細胞免疫檢測技術(shù)

（優(yōu)選）細胞免疫檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第1頁；編輯于星期日\22點17分細胞免疫Cell-mediatedimmunityisanimmuneresponsethatdoesnotinvolveantibodiesbutratherinvolvestheactivationofphagocytes,naturalkillercells(NK),antigen-specificcytotoxicT-lymphocytes,andthereleaseofvariouscytokinesinresponsetoanantigen.細胞免疫（cellularimmunity）T細胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細胞(也叫效應(yīng)T細胞)，當相同抗原再次進入機體的細胞中時，致敏T細胞（效應(yīng)T細胞）對抗原的直接殺傷作用及致敏T細胞所釋放的細胞因子的協(xié)同殺傷作用，統(tǒng)稱為細胞免疫。本文檔共34頁；當前第2頁；編輯于星期日\22點17分本文檔共34頁；當前第3頁；編輯于星期日\22點17分檢測對象免疫細胞數(shù)量（E玫瑰花環(huán)形成實驗，流式細胞術(shù)）T細胞亞群（間接免疫熒光法，流式細胞術(shù),免疫磁珠）細胞因子檢測技術(shù)（ELISA，定量PCR,Elispot）免疫細胞活性(淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗)本文檔共34頁；當前第4頁；編輯于星期日\22點17分應(yīng)用范圍1、測定患病個體的細胞免疫狀態(tài)與水平，以分析其發(fā)病機制；2、測定動物疫苗免疫或抗原注射后機體的細胞免疫反應(yīng)3、篩選免疫增強劑或免疫抑制劑藥物，或研究化學藥物、營養(yǎng)成分以及物理療法對機體免疫功能的影響4、在研制細胞因子制劑過程中，測定其活性及效價本文檔共34頁；當前第5頁；編輯于星期日\22點17分T細胞表面受體一、T細胞抗原受體二、細胞因子受體三、綿羊紅細胞受體四、有絲分裂原受體本文檔共34頁；當前第6頁；編輯于星期日\22點17分T細胞亞群輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞（CD3+CD4+）、抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD8+）、CD4+T細胞純真亞群（CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+）和記憶亞群（CD4+CD45RA-/CD4+CD45RO+）、功能亞群（CD28+）、激活亞群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亞群（CD95+）本文檔共34頁；當前第7頁；編輯于星期日\22點17分1.E玫瑰花環(huán)形成試驗erythocyterosettetest實驗原理：人和動物外周血中T細胞表面有紅細胞受體（即CD2分子），在體外能直接和異種或同種動物紅細胞（SRBC）結(jié)合形成玫瑰花樣細胞團，以此來區(qū)分T、B。TTBSRBCCD2檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第8頁；編輯于星期日\22點17分左:（甲紫染色，800×）：可見2個被綿羊紅細胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個染成橙黃色熒光的T淋巴細胞被綿羊紅細胞所包圍。本文檔共34頁；當前第9頁；編輯于星期日\22點17分B細胞沒有紅細胞受體，但有免疫球蛋白Fc受體和補體C3受體，故可用抗紅細胞抗體（A）或者補體（C）搭橋，形成EA玫瑰花環(huán)實驗和EAC玫瑰花環(huán)實驗。本文檔共34頁；當前第10頁；編輯于星期日\22點17分2.流式細胞術(shù)定義：流式細胞術(shù)(Flow

Cytometry,

FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學技術(shù),它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體,

同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對群體細胞在單細胞水平上進行分析,

在短時間內(nèi)檢測分析大量細胞,并收集、儲存和處理數(shù)據(jù),進行多參數(shù)定量分析;

能夠分類收集(分選)某一亞群細胞,分選純度＞95%。在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應(yīng)用。一種細胞分選或分析技術(shù)。即以熒光素標記抗體結(jié)合相應(yīng)細胞，用激光束激發(fā)單行流動的細胞，根據(jù)細胞所攜帶熒光(強度或類別)進行分選或分析。檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第11頁；編輯于星期日\22點17分本文檔共34頁；當前第12頁；編輯于星期日\22點17分將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。本文檔共34頁；當前第13頁；編輯于星期日\22點17分流式細胞術(shù)---T細胞亞群具有CD3抗原的T細胞：外周血成熟的T細胞具有CD4抗原的T細胞：TH（機體免疫應(yīng)答的啟動細胞，促進T細胞、B細胞免疫應(yīng)答，活化的TH細胞可釋放IL-2及IFN-r）具有CD8抗原的T細胞：Tc（在TH輔助下特異性殺傷或溶解靶細胞）本文檔共34頁；當前第14頁；編輯于星期日\22點17分本文檔共34頁；當前第15頁；編輯于星期日\22點17分3.間接免疫熒光法檢測淋巴細胞CD抗原免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第16頁；編輯于星期日\22點17分4.免疫磁珠分離法

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免疫磁珠分離法：將針對細胞某種表面標記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標記的細胞，然后用強磁場可將具有這種表面標記的細胞分離出來。磁珠(microbead)標記細胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第17頁；編輯于星期日\22點17分磁珠分離策略：一.陽性分選磁珠標記目的細胞未標記細胞先行流出移出磁場后收集目的細胞CD4+T細胞分離柱CD4-T細胞本文檔共34頁；當前第18頁；編輯于星期日\22點17分磁珠標記非目的細胞目的細胞先行流出二.陰性分選本文檔共34頁；當前第19頁；編輯于星期日\22點17分5.固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)ELISPOT細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果.檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第20頁；編輯于星期日\22點17分與ELISA的區(qū)別

1、ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出定量的可溶性蛋白總量。2、ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個活性細胞，從而計算出分泌該蛋白或者細胞因子的細胞的頻率3、由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。4、捕獲抗體不會影響活化細胞分泌細胞因子。本文檔共34頁；當前第21頁；編輯于星期日\22點17分圖注：ELISPOT法在檢測低頻率產(chǎn)生細胞因子的細胞時具有獨一無二的敏感性。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生IFN-的T細胞與一百萬個抗原呈現(xiàn)細胞（AntigenPresentingCells，APC）混合后，使用ELISPOT法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和ELISA法（下圖）分別測量產(chǎn)生IFN-的細胞的數(shù)目。本文檔共34頁；當前第22頁；編輯于星期日\22點17分本文檔共34頁；當前第23頁；編輯于星期日\22點17分

6.T淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗T細胞、B細胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細胞克隆發(fā)生增殖。檢測技術(shù)本文檔共34頁；當前第24頁；編輯于星期日\22點17分植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細胞增殖；抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對小鼠有作用）則刺激B細胞發(fā)生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對T、B細胞的增殖均有刺激作用。本文檔共34頁；當前第25頁；編輯于星期日\22點17分淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗方法形態(tài)計數(shù)法MTT法同位素摻入法本文檔共34頁；當前第26頁；編輯于星期日\22點17分形態(tài)計數(shù)法加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學變化，計算轉(zhuǎn)化為母細胞的百分數(shù)細胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化。本文檔共34頁；當前第27頁；編輯于星期日\22點17分MTT法MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。細胞受到ConA作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT作為其底物參與反應(yīng)，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，經(jīng)溶劑溶解后為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養(yǎng)物的OD值，測定波長570nm。根據(jù)OD值的大小計算反應(yīng)體系中細胞增殖程度。

本文檔共34頁；當前第28頁；編輯于星期日\22點17分同位素法3H-TdR摻入法：細胞增殖的基本條件或前提為細胞質(zhì)和細胞核的復(fù)制，這是正常細胞增殖過程缺一不可的前提。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。加入細胞培養(yǎng)液中后被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多，因此，檢測所摻入的3H-TdR就可反映細胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題，故我們實習中仍用MTT法。

本文檔共34頁；當前第29頁；編輯于星期日\22點17分同位素法優(yōu)勢3H-TdR=增殖細胞數(shù)；MTT=總細胞數(shù)。所以前者更能反映細胞增殖指數(shù)。例，培養(yǎng)10個細胞，3天后A組為17個，B組為13個，此為MTT的結(jié)果；3H-TdR的結(jié)果則為7：3，A組細胞的增殖是B組的2.3倍。本文檔共34頁；當前第30頁；編輯于星期日\22點17分實驗步驟1、雞脾淋巴細胞懸液制備淋巴細胞的分離用1640培養(yǎng)液配成106細胞/ml本文檔共34頁；當前第31頁；編輯于星期日\22點17分2、淋巴細胞增殖反應(yīng)將脾細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔，每一份脾細胞懸液分裝6個孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3個孔不加ConA作為對照。置5%CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H-TdR20μL，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多頭細胞收集器將細胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。3、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示

實驗孔cpm

SI=

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對照孔cpm受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值，即可判定該項實驗結(jié)果陽性。本文檔共34頁；