使刻度朝上，對(duì)準(zhǔn)聚光器。第三十二頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

（3）先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后轉(zhuǎn)換高倍鏡，再次調(diào)焦看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺的第一條線重合，順著刻度找出另一條重合線。（4）記錄兩端重合線之間目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺各有若干格。各種放大倍數(shù)各測(cè)量3次，取其平均值。（5）因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格10μm，所以由下式計(jì)算出用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察物體時(shí)，目鏡測(cè)微尺每格的實(shí)際長(zhǎng)度。第三十三頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

（6）移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，并將其洗凈、晾干，放回盒內(nèi)。

例如，目鏡測(cè)微尺5小格等于鏡臺(tái)測(cè)微尺2小格，則目鏡測(cè)微尺上每小格長(zhǎng)度為：2×10／5=4μm

用同法校正在油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件(特定的物鏡、目鏡、鏡筒長(zhǎng)度)進(jìn)行，而且只能在特定的情況下重復(fù)使用。第三十四頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

2.菌體細(xì)胞大小測(cè)定

(1)取一張干凈的載玻片，滴上一滴棉蘭染色液或路戈氏碘液。

(2)用接種環(huán)無菌操作取酵母菌少許制成水浸標(biāo)本片。

(3)取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺來測(cè)量酵母菌菌體的長(zhǎng)、寬各占幾格(不足1格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后l位數(shù))。測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度即等于該菌的大小。第三十五頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

一般測(cè)量菌體的大小要在同一涂片上測(cè)定10～15個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小，而且是用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行測(cè)定。

3.用同法在油鏡下測(cè)定枯草桿菌染色標(biāo)本的長(zhǎng)和寬。

4.用畢后，取出目鏡測(cè)微尺，將目鏡放回鏡筒，用擦鏡紙擦去目鏡測(cè)尺的油膩和手印，擦好油鏡頭。第三十六頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

（二）微生物的計(jì)數(shù)

1.稀釋樣品，為了便于計(jì)數(shù)，將樣品適當(dāng)稀釋，使每格約含4～5個(gè)細(xì)胞。

2.取干凈的血球計(jì)數(shù)板，用厚蓋玻片蓋住中央的計(jì)數(shù)室，用移液管吸取少許充分搖勻的待測(cè)菌液于蓋玻片的邊緣，菌液則自行滲入計(jì)數(shù)室，靜置5～10min即可計(jì)數(shù)。

3.將血球計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上，用低倍鏡找到小方格網(wǎng)后換高倍鏡觀察計(jì)數(shù)。需不斷地上、下旋動(dòng)微調(diào)節(jié)器，以便看到計(jì)數(shù)室內(nèi)不同深度的菌體。第三十七頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

現(xiàn)以16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)板為例，數(shù)四個(gè)角（左上、右上、左下、右下）的四中格（即100小格）的酵母菌數(shù)。如果是25×16規(guī)格的計(jì)數(shù)板，除取四個(gè)角上四中格外，還取正中的一個(gè)中格（即80小格），對(duì)位于大格線上的酵母菌只計(jì)大格的上方及左方線上的酵母菌，或只計(jì)下方及右方線上的酵母菌。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值，再按公式計(jì)算每毫升菌液中所含的酵母菌數(shù)。酵母菌細(xì)胞數(shù)/mL=每個(gè)小格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)第三十八頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下列空格目鏡______倍，低倍鏡______倍，高倍鏡__

__，油鏡

倍。高倍鏡下，目鏡測(cè)微尺_(dá)________格：鏡臺(tái)測(cè)微尺_(dá)______格。目鏡測(cè)微尺每格=_____μm。油鏡下，目鏡測(cè)微尺_(dá)_____格＝鏡臺(tái)測(cè)微尺_(dá)_______格。目鏡測(cè)微尺每格=____μm。

2.將測(cè)得的菌體大小記錄于下表3-3中

3.將計(jì)數(shù)得的菌體數(shù)量記錄于下表3-4中第三十九頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-4微生物的大小測(cè)定與計(jì)數(shù)

菌號(hào)12345678910平均值（μm）長(zhǎng)(格）寬(格）表3-3菌體大小測(cè)量結(jié)果表3-4菌液中所含的酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)次數(shù)左上角方格左下角方格（中央方格）右上角方格右下角方格合計(jì)平均每個(gè)小格內(nèi)細(xì)胞數(shù)123稀釋倍數(shù)酵母菌細(xì)胞數(shù)／mL返回第四十頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解細(xì)菌鑒定中常用的生化反應(yīng)及其原理。

2.了解不同種類的細(xì)菌對(duì)碳水化合物及含氮化合物的分解利用情況，從而認(rèn)識(shí)微生物代謝類型的多樣性。

3.學(xué)習(xí)平板接種法及穿刺接種法。二、實(shí)驗(yàn)原理由于各種微生物的新陳代謝不同，因此對(duì)各種物質(zhì)利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，故可利用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝物（這種反應(yīng)稱為生化反應(yīng)），并以此作為鑒定微生物的依據(jù)。第四十一頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌，普通變形桿菌。

2.培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鐵銨固體培養(yǎng)基等，見附錄Ⅲ。

3.試劑盧戈氏碘液，40%NaOH溶液，5%-萘酚溶液（乙醇配制），甲基紅試劑，吲哚試劑（見附錄Ⅴ），乙醚等。

4.其他物品無菌培養(yǎng)皿，無菌試管，接種環(huán)，酒精燈，接種針等。第四十二頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

四、實(shí)驗(yàn)方法

(一)淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收利用，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。操作步驟如下：

1.將盛有淀粉培養(yǎng)基的錐形瓶置于沸水俗中融化，然后取出冷卻至50℃左右，以無菌操作傾入培養(yǎng)皿中約15～20mL，待凝固后制成平板。

2.翻轉(zhuǎn)平皿使皿底朝上，用記號(hào)筆在其背面做好標(biāo)記，以免菌種混淆。第四十三頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

3.用接種環(huán)取少量枯草芽孢桿菌在平板的一邊劃“+”字作為陽性對(duì)照菌；另取少量大腸桿菌或產(chǎn)氣桿菌在平板的另一邊劃“+”字（圖3-7），然后將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。

4.觀察結(jié)果打開培養(yǎng)皿蓋，滴加少量碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板，如菌體周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已被水解。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱。第四十四頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

12圖3-7淀粉水解試驗(yàn)接種示意圖

1.枯草芽孢桿菌；2.大腸桿菌第四十五頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

(二)乙酰甲基甲醇(V.P.)試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在糖代謝過程中，能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，二個(gè)分子丙酮酸經(jīng)縮合和脫羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基起作用，生成紅色化合物。此為V.P.試驗(yàn)的陽性反應(yīng)。在試管中加入少量的-萘酚為顏色增強(qiáng)劑可使反應(yīng)加快。第四十六頁，編輯于星期六：十八點(diǎn)十八分。實(shí)驗(yàn)3-5微生物的理化性能鑒定

操作步驟如下：

1.分別接種大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌于裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h，有時(shí)需延長(zhǎng)培養(yǎng)到10天。

2.在已培養(yǎng)兩天的試管內(nèi)，先加入40%KOH溶液10～20滴，然后再加入等量的-萘酚溶液，拔