應(yīng)用微生物技術(shù)課件

應(yīng)用微生物技術(shù)課件

緒論

-應(yīng)用微生物學(xué)概述

-）應(yīng)用微生物學(xué)的發(fā)展簡史

前6000年，古巴比倫人釀啤酒；利用酵母等微生物的糖化和發(fā)酵機理產(chǎn)生乙醇；埃及

人釀葡萄酒；

仰韶文化遺址出土陶制酒具；

4000多年前的龍山文化時期，釀酒更為普遍；

前4000年，埃及人制作面包；

商代，一定時間儲存的糞便來肥田；春秋戰(zhàn)國時期混制肥糞；前一世紀(jì)《汜勝之書》肥

田需熟糞；

瓜類與小豆間作；后魏（公元6世紀(jì)）賈思勰《齊民要術(shù)》，種過豆類植物的土地特別

肥沃，提倡輪作，利用根瘤的固氮作用為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)；西方人18世紀(jì)30年代輪作

前6世紀(jì)用釀酒微生物治腹泄??；

3世紀(jì)“取腦（瘋狗）傅之”治狂犬病；

998-1022年宋真宗時代種痘；《醫(yī)宗金鑒》“種痘之法起于江右，達(dá)于京傲；究其源，

為宋真宗時峨眉山有神人出為丞相王達(dá)之子種痘而愈，其法遂傳于世；用天花病人身上的

痘痂，接種在兒童的鼻孔中預(yù)防天花；明代1628年《種痘十全》；1796年英國醫(yī)生

Jenner接種牛痘解決了天花的預(yù)防；1904年傳入中國；

1900—1940年，發(fā)酵主要產(chǎn)物：酵母菌體，甘油，檸檬酸，乳酸，丙酮丁醇；

進展：丙酮丁醇發(fā)酵罐；低碳鋼制造，圓柱形，加壓蒸汽滅菌，無菌接種；

青霉素：

深層通氣培養(yǎng)，通入無菌空氣，攪拌使空氣均勻分布；

培養(yǎng)基滅菌，無菌接種，溫度，pH,通氣量，營養(yǎng)物受到嚴(yán)格控制；

改良菌種;

60年代，微生物菌體；擴大生產(chǎn)規(guī)模，80-150m3,3000m3；g；加壓噴射發(fā)酵罐，加

壓循環(huán)發(fā)酵罐；氣升式發(fā)酵罐；連續(xù)培養(yǎng)；

70年代，基因工程；細(xì)胞融合技術(shù)；胰島素，F(xiàn)擾素；計算機控制發(fā)酵，新的生物反應(yīng)

器，傳感器；固定化細(xì)胞；基因工程，細(xì)胞工程，酶工程，發(fā)酵工程，生化工程；

三）應(yīng)用微生物研究的領(lǐng)域

1應(yīng)用微生物學(xué)與環(huán)境保護

1）微生物完成重要的生態(tài)功能

分解者：如果沒有微生物，物質(zhì)循環(huán)中斷，動植物尸體和廢物堆積如山；

2）微生物的環(huán)境凈化功能

①環(huán)境污染的生物修復(fù)

利用微生物及其他生物，招土壤，地下水或海洋中的危險性污染物現(xiàn)場降解成二氧化碳

和水或轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)；

土著微生物，外來微生物，基因工程菌；

基因工程技術(shù)構(gòu)建的能同時降解芳香燒，多環(huán)芳煌，皓煌，脂肪燒的多質(zhì)料超級菌，能

將天然菌一年多消除的浮油，縮短到幾個小時，獲得美國專利；

國外采取輸送營養(yǎng)物刺激天然菌株降解活性治理地卜水甲苯污染；

我國采用微生物技術(shù)治理石油化工含酚廢水，印染廢水脫色，有機磷家藥廠等工業(yè)廢水

污染工農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化及建立清潔生產(chǎn)工藝的環(huán)境微生物工程

人畜糞便處理，城市污泥，生活垃圾堆肥，沼氣發(fā)酵；

如利用有機廢物生產(chǎn)甲烷，應(yīng)用酵母和光合細(xì)菌凈化高濃度有機無毒廢水生產(chǎn)細(xì)胞蛋

白，同時生產(chǎn)飼料餌料；利用廢纖維素生產(chǎn)燃料乙醇；

利用木柴廢棄物所含半纖維素生產(chǎn)木糖及木糖醇

③微生物技術(shù)治理農(nóng)田污染

分解農(nóng)作物桔桿，農(nóng)畜糞便，殘留農(nóng)藥，具效率高，速度快，成本低，反應(yīng)條件溫和，

無二次污染等優(yōu)點；

2應(yīng)用微生物學(xué)與農(nóng)業(yè)

1）微生物肥料的開發(fā)利用

菌肥：利用微生物的生命活動來增加土壤中氮磷鉀含量，或?qū)⒉荒芾玫奈镔|(zhì)，轉(zhuǎn)化成

可被吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)，或提供作物的生長刺激物質(zhì)，或抑制植物病原菌的活動；固

氮：根瘤菌肥，固氮菌肥，固氮藍(lán)藻；

有機磷細(xì)菌肥料，鉀細(xì)菌，磷細(xì)菌肥料；

刺激植物生長防治病蟲害的PGPR菌肥；

菌根菌肥料；

2）微生物農(nóng)藥

微生物殺蟲劑：細(xì)菌制劑如蘇云金桿菌，放線菌制劑，真菌制劑如白僵菌，霉菌制劑，

病毒制劑；

農(nóng)用抗生素：鏈霉素，土霉素，灰黃霉素，放線酮，滅瘟素；

微生物除草劑：如魯保一號

3）微生物在畜牧業(yè)的應(yīng)用

推廣使用微生物飼料，實施健康養(yǎng)殖可提升現(xiàn)有動物產(chǎn)品的商品價值，開發(fā)名特優(yōu)動物

產(chǎn)品，完善動物產(chǎn)品價格結(jié)構(gòu)體系，滿足我國發(fā)達(dá)地區(qū)對高品質(zhì)動物產(chǎn)品需求；

推廣使用微生態(tài)添加劑，開發(fā)新型安全優(yōu)質(zhì)的動物產(chǎn)品，降低養(yǎng)豬場的氨硫化氫二氧化

硫濃度，凈化養(yǎng)豬場污水；

①微生物飼料：

微生物發(fā)酵飼料：人工接種微生物或飼料本身存在的微生物，將青飼料，粗飼料，少量

精飼料，其他廢棄物，在一定溫度，濕度和通氣條件下，通過微生物的作用，將飼料中不

易消化吸收的成分，轉(zhuǎn)化為易消化，并適合家畜口味的營養(yǎng)料，如利用秸桿，殼類，木

屑，糠渣，畜禽糞便等發(fā)酵飼料；

光合細(xì)菌在20世紀(jì)80年代以來用于處理高濃度有機廢水；日本使用光合細(xì)菌處理制

革，罐頭，酒精廠廢水，廢水處理后菌體蛋白含量6%,是魚蝦雞豬優(yōu)質(zhì)飼料添加劑；

微生物活菌制劑：通過直接飼喂來改善畜禽腸道微生物菌群平衡，而對動物腸道施加有

利影響的活微生物飼料添加劑，促生長，除疾病，除臭氣；

③高效微生物酶制劑

如淀粉的，葡聚糖酶，糖化酶，纖維素筋，半纖維素的，果膠醐，脂肪能；分解農(nóng)作物

秸桿中木質(zhì)素，纖維素，即可提高飼料利用率，減少環(huán)境污染，又可開發(fā)非傳統(tǒng)的飼料資

源；

4）提高農(nóng)作物抗性

不少微生物具抗蟲抗病耐鹽堿耐高低溫等抗逆特性；

抗花葉病毒黃瓜，抗病毒馬鈴薯，抗腐爛西紅柿，抗蟲玉米甘藍(lán)；

5）微生物激素的開發(fā)利用

赤霉素，硫磺胺，VB12,組氨酸，尿嗑咤；

如利用赤霉素涂抹，浸種，拌種，蘸根，噴霧；

對喂食植物性飼料為主的小雞，加VB12,刺激生長作用；

應(yīng)用亞劑量的金霉素或其他菌絲殘渣喂豬，豬食欲旺盛，體重增長明顯，皮毛光澤，并

有預(yù)防和治療疾病的良好效果；

6）微生物食品：釀酒，制醋，制醬；食用菌，冬蟲夏草；有益微生物制劑；

3微生物與能源開發(fā)

甲烷，氫，乙醇，甲醇；

利用微生物直接發(fā)酵甘蔗木薯制造乙醇，目前，美國，巴西，日本，德國將這種乙醇代

替汽油用于汽車燃料進入實用化；

4應(yīng)用微生物學(xué)與生物工程技術(shù)

將合成治療糖尿病的胰島素基因重組于大腸桿菌，生產(chǎn)胰島素；

將生產(chǎn)能促進人生長的生長素近制基因重組于大腸桿菌中，生產(chǎn)生長素；

將能治療癌癥及抗擊病毒侵染人體細(xì)胞的干擾素基因重組于大腸桿菌中，生產(chǎn)干擾素；

美籍印度人柴拉巴將分解芳煌，菇燃，多環(huán)芳燒的細(xì)菌質(zhì)料轉(zhuǎn)到能降解脂燃的菌體內(nèi)獲得

具4種質(zhì)粒，能降解多種燃類的新菌種；能將一般菌在海上處理浮油時間從1年縮短到幾

個小時；

第一章應(yīng)用微生物學(xué)基本技術(shù)

第二節(jié)微生物基本操作技術(shù)

-無菌操作技術(shù)

-）滅菌方法

1干熱滅菌

1）灼燒滅菌法：接種環(huán)，接種針或其他金屬用具，試管和三角瓶口；

2）干熱空氣滅菌法：烘箱，干燥箱的熱空氣170℃殺死微生物；玻璃器皿如吸管平板，

金屬用具等，凡不適于用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品；

2濕熱滅菌

1）常壓蒸汽滅菌：

常壓條件下，在不能密閉的容器內(nèi)滅菌；

不具備高壓蒸汽滅菌情況下，或不宜高壓蒸煮的物質(zhì)如糖液，牛奶，明膠；

溫度不超過100C,大多數(shù)微生物被殺死，芽泡細(xì)菌短時間不能殺死；

常壓蒸汽持續(xù)滅菌：持續(xù)加熱6-8h；

間痰滅菌：芽泡100℃短時間內(nèi)不會失活而微生物營養(yǎng)體半小時即被殺死，芽抱萌發(fā)后

耐熱性消失，通過反復(fù)培養(yǎng)反復(fù)滅菌；操作：先用100℃,30-60min殺死營養(yǎng)體，然后將

含芽胞的培養(yǎng)基室溫24h,使其萌發(fā)，再滅菌一次；經(jīng)2次培養(yǎng)3次反復(fù)蒸煮，達(dá)到完全

無菌；

2）高壓蒸汽滅菌：

穿透力強，效果最好；

常用于培養(yǎng)基的滅菌；

培養(yǎng)基中某些成分分解氧化，酸度增加，pH下降0.2-0.3；

葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)破壞，并形成一引起渾濁和沉淀；葡萄糖溶液分別滅菌，壓力盡可能

低些；3過濾除菌

含菌液體或氣體通過細(xì)菌濾器，使雜菌留在濾器或濾板上；

細(xì)菌過濾器是由孔徑極小，能阻擋細(xì)菌的陶瓷，硅藻土，石棉或玻璃粉制成；

為加快過濾，抽氣減壓;

用于多汁不宜用濕熱滅菌的液體物質(zhì)，如抗生素，血清，糖；發(fā)酵工業(yè)中無菌空氣的制

備4紫外線殺菌

260nm波長的紫外線；

穿透力弱，只用于表面殺菌和空氣滅菌；實驗室，接種室，接種箱，手術(shù)室，藥廠的包

裝室；

對眼黏膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用；

5化學(xué)藥劑消毒殺菌

殺菌劑：如重金屬離子，某此強氧化劑；

抑菌劑：磺胺類，抗生素制劑；

二）滅菌在微生物工業(yè)的應(yīng)用

1培養(yǎng)基的滅菌

1）溫度

高溫濕熱短時滅菌；

不但滅菌時間短，而且培養(yǎng)基成分破壞小；

但溫度高，對設(shè)備要求嚴(yán)格；120℃；

2）操作方式

分批滅菌：配制好的培養(yǎng)基置發(fā)酵罐中，通入蒸汽，達(dá)到預(yù)定溫度后維持一段時間，再

冷卻到發(fā)酵所需溫度；又稱實罐滅菌，間歇滅菌；

適于小型發(fā)酵工廠；不須專門滅菌設(shè)備，操作簡單易行，投資少，滅菌效果好；

缺點：加熱和冷卻所需時間長，營養(yǎng)破壞大；發(fā)酵罐利用率低，不適合大規(guī)模生產(chǎn)過程

的滅菌；

連續(xù)滅菌：在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地加溫，保溫，再冷卻，把滅菌培養(yǎng)基加入已滅菌發(fā)酵

罐的滅菌方式；如培養(yǎng)基輸入加熱塔，滅菌溫度132C,塔內(nèi)停留20—30秒；維持罐5-

7min；優(yōu)點：高溫短時滅菌，對營養(yǎng)破壞?。患訜峥?，冷卻快，滅菌時間短，設(shè)備利用

率高；缺點：設(shè)備投資大，當(dāng)培養(yǎng)基含固體顆料或易產(chǎn)生較多泡沫時，易造成局部滅菌

不充分與管道堵塞；

pH：6-8時，微生物最耐熱；小于6時，氫離子易滲入細(xì)胞內(nèi)，促使其死亡；pH越低，

滅菌時間越短；

培養(yǎng)基中污染菌的數(shù)量，菌齡，耐熱性：雜菌數(shù)量多，滅菌時間長；營養(yǎng)體，酵母，霉

菌的菌絲體對熱敏感，胞子和芽胞耐熱性強；

泡沫：泡沫的空氣形成隔熱層，空氣導(dǎo)熱差，包裹在泡沫中的微生物不易被殺死；因此

滅菌操作注意泡沫的產(chǎn)生，防止壓力驟降而起泡；

pH：6-8時，微生物最耐熱；小于6時，氫離子易滲入細(xì)胞內(nèi)，促使其死亡；pH越低，

滅菌時間越短；

培養(yǎng)基中污染菌的數(shù)量，菌齡，耐熱性：雜菌數(shù)量多，滅菌時間長；營養(yǎng)體，酵母，霉

菌的菌絲體對熱敏感，抱子和芽胞耐熱性強；

泡沫：泡沫的空氣形成隔熱層，空氣導(dǎo)熱差，包裹在泡沫中的微生物不易被殺死；因此

滅菌操作注意泡沫的產(chǎn)生，防止壓力驟降而起泡；

2發(fā)酵設(shè)備及管道和附屬設(shè)備的滅菌

發(fā)酵罐：空罐滅菌；實罐滅菌；

管道：蒸汽滅菌；

過濾器：蒸汽滅菌；蒸汽壓力0.2Mpa左右，不可過大，45-60min,然后通入壓縮空氣

吹干；3空氣除菌

過濾除菌：讓含菌空氣通過過濾介質(zhì)時，利用介質(zhì)阻截空氣中的微生物，取得無菌空

氣；過濾介質(zhì)：棉花，活性炭，玻璃介質(zhì)，有機合成纖維，燒結(jié)材料

空氣除菌設(shè)備流程；

粗過濾器，壓縮機，貯罐，冷卻器，旋風(fēng)分離器，冷卻器，絲網(wǎng)過濾器，加熱器，過濾

器；

1）采氣：含菌少的空氣：采氣口距地面20-30m；郊區(qū)；

2）粗過濾器：捕集較大的灰塵顆粒；

3）空壓機：能耗大；

4）儲氣罐：高溫除菌；

5）冷卻器：空氣經(jīng)壓縮機后可達(dá)120℃高溫，若不冷卻會燒焦過濾介質(zhì)；立式列管式熱

交換器，沉浸式熱交換器，噴淋式熱交換器；

6）油水分離器：空氣經(jīng)壓縮機后會帶上一些潤滑油；空氣冷卻后，水汽凝結(jié)成水滴；

7）加熱器：空氣濕度仍較大；通過加熱，降低空氣濕度；

8）總過濾器，分過濾器

三）微生物的接種技術(shù)

斜面接種，液體接種，固體接種；

接種環(huán)，接種針，玻璃刮鏟，移液管，移液槍；

小規(guī)模：無菌接種箱，超凈工作臺；

大規(guī)模：無菌室；

工業(yè)：

管道壓力差接種法，

即利用壓力泵，

把種子液從種子罐

抽入發(fā)酵罐；

1無菌室的滅菌

1）熏蒸：

先將室內(nèi)打掃干凈，通風(fēng)干燥后，重新關(guān)閉，熏蒸滅菌；福爾馬林（37-40%甲醛水溶

液），取6T0inl/m3,盛于鐵制容器中，利用電爐或酒精燈直接加熱，或加高鋸酸鉀，通

過氧化作用加熱，使福爾馬林蒸發(fā)；熏蒸后密閉12h以上；使用無菌室前l(fā)-2h,取與甲醛

溶液等量的氨水，倒入搪瓷盤內(nèi)揮發(fā)中和，以減輕刺激作用；或用乳酸，硫磺熏蒸滅菌；

2）紫外線滅菌：接種前后，打開紫外燈0.5h；

3）石炭酸噴霧：每次操作前，取5%石炭酸噴于接種室臺面和地面；

2接種方法

1）試管接種

2）液體接種

斜面菌種接種液體培養(yǎng)基:

液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基：

液體菌種接種固體平板：

3）固體接種

菌液接種固體料：

固體種子接種固體料：

搶溫接種：在固體料滅菌后不要使料溫降得過低才接種，而在料溫高于培養(yǎng)溫度5T0C

接種；可使培養(yǎng)基在接種后得到適宜的溫度條件，能迅速生長繁殖，長勢好，雜菌不易滋

生；適于芽泡菌和產(chǎn)生抱子的菌接種；

堆積起溫：大量的固體曲料接種后，不要立即分裝曲盤或上簾，先堆積起來，上加覆蓋

物，防止散熱，使培養(yǎng)菌適應(yīng)新環(huán)境條件，逐漸生長旺盛，產(chǎn)生較大熱量使料溫升高，再

分裝一定容器中培養(yǎng)；這樣可避免一開始培養(yǎng)菌繁殖慢，料溫上不去，拖延培養(yǎng)時間，水

分蒸發(fā)大，雜菌易發(fā)展等缺點；

二培養(yǎng)基及其制備

-）培養(yǎng)基的成分及來源1碳源：

糖：多數(shù)微生物利用糖作碳源：

單糖優(yōu)于雙糖多糖，一糖優(yōu)于戊糖，葡萄糖果糖優(yōu)于甘露糖，半乳糖；純多糖優(yōu)于雜多

糖；葡萄糖是最易利用的碳源，速效碳源；但高濃度葡萄糖加速菌體代謝，溶解氧不能

滿足需要，中間代謝物如乳酸丙酮酸不能完全氧化積累在菌體或培養(yǎng)基中，pH下降，微生

物受到抑制；淀粉為長效碳源，利用較慢，高濃度不會對微生物產(chǎn)生不利影響；

油脂：豆油，菜籽油；某些霉菌和放線菌可利用油脂作碳源；

有機酸：單細(xì)胞蛋白，氨基酸，維生素和某些抗生素的生產(chǎn)可利用乙酸鹽，檸檬酸鹽作

碳源；醇，烽：一些甲烷氧化菌只利用甲烷和甲醇作碳源；

2氮源

有機氮；黃豆餅粉，花生餅粉，棉籽餅粉，玉米漿，蛋白陳，酵母粉，魚粉；

含豐富蛋白質(zhì)，氨基酸，含少量糖類，脂肪，生長因子；微生物在有機氮源培養(yǎng)基中生

長旺盛；

無機氮：氨水，硫酸核，氯化筱，硝酸鹽;

速效氮源；

引起pH變化；鏤鹽利用后，pH下降，稱生理酸性鹽；硝酸鹽利用后pH上升，稱生理堿

性鹽；氨水作補充氮源，調(diào)節(jié)pH；

玉米漿：是制玉米淀粉的副產(chǎn)物；

將玉米粒先用亞硫酸浸泡，浸泡液濃縮即制成黃褐色的液體，叫玉米漿

3無機鹽和微量元素

磷酸鹽，硫酸鹽，氯化鈉，氯化鉀，微量元素如鎂鐵鉆鋅錦；

低濃度時對微生物有促進作用，高濃度則表現(xiàn)出明顯的抑制作用；

功能：構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分（磷硫等）；作為前的組分或某些能的輔能或酶的激活

劑，如鎂鐵鎰鋅鉆；調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和影響細(xì)胞膜的通透性，如氯化鈉，氯化鉀；參與

產(chǎn)物的生物合成；

需求量很低；天然培養(yǎng)基的碳氮源本身含一定量的微量元素，配制時一般不需單獨加

入；4生長因子

維生素，氨基酸，喋吟，口密咤的衍生物及脂肪酸；

維生素是輔酶的組成成分；喋吟啼碇及其衍生物主要功能是構(gòu)成核酸和輔酶；

5水

構(gòu)成菌體細(xì)胞，營養(yǎng)物質(zhì)傳遞的介質(zhì)；

深井水，自來水，地表水，蒸儲水；

6產(chǎn)物形成的前體，促進劑，抑制劑

1）前體

加入培養(yǎng)基后，能直接被微生物在生物合成中結(jié)合到產(chǎn)物中去，提高產(chǎn)量的物質(zhì)；如

苯乙酸是合成青霉素G的前體，丙酸是合成紅霉素的前體；

有些前體高濃度時對菌體有毒害作用；少量多次；

2）促進劑

機制:

促進生長，提高菌體抗自溶能力，縮短發(fā)酵周期，增加產(chǎn)物積累；如巴比妥增加鏈霉素

產(chǎn)生菌的抗自溶能力；

降低產(chǎn)生菌的呼吸來加快產(chǎn)物的合成，提高產(chǎn)量；

改變培養(yǎng)基的物理條件，達(dá)到改善通氣效果，增加細(xì)胞滲透性的目的，從而提高產(chǎn)物合

成；與產(chǎn)物形成不溶性復(fù)鹽，在發(fā)酵液中沉淀，降低產(chǎn)物濃度，解除反饋抑制作用；

3）抑制劑

抑制某些不需要的產(chǎn)物形成；

酵母厭氧發(fā)酵時加亞硫酸鹽或堿，使酒精發(fā)酵變?yōu)楦视桶l(fā)酵；

四環(huán)素發(fā)酵中，加演化物抑制金霉素的形成；

常壓蒸汽滅菌時，為殺死芽泡，可用的方法有

和

高壓蒸汽滅菌后，培養(yǎng)基的pH一般會；

葡萄糖高壓滅菌后會受到破壞，解決辦法有；

微生物工業(yè)匕培養(yǎng)基滅菌一般采用溫時；

培養(yǎng)基中含有機物濃度高時，滅菌時間應(yīng)；

微生物工業(yè)上，空氣除菌流程包括；

固體料要搶溫接種，堆積起溫，原因是什么；

葡萄糖是速效碳源，使用時應(yīng)注意什么；

舉例：生理酸性鹽，生理堿性鹽；

繪制通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)模式圖；

二）培養(yǎng)基的類型

1）選擇性培養(yǎng)基

根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求或其對某化學(xué)物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，使混合

菌樣中的劣勢菌變優(yōu)勢菌；

如分離能分解纖維素或石蠟油的微生物，以纖維素或石蠟油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基；

分離產(chǎn)胞外蛋白酶的微生物，以蛋白質(zhì)做唯一氮源的選擇培養(yǎng)基；

分離酵母菌，霉菌，培養(yǎng)基中加青霉素，四環(huán)素，鏈霉素，抑制細(xì)菌放線菌；

分離革蘭氏陰性細(xì)菌，加染料亮綠或結(jié)晶紫，抑制革蘭氏陽性細(xì)菌.；

2）鑒別培養(yǎng)基

添加能與某菌的無色代謝物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑；如伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基；

2按培養(yǎng)基用途劃分

1）抱子培養(yǎng)基

使微生物形成大量的抱子；

營養(yǎng)不能太豐富，特別是有機氮源要低些；

效皮培養(yǎng)基，大（?。┟着囵B(yǎng)基，葡萄糖（淀粉）無機鹽蛋白陳培養(yǎng)基

2）種子培養(yǎng)基

供抱子萌發(fā)生長的培養(yǎng)基；

營養(yǎng)成分豐富完全；包括有機無機氮源，有機氮源有利于刺激抱子萌發(fā)，無機氮源易利

用，利于菌體快速生長；

3）發(fā)酵培養(yǎng)基

供菌體生長繁殖合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基；

速效與遲效營養(yǎng)搭配，速效少用，遲效多用，流加或補料；因為菌體在半饑餓狀態(tài)下更

有利于產(chǎn)物合成；

三）培養(yǎng)基配制基本原則

1適宜營養(yǎng)成分

根據(jù)微生物類型選擇：

牛肉膏蛋白豚培養(yǎng)基（普通肉湯培養(yǎng)基）培養(yǎng)細(xì)菌；

高氏一號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌;

麥芽汁培養(yǎng)基部養(yǎng)酵母菌；

查氏合成培養(yǎng)基培養(yǎng)霉菌；

經(jīng)濟：

生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白時，常利用糖蜜（制糖工業(yè)中含蔗糖的廢液），乳清（乳制品工業(yè)中含

乳糖的廢液），豆制品工業(yè)廢液及黑廢液（造紙工業(yè)的亞硫酸紙漿）；

甲烷發(fā)酵利用廢水廢渣，人畜糞便及禾草；農(nóng)副產(chǎn)品或制品，如數(shù)皮，米糠，玉米漿，

酵母浸膏，酒糟，豆餅，花生餅，蛋白陳；

2濃度及配比合適

濃度過低時不能滿足生長，濃度過高抑制生長，如高濃度糖類物質(zhì)，無機鹽，重金屬離

子抑菌或殺菌；C/N；

3物理化學(xué)條件適宜

細(xì)菌適宜pH7-8；

放線菌適宜pII7.5-8.5；

酵母適宜pH3.8-6；

霉菌適宜pH4-5.8；

加緩沖劑：磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，在P1I6.4-7.2范圍內(nèi)起調(diào)節(jié)作用；

乳酸菌產(chǎn)酸，加碳酸鈣調(diào)節(jié)；

4其他

滅菌的影響：長時間高溫引起磷酸鹽，碳酸鹽與某些陽離子（鈣鎂鐵）結(jié)合形成難溶性

復(fù)鹽；含鈣鎂鐵的成分與磷酸鹽碳酸鹽分開滅菌，再混合；

四）培養(yǎng)基的制備

1原料的預(yù)處理

用來培養(yǎng)食用真菌的秸桿，糞土，棉籽殼，先建堆發(fā)醉；

生產(chǎn)酒精，丙酮時，淀粉先蒸煮，糖化；

酒精發(fā)酵時，糖蜜先稀釋，酸化，滅菌，澄清，加營養(yǎng)鹽;

檸檬酸生產(chǎn)中，使用糖蜜做原料時，加黃血鹽去除鐵離子；

2配制流程

1）稱量，溶解：

2）調(diào)pH：固體培養(yǎng)基pH調(diào)整在加瓊脂前進行；

3）過濾澄清：紗布過濾，棉花過濾；

4）分裝，加棉塞：斜面裝1/4,平板15-18mL三角瓶1/2-2/3,裝棉塞，牛皮紙包

扎；

5）滅菌，倒皿，擺斜面：

三微生物分離培養(yǎng)技術(shù)

-）固體培養(yǎng)基分離純化

1稀釋平板分離

2劃線法分離

3稀釋搖管法：分離厭氧菌；

二）液體培養(yǎng)基分離純化

并不是所有微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，許多原生動物和藻類，細(xì)菌，需用液體培

養(yǎng)基分離；

稀釋法，每一試管中分配不到一個微生物；

三）單細(xì)胞分離

較大的藻類，原生動物較容易，較小的細(xì)菌較難；

解剖顯微鏡，顯微操作儀；

四）選擇培養(yǎng)分離1選擇培養(yǎng)基

從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時.，培養(yǎng)基中加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)蛋白酶水

解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈；

分離高溫菌，在高溫條件下培養(yǎng);

分離抗生素抗性菌株，在加有抗生素的平板上分離；

2富集培養(yǎng)

制定特定環(huán)境條件，第三節(jié)微生物發(fā)酵過程以及控制

-常見微生物發(fā)酵類型及設(shè)備

-）微生物發(fā)酵類型

1按終產(chǎn)品分

1）微生物菌體發(fā)酵

酵母發(fā)酵；

微生物菌體蛋白發(fā)酵；

藥用真菌發(fā)酵，可通過發(fā)酵培養(yǎng)手段生產(chǎn)出與天然產(chǎn)品具相同療效的產(chǎn)物;

微生物殺蟲劑，如蘇云金桿菌，蠟樣芽泡桿菌，白僵菌，綠僵菌；

使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長；

五）二元培養(yǎng)

保存病毒；銀耳與香灰菌絲

2）微生物酶發(fā)酵

微生物生產(chǎn)的淀粉酶和糖化酶用于生產(chǎn)葡萄糖；

膽固醇氧化酶用于檢查血清中膽固醇的含量；

葡萄糖氧化酶用于檢查血中葡萄糖的含量；

3）微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵

初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苜酸，蛋白質(zhì)，核酸，糖類；

次級代謝產(chǎn)物：抗生素，生物堿，細(xì)菌毒素，植物生長因子；

4）微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵

利用菌體將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸的醋酸發(fā)酵;

將異丙醇轉(zhuǎn)化成丙醇，甘油轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮，解類轉(zhuǎn)化，抗生素的生物轉(zhuǎn)化；

5）生物工程細(xì)胞的發(fā)酵

基因工程菌生產(chǎn)胰島素，干擾素，青霉素?；?，用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)用于治療和診斷的

各種單克隆抗體；

2按物料和產(chǎn)物的進出方式分

1）分批發(fā)酵

發(fā)酵過程中所有物料（除空氣，消泡劑，酸堿）一次加入發(fā)酵罐，滅菌，接種，培養(yǎng)，

產(chǎn)物回收；

檸檬酸，氨基酸，抗生素，維生素

2）連續(xù)發(fā)酵

發(fā)酵過程中，以一定的速度向罐內(nèi)連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，以相同速度排出含有產(chǎn)品的培

養(yǎng)液；發(fā)酵周期長，菌種易變異；

3）補料分批發(fā)酵

流加；微生物分批培養(yǎng)過程中向反應(yīng)器中間歇或連續(xù)補加一種或一種以上特定的限制性

底物，反應(yīng)后一次排出培養(yǎng)液；

使基質(zhì)濃度保持在較低水平，解除或減小了底物與產(chǎn)物的抑制與阻遏作用；不會產(chǎn)生菌

種變異，物料污染問題，終產(chǎn)物濃度高；

單細(xì)胞蛋白，氨基酸，生長激素，抗生素，維生素，腋制劑，有機酸，有機溶劑，核甘

酸；

二）發(fā)酵設(shè)備

1固態(tài)發(fā)酵設(shè)備

蘑菇栽培的發(fā)酵架，發(fā)酵室；釀酒用的發(fā)酵缸；制曲的曲盤；通風(fēng)制曲設(shè)備；

發(fā)酵工藝控制難

2液態(tài)發(fā)酵設(shè)備

1）厭氧發(fā)酵設(shè)備

啤酒，酒精發(fā)酵；不通氧，不攪拌;

第一章應(yīng)用微生物學(xué)基本技術(shù)

第二節(jié)微生物基本操作技術(shù)

一無菌操作技術(shù)

■）滅菌方法

1干熱滅菌

1）灼燒滅菌法：接種環(huán)，接種針或其他金屬用具，試管和三角瓶口；

2）干熱空氣滅菌法：烘箱，干燥箱的熱空氣170℃殺死微生物；玻璃器皿如吸管平板，

金屬用具等，凡不適于用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品；

2濕熱滅菌

1）常壓蒸汽滅菌：

常壓條件下，在不能密閉的容器內(nèi)滅菌；

不具備高壓蒸汽滅菌情況下，或不宜高壓蒸煮的物質(zhì)如糖液，牛奶，明膠；

溫度不超過100C,大多數(shù)微生物被殺死，芽抱細(xì)菌短時間不能殺死

常壓蒸汽持續(xù)滅菌：持續(xù)加熱6-8h；

間歇滅菌：芽泡100℃短時間內(nèi)不會失活而微生物營養(yǎng)體半小時即被殺死，芽胞萌發(fā)后

耐熱性消失，通過反復(fù)培養(yǎng)反復(fù)滅菌；操作：先用100℃,30-60min殺死營養(yǎng)體，然后將

含芽胞的培養(yǎng)基室溫24h,使其萌發(fā)，再滅菌一次；經(jīng)2次培養(yǎng)3次反復(fù)蒸煮，達(dá)到完全

無菌；

2）高壓蒸汽滅菌：

穿透力強，效果最好；

常用于培養(yǎng)基的滅菌；

培養(yǎng)基中某些成分分解氧化，酸度增加，pH下降0.2-0.3；

葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)破壞，并形成-引起渾濁和沉淀；葡萄糖溶液分別滅菌，壓力盡可能

低些3過濾除菌

含菌液體或氣體通過細(xì)菌濾器，使雜菌留在濾器或濾板上;

細(xì)菌過濾器是由孔徑極小，能阻擋細(xì)菌的陶瓷，硅藻土，石棉或玻璃粉制成；

為加快過濾，抽氣減壓；

用于多汁不宜用濕熱滅菌的液體物質(zhì)，如抗生素，血清，糖；發(fā)酵工業(yè)中無菌空氣的制

備；4紫外線殺菌

260nm波長的紫外線；

穿透力弱，只用于表面殺菌和空氣滅菌；實驗室，接種室，接種箱，手術(shù)室，藥廠的包

裝室；對眼黏膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用；

5化學(xué)藥劑消毒殺菌

殺菌劑：如重金屬離子，某此強氧化劑；

抑菌劑：磺胺類，抗生素制劑；

表1-1;

-）滅菌在微生物工業(yè)的應(yīng)用

1培養(yǎng)基的滅菌

1）溫度

高溫濕熱短時滅菌；

不但滅菌時間短，而且培養(yǎng)基成分破壞?。?/p>

但溫度高，對設(shè)備要求嚴(yán)格；120℃；

2）操作方式

分批滅菌：配制好的培養(yǎng)基置發(fā)酵罐中，通入蒸汽，達(dá)到預(yù)定溫度后維持一段時間，再

冷卻到發(fā)酵所需溫度；又稱實罐滅菌，間歇滅菌；

適于小型發(fā)酵工廠；不須專門滅菌設(shè)備，操作簡單易行，投資少，滅菌效果好；

缺點：加熱和冷卻所需時間長，營養(yǎng)破壞大；發(fā)酵罐利用率低，不適合大規(guī)模生產(chǎn)過程

的滅菌；

連續(xù)滅菌：在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地加溫，保溫，再冷卻，把滅菌培養(yǎng)基加入已滅菌發(fā)酵

罐的滅菌方式；

如培養(yǎng)基輸入加熱塔，滅菌溫度132℃,塔內(nèi)停留20—30秒；維持罐5—7min；圖1-

4；優(yōu)點：高溫短時滅菌，對營養(yǎng)破壞?。患訜峥?，冷卻快，滅菌時間短，設(shè)備利用率

高；缺點：設(shè)備投資大，當(dāng)培養(yǎng)基含固體顆料或易產(chǎn)生較多泡沫時，易造成局部滅菌不

充分與管道堵塞；

3）影響滅菌的因素

培養(yǎng)基成分：

培養(yǎng)基中所含糖類，油脂，蛋白質(zhì)含量高，微生物死亡速率慢；高濃度有機物增加培養(yǎng)

基的黏度，影響熱的傳入，因而需較高的滅菌溫度；

高濃度的鹽增加滲透壓，促進熱的傳導(dǎo)，降低微生物的耐熱性，易于滅菌；

培養(yǎng)基的物理狀態(tài)：

顆粒大和結(jié)塊的傳熱效果差，滅菌困難，有時需提高滅菌溫度，延長滅菌時間；pH：

6-8時，微生物最耐熱；小于6時，氫離子易滲入細(xì)胞內(nèi)，促使其死亡；pH越低，滅菌

時間越短；

培養(yǎng)基中污染菌的數(shù)量，菌齡，耐熱性：

雜菌數(shù)量多，滅菌時間長；營養(yǎng)體，酵母，霉菌的菌絲體對熱敏感，抱子和芽抱耐熱性

強；泡沫：

泡沫的空氣形成隔熱層，空氣導(dǎo)熱差，包裹在泡沫中的微生物不易被殺死；因此滅菌操

作注意泡沫的產(chǎn)生，防止壓力驟降而起泡

2發(fā)酵設(shè)備及管道和附屬設(shè)備的滅菌

發(fā)酵罐：空罐滅菌；實罐滅菌；

管道：蒸汽滅菌；

過濾器：蒸汽滅菌；蒸汽壓力0.2Mpa左右，不可過大，45-60min,然后通入壓縮空氣

吹干；3空氣除菌

過濾除菌：讓含菌空氣通過過濾介質(zhì)時，利用介質(zhì)阻截空氣中的微生物，取得無菌空

氣；過濾介質(zhì)：棉花，活性炭，玻璃介質(zhì)，有機合成纖維，燒結(jié)材料

空氣除菌設(shè)備流程；

粗過濾器，壓縮機，貯罐，冷卻器，旋風(fēng)分離器，冷卻器，絲網(wǎng)過濾器，加熱器，過濾

器；

1）采氣：含菌少的空氣：采氣口距地面20-30m；郊區(qū)；

2）粗過濾器：捕集較大的灰塵顆粒；

3）空壓機：能耗大；

4）儲氣罐：高溫除菌；

5）冷卻器：空氣經(jīng)壓縮機后可達(dá)120℃高溫，若不冷卻會燒焦過濾介質(zhì)；立式列管式熱

交換器，沉浸式熱交換器，噴淋式熱交換器；

6）油水分離器：空氣經(jīng)壓縮機后會帶上一些潤滑油；空氣冷卻后，水汽凝結(jié)成水滴；

7）加熱器：空氣濕度仍較大；通過加熱，降低空氣濕度；

8）總過濾器，分過濾器

三）微生物的接種技術(shù)

斜面接種，液體接種，固體接種；

接種環(huán)，接種針，玻璃刮鏟，移液管，移液槍；

小規(guī)模：無菌接種箱，超凈工作臺；

大規(guī)模：無菌室；

工業(yè)：

管道壓力差接種法，

即利用壓力泵，

把種子液從種子罐

抽入發(fā)酵罐；

1無菌室的滅菌

1）熏蒸：

先將室內(nèi)打掃干凈，通風(fēng)干燥后，重新關(guān)閉，熏蒸滅菌；福爾馬林（37-40%甲醛水溶

液），取6T0ml/m3,盛于鐵制容器中，利用電爐或酒精燈直接加熱，或加高鎰酸鉀，通

過氧化作用加熱，使福爾馬林蒸發(fā)；熏蒸后密閉12h以上；使用無菌室前l(fā)-2h,取與甲醛

溶液等量的氨水，倒入搪瓷盤內(nèi)揮發(fā)中和，以減輕刺激作用；或用乳酸，硫磺熏蒸滅菌；

2）紫外線滅菌：接種前后，打開紫外燈0.5h；

3）石炭酸噴霧：每次操作前，取5%石炭酸噴于接種室臺面和地面；

2接種方法

1）試管接種

2）液體接種

斜面菌種接種液體培養(yǎng)基：

液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基：

液體菌種接種固體平板：

3）固體接種

菌液接種固體料：

固體種子接種固體料：

搶溫接種：在固體料滅菌后不要使料溫降得過低才接種，而在料溫高于培養(yǎng)溫度5T0C

接種；可使培養(yǎng)基在接種后得到適宜的溫度條件，能迅速生長繁殖，長勢好，雜菌不易滋

生；適于芽泡菌和產(chǎn)生胞子的菌接種；

堆積起溫：大量的固體曲料接種后，不要立即分裝曲盤或上簾，先堆積起來，上加覆蓋

物，防止散熱，使培養(yǎng)菌適應(yīng)新環(huán)境條件，逐漸生長旺盛，產(chǎn)生較大熱量使料溫升高，再

分裝一定容器中培養(yǎng)；這樣可避免一開始培養(yǎng)菌繁殖慢，料溫上不去，拖延培養(yǎng)時間，水

分蒸發(fā)大，雜菌易發(fā)展等缺點；

常壓蒸汽滅菌時，為殺死芽抱，方法有；

高壓蒸汽滅菌后，培養(yǎng)基的pH一般會；

葡萄糖高壓滅菌后會受到破壞，解決辦法有；

微生物工業(yè)上，培養(yǎng)基滅菌采用溫時；

培養(yǎng)基中含有機物濃度高時，滅菌時間應(yīng)；

繪制通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)模式圖；

繪制連續(xù)滅菌流程圖;

微生物工業(yè)上，空氣除菌流程包括；

如何對無菌室進行滅菌：

固體料要搶溫接種，堆積起溫，原因是什么；

二培養(yǎng)基及其制備

一）培養(yǎng)基的成分及來源

1碳源：

糖：多數(shù)微生物利用糖作碳源；

單糖優(yōu)于雙糖多糖，已糖優(yōu)于戊糖，葡萄糖果糖優(yōu)于甘露糖，半乳糖；純多糖優(yōu)于雜多

糖；葡萄糖是最易利用的碳源，速效碳源；

但高濃度葡萄糖加速菌體代謝，溶解氧不能滿足需要；

中間代謝物如乳酸丙酮酸不能完全氧化積累在菌體或培養(yǎng)基中，pH下降，微生物受到抑

制；

淀粉為長效碳源，利用較慢，高濃度不會對微生物產(chǎn)生不利影響

油脂：豆油，菜籽油；某些霉菌和放線菌可利用油脂作碳源；

有機酸：單細(xì)胞蛋白，氨基酸，維生素和某些抗生素的生產(chǎn)可利用乙酸鹽，檸檬酸鹽作

碳源；醇，短：一些甲烷氧化菌只利用甲烷和甲醇作碳源；

2氮源

有機氮：

黃豆餅粉，花生餅粉，棉籽餅粉，玉米漿，蛋白陳，酵母粉，魚粉；

含豐富蛋白質(zhì)，氨基酸，含少量糖類，脂肪，生長因子；微生物在有機氮源培養(yǎng)基中生

長旺盛；

無機氮：

氨水，硫酸筱，氯化銹，硝酸鹽；

速效氮源;

引起pH變化；鏤鹽利用后，pH下降，稱生理酸性鹽；硝酸鹽利用后pH上升，稱生理堿

性鹽；氨水作補充氮源，調(diào)節(jié)pH；

玉米漿：是制玉米淀粉的副產(chǎn)物；

將玉米粒先用亞硫酸浸泡，浸泡液濃縮即制成黃褐色的液體，叫玉米漿；

3無機鹽和微量元素

磷酸鹽，硫酸鹽，氯化鈉，氯化鉀，微量元素如鎂鐵鉆鋅缽；低濃度時對微生物有促進

作用，高濃度則表現(xiàn)出明顯的抑制作用；

功能：

構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分（磷硫等）；

作為能的組分或某些醐的輔醐或酷的激活劑，如鎂鐵鎰鋅鉆；

調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和影響細(xì)胞膜的通透性，如氯化鈉，氯化鉀；

參與產(chǎn)物的生物合成；

需求量很低；天然培養(yǎng)基的碳氮源本身含一定量的微量元素，配制時一般不需單獨加

入；磷酸氫二鉀，硫酸鎂；

3無機鹽和微量元素

磷酸鹽，硫酸鹽，氯化鈉，氯化鉀，微量元素如鎂鐵鉆鋅鎰；低濃度時對微生物有促進

作用，高濃度則表現(xiàn)出明顯的抑制作用；

功能：

構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分（磷硫等）；

作為酶的組分或某些酶的輔酶或酶的激活劑，如鎂鐵缽鋅鉆；

調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和影響細(xì)胞膜的通透性，如氯化鈉，氯化鉀；

參與產(chǎn)物的生物合成；

需求量很低；天然培養(yǎng)基的碳氮源本身含一定量的微量元素，配制時一般不需單獨加

入；磷酸氫二鉀，硫酸鎂；

4生長因子

維生素，氨基酸，喋吟，喀咤的衍生物及脂肪酸；

維生素是輔酶的組成成分；

喋吟喙唬及其衍生物主要功能是構(gòu)成核酸和輔酶；

5水

構(gòu)成菌體細(xì)胞，營養(yǎng)物質(zhì)傳遞的介質(zhì)；

深井水，自來水，地表水，蒸播水；

6產(chǎn)物形成的前體，促進劑，抑制劑

1）前體

加入培養(yǎng)基后，能直接被微生物在生物合成中結(jié)合到產(chǎn)物中去，提高產(chǎn)量的物質(zhì)；如

苯乙酸是合成青霉素G的前體，丙酸是合成紅霉素的前體；

有些前體高濃度時對菌體有毒害作用；少量多次；

2）促進劑

機制：

促進生長；

提高菌體抗自溶能力，縮短發(fā)酵周期，增加產(chǎn)物積累；如巴比妥增加鏈霉素產(chǎn)生菌的抗

自溶能力；

降低產(chǎn)生菌的呼吸來加快產(chǎn)物的合成，提高產(chǎn)量；

改變培養(yǎng)基的物理條件，達(dá)到改善通氣效果，增加細(xì)胞滲透性的目的，從而提高產(chǎn)物合

成：與產(chǎn)物形成不溶性復(fù)鹽，在發(fā)酵液中沉淀，降低產(chǎn)物濃度，解除反饋抑制作用

3）抑制劑

抑制某些不需要的產(chǎn)物形成；

酵母厭氧發(fā)酵時加亞硫酸鹽或堿，使酒精發(fā)酵變?yōu)樨ビ桶l(fā)酵；

四環(huán)素發(fā)酵中，加演化物抑制金霉素的形成；

表1-3；

二）培養(yǎng)基的類型

1）選擇性培養(yǎng)基

根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求或其對某化學(xué)物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，使混合

菌樣中的劣勢菌變優(yōu)勢菌；

如分離能分解纖維素或石蠟油的微生物，以纖維素或石蠟油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基；

分離產(chǎn)胞外蛋白酶的微生物，以蛋白質(zhì)做唯?氮源的選擇培養(yǎng)基；

分離酵母菌，霉菌，培養(yǎng)基中加青霉素，四環(huán)素，鏈霉素，抑制細(xì)菌放線菌；

分離革蘭氏陰性細(xì)菌，加染料亮綠或結(jié)品紫，抑制革蘭氏陽性細(xì)菌；

2）鑒別培養(yǎng)基

添加能與某菌的無色代謝物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑；如伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基；

2按培養(yǎng)基用途劃分

1）抱子培養(yǎng)基

使微生物形成大量的抱子；

營養(yǎng)不能太豐富，特別是有機氮源要低些；

秋皮培養(yǎng)基，大（?。┟着囵B(yǎng)基，葡萄糖（淀粉）無機鹽蛋白陳培養(yǎng)基

2）種子培養(yǎng)基

供抱子萌發(fā)生長的培養(yǎng)基；

營養(yǎng)成分豐富完全；包括有機無機氮源，有機氮源有利于刺激獨子萌發(fā)，無機氮源易利

用，利于菌體快速生長；

3）發(fā)酵培養(yǎng)基

供菌體生長繁殖合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基；

菌體在半饑餓狀態(tài)下更有利于產(chǎn)物合成；

速效與遲效營養(yǎng)搭配，速效少用，遲效多用；

流加或補料;

i）培養(yǎng)基配制基本原則

1適宜營養(yǎng)成分

根據(jù)微生物類型選擇：

牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基（普通肉湯培養(yǎng)基）培養(yǎng)細(xì)菌；

高氏一號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌；

麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌；

查氏合成培養(yǎng)基培養(yǎng)霉菌；

經(jīng)濟：

生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白時，常利用糖蜜（制糖工業(yè)中含蔗糖的廢液），乳清（乳制品工業(yè)中含

乳糖的廢液），豆制品工業(yè)廢液及造紙工業(yè)的亞硫酸紙漿；

甲烷發(fā)酵利用廢水廢渣，人畜糞便及禾草；農(nóng)副產(chǎn)品或制品，如數(shù)皮，米糠，玉米漿，

酵母浸膏，酒糟，豆餅，花生餅，蛋白豚；

2濃度及配比合適

濃度過低時不能滿足生長，濃度過高抑制生長，如高濃度糖類物質(zhì)，無機鹽，重金屬離

子抑菌或殺菌；C/N；

3物理化學(xué)條件適宜

細(xì)菌適宜pl17-8；

放線菌適宜pH7.5-8.5；

酵母適宜pH3.8-6；

霉菌適宜PII4-5.8；

加緩沖劑：磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，在PH6.4-7.2范圍內(nèi)起調(diào)節(jié)作用；

乳酸菌產(chǎn)酸，加碳酸鈣調(diào)節(jié)；

4其他

滅菌的影響：長時間高溫引起磷酸鹽，碳酸鹽與某些陽離子（鈣鎂鐵）結(jié)合形成難溶性

復(fù)鹽；含鈣鎂鐵的成分與磷酸鹽碳酸鹽分開滅菌，再混合；

四）培養(yǎng)基的制備

1原料的預(yù)處理

用來培養(yǎng)食用菌的秸桿，糞土，棉籽殼，先建堆發(fā)酵；

生產(chǎn)酒精，丙酮時，淀粉先蒸煮，糖化；

酒精發(fā)酵時，糖蜜先稀釋，酸化，滅菌，澄清，加營養(yǎng)鹽；

檸檬酸生產(chǎn)中，使用糖蜜做原料時，加黃血鹽去除鐵離子；

2配制流程

1）稱量，溶解：

2）調(diào)pH：固體培養(yǎng)基pH調(diào)整在加瓊脂前進行；

3）過濾澄清：紗布過濾，棉花過濾；

4）分裝，加棉塞：斜面裝1/4,平板三角瓶1/2-2/3,裝棉塞，牛皮紙包

扎；

5）滅菌，倒皿，擺斜面

葡萄糖是速效碳源，使用時應(yīng)注意什么；

配制培養(yǎng)基時，常加入的無機鹽有；

舉例：生理酸性鹽，生理堿性鹽；

三微生物分離培養(yǎng)技術(shù)

-）固體培養(yǎng)基分離純化

1稀釋平板分離

2劃線法分離

3稀釋搖管法：分離厭氧菌；

二）液體培養(yǎng)基分離純化

并不是所有微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，許多原生動物和藻類，細(xì)菌，需用液體培

養(yǎng)基分離；

稀釋法，每一試管中分配不到一個微生物；

三）單細(xì)胞分離

較大的藻類，原生動物較容易，較小的細(xì)菌較難；

解剖顯微鏡，顯微操作儀；

四）選擇培養(yǎng)分離

1選擇培養(yǎng)基

從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時，培養(yǎng)基中加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)蛋白酶水

解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈；

分離高溫菌，在高溫條件下培養(yǎng)；

分離抗生素抗性菌株，在加有抗生素的平板上分離；

2富集培養(yǎng)

制定特定環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長；

五）二元培養(yǎng)

保存病毒；銀耳與香灰菌絲；

第三節(jié)微生物發(fā)酵過程以及控制

-常見微生物發(fā)酵類型及設(shè)備

-）微生物發(fā)酵類型

1按終產(chǎn)品分

1）微生物菌體發(fā)酵

酵母發(fā)酵；

微生物菌體蛋白發(fā)酵；

藥用真菌發(fā)酵，可通過發(fā)酵培養(yǎng)手段生產(chǎn)出與天然產(chǎn)品具相同療效的產(chǎn)物：

微生物殺蟲劑，如蘇云金桿菌，蠟樣芽抱桿菌，白僵菌，綠僵菌;

2）微生物能發(fā)酵

微生物生產(chǎn)的淀粉酶和糖化酶用于生產(chǎn)葡萄糖；

膽固醇氧化酶用于檢查血清中膽固醇的含量；

葡萄糖氧化能用于檢查血中葡萄糖的含量；

3）微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵

初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核甘酸，蛋臼質(zhì)，核酸，糖類；

次級代謝產(chǎn)物：抗生素，生物堿，細(xì)菌毒素，植物生長因子；

4）微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵

利用菌體招乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸的醋酸發(fā)酵；

將異丙醇轉(zhuǎn)化成丙醇，甘油轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮，備類轉(zhuǎn)化，抗生素的生物轉(zhuǎn)化；

5）生物工程細(xì)胞的發(fā)酵

基因工程菌生產(chǎn)胰島素，干擾素，青霉素?；?，用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)用于治療和診斷的

各種單克隆抗體

2按物料和產(chǎn)物的進出方式分

1）分批發(fā)酵

發(fā)酵過程中所有物料（除空氣，消泡劑，酸堿）一次加入發(fā)酵罐，滅菌，接種，培養(yǎng)，

產(chǎn)物回收；檸檬酸，朝基酸，抗生素，維生素；

2）連續(xù)發(fā)酵

發(fā)酵過程中，以一定的速度向罐內(nèi)連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，以相同速度排出含有產(chǎn)品的培

養(yǎng)液；發(fā)酵周期長，菌種易變異；

3）補料分批發(fā)酵

流加；微生物分批培養(yǎng)過程中向反應(yīng)器中間歇或連續(xù)補加一種或一種以上特定的限制性

底物，反應(yīng)后一次排出培養(yǎng)液；

使基質(zhì)濃度保持在較低水平，解除或減小了底物與產(chǎn)物的抑制與阻遏作用；不會產(chǎn)生菌

種變異，物料污染問題，終產(chǎn)物濃度高；

單細(xì)胞蛋白，氨基酸，生長激素，抗生素，維生素，腋制劑，有機酸，有機溶劑，核甘

酸；

二）發(fā)酵設(shè)備

1固態(tài)發(fā)酵設(shè)備

蘑菇栽培的發(fā)酵架，發(fā)酵室；釀酒用的發(fā)酵缸；制曲的曲盤；通風(fēng)制曲設(shè)備；

發(fā)酵工藝控制難

2）好氧發(fā)酵設(shè)備

機械攪拌式發(fā)酵罐；通用式，自吸式，伍氏；

外部液體攪拌式發(fā)酵罐：罐外的循環(huán)泵攪動；

空氣噴射提升式發(fā)酵罐：靠壓縮空氣攪動發(fā)酵液，使氣液混合增加溶氧；

2工藝要點

1）接種

保藏種到斜面到搖瓶：接種環(huán)；

搖瓶到種子罐：火焰接種；打開種子罐接種孔，接種孔周圍放酒精棉球，點著，把搖瓶

口在火焰上灼燒后，把里面種子液迅速倒入發(fā)酵罐中；用火燒接種口蓋子內(nèi)側(cè)，蓋上，擰

緊；種子罐到種子罐：管道化壓差接種法；罐之間用管道連接，利用壓力差把一個罐中

液體加入另一罐中；

接種量：卜20煙視菌種生長速度而定；

接種齡：對數(shù)生長期；生長速度最快，生活力最強；

3培養(yǎng)條件

1）溫度

最適生長溫度附近，可縮短緩慢期；

2）pH

生長最適川；保持pH穩(wěn)定：加酸堿，緩沖液，生理酸性堿性鹽；

3）通氣

不同生理時期需氧量不同；攪拌;

4）泡沫

影響微生物對氧的吸收，妨礙二氧化碳的排除；

4種子罐的級數(shù)

菌種性質(zhì)：菌種傳代后的穩(wěn)定性，產(chǎn)生的胞子數(shù)，菌絲繁殖速度；

發(fā)酵罐中種子的最低接種量，種子罐與發(fā)酵罐的容積比；

三微生物發(fā)酵控制

-）溫度

1變化

前低中高，后回落；

發(fā)酵熱=生物熱+攪拌熱-蒸發(fā)熱-輻射熱

2影響

1）菌體生長最適溫度：溫度升高，酶反應(yīng)速度加快，呼吸代謝加強，微生物生長繁殖

加快；但酶失活速度加快，蛋白質(zhì)變性加快，死亡加快；

2）產(chǎn)物合成最適溫度：影響產(chǎn)物合成速度；影響產(chǎn)物合成方向：

如四環(huán)素發(fā)酵中，金色鏈霉菌低于30℃時，合成金霉素能力強；超過35c時，合成四

環(huán)素；3選擇

分段選擇；

青霉素產(chǎn)生菌最佳生長溫度30℃,合成青霉素最適溫度24。。；

生長初期：使菌體大量繁殖，最佳生長溫度；

生產(chǎn)期：產(chǎn)物合成溫度；

4控制

一般需降溫；冷卻裝置；

二）pH

1影響

2變化

對基質(zhì)的利用：碳源過多導(dǎo)致pH下降；C/N高，培養(yǎng)基偏酸性；反之，偏堿性；尿素被

分解時筱離子濃度增加，pH上升；

代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生；

規(guī)律：生長期pH上升或下降，產(chǎn)物合成期pH穩(wěn)定，自溶階段pH上升；

3選擇

生長最適川；產(chǎn)物合成最適pl【；

4控制

控制原始pH；控制培養(yǎng)基中各成分配比C/N；加緩沖液；

發(fā)酵過程中加酸堿；

通過補料控制；

三）氧氣

1影響

生產(chǎn)菌種；

菌體濃度增加，需氧量增大；

菌齡：對數(shù)期和穩(wěn)定期需氧量大，延滯期和衰亡期需氧量較??；

3控制攪拌效率；

增加通氣量；

通入純氧；

提高罐壓；

補水稀釋培養(yǎng)液；

降低培養(yǎng)溫度;

四）基質(zhì)濃度

1影響

生長-基質(zhì)關(guān)系：圖1T3；如葡萄糖濃度低于100T50g/L時;不出現(xiàn)生長抑制；大于

350-500g/L時，多數(shù)生物不能生長；

培養(yǎng)基過于豐富對產(chǎn)物合成不利：

2控制

補料控制：如谷氨酸的生產(chǎn)中，控制低水平的基質(zhì)濃度，流加尿素；青霉素生產(chǎn)中，流

加葡萄糖；

五）泡沫

蛋白質(zhì)與氣泡混合成泡沫；

1影響

大量逃液，減少發(fā)酵液的體積，增加雜菌污染的機會；

2控制

機械消泡：

化學(xué)消泡：油脂；合成消泡劑如聚氧丙基甘油酸，聚氧乙烷丙烷甘油酸，十八醇，聚二

醇，硅樹脂類，二甲基硅樹脂油；

六）發(fā)酵終點

產(chǎn)物產(chǎn)量，

過濾速度，

發(fā)酵液外觀與黏度，

pH,

菌體形態(tài)；

七）染菌

1染菌的檢查

1）將樣品在無菌平板上劃線，37℃,28℃培養(yǎng)，8h后觀察；

2）顯微鏡觀察：革蘭氏染色；

3）肉湯培養(yǎng)法：噬菌體檢查，培養(yǎng)基及無菌空氣無菌檢查；

異?，F(xiàn)象：

溶解氧：感染細(xì)菌，噬菌體；

P1I變化：雜菌產(chǎn)酸；

排氣組分：

酶的變化：

糖代謝異常：

如噬菌體污染：糖氮消耗遲緩，pH異常，產(chǎn)大量泡沫，發(fā)酵液黏稠，產(chǎn)物減少或停止,

菌體自溶

2原因

培養(yǎng)基滅菌不徹底；

種子帶菌；

發(fā)酵設(shè)備滅菌不徹底或設(shè)備泄漏；

空氣帶菌；

第四節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物提取與加工

發(fā)酵液預(yù)處理與固液分離，提取，精制，成品加工；

根據(jù)：目的物分子量，結(jié)構(gòu)，極性，兩性電解質(zhì)性質(zhì)，溶解性，沸點，對pH溫度溶劑

的敏感性；

一發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離

-）預(yù)處理

1雜蛋白：等電點法，熱沉淀，鹽析法，有機溶劑沉淀；

2高價金屬離子：鈣鎂：草酸，磷酸：鐵：黃血鹽;

二）過濾

助濾劑：硅藻土，珍珠巖粉，活性炭；

反應(yīng)劑：加磷酸氫鈉，氯化鈣，形成磷酸三鈣，將菌體及其他懸浮的粒子凝聚沉降；

三）細(xì)胞破碎

化學(xué)（堿或去污劑裂解，溶劑浸出），酶法，物理法（凍融，加熱裂解，滲透壓破裂

法，超聲波破碎），機械法，脫水干燥法（溶劑干燥，氣流干燥，冷凍干燥）；

二提取與精制

-）沉淀法

等電點，有機溶劑沉淀法，鹽析法，不溶性鹽沉淀；

二）色譜分離法

1吸附色譜

硅膠，氧化鋁，活性炭，聚酰胺，聚苯乙烯，碳酸鈣；

顆粒度越小，吸附速度越快；

極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)；

與pH有關(guān)；

硅膠使用前150-200C活化；活性炭使用前150C加熱4-5h；

極性大的洗脫劑洗脫能力大，因此先用極性小的做洗脫劑，再換用極性大的溶劑；2

離子交換色譜

3凝膠色譜：酶制劑的脫鹽，核酸，蛋白質(zhì)與核甘酸的分離

三）萃取法

溶劑萃?。豪梦镔|(zhì)在親水性溶液和疏水性溶液中的溶解度不同而分離純化；

雙水相萃?。豪脙煞N親水聚合物的水溶液混合時，形成兩相；適于提取易失活的，親

水性強的生物大分子物質(zhì)；

三）萃取法

溶劑萃?。豪梦镔|(zhì)在親水性溶液和疏水性溶液中的溶解度不同而分離純化；

雙水相萃取：利用兩種親水聚合物的水溶液混合時，形成兩相；適于提取易失活的，親

水性強的生物大分子物質(zhì)；

四）膜分離

依據(jù)溶質(zhì)分子的大小，形狀，性質(zhì)差別，對各種薄膜表現(xiàn)的不同的可透性而達(dá)到分離；

小分子通過，把較大分子擋除；

透析，超濾，電滲析，反滲透；

五）結(jié)晶法

過飽和：調(diào)pH,冷卻或蒸發(fā)；濃縮結(jié)晶，冷卻結(jié)晶，化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶，鹽析結(jié)晶；

三成品加工

濃縮，無菌過濾，加穩(wěn)定劑；

濃縮：薄膜蒸發(fā)，膜過濾；

干燥：真空干燥，紅外線干燥，沸騰干燥，氣流干燥，噴霧干燥，冷凍干燥；

如何分離纖維素酶產(chǎn)生菌；

按用途劃分，培養(yǎng)基分為，，；

按終產(chǎn)物分，微生物發(fā)酵分為；按物料進出方式分，分為；繪制通風(fēng)發(fā)酵池示意

圖；

發(fā)酵的一般流程是；

常用的抱子培養(yǎng)基有；

培養(yǎng)細(xì)菌，放線菌，霉菌，酵母菌常用的培養(yǎng)基分別是；適宜的pH分別是；

穩(wěn)定培養(yǎng)基pH的方法有；

發(fā)醉產(chǎn)物提取純化的流程是；

第二章微生物肥料

第一節(jié)概述

微生物肥料:Microbialfertilizers；

由單一或多種特定功能菌株，通過發(fā)酵工藝生產(chǎn)的能為植物提供有效養(yǎng)分，或防治植物

病蟲害的微生物接種劑；

一種類

）按微生物種類劃分

細(xì)菌肥料：如根瘤菌，固氮菌，磷細(xì)菌，鉀細(xì)菌，光合細(xì)菌；

放線菌肥料：抗生菌類；

真菌類肥料：外生菌根菌劑，內(nèi)生菌根菌劑，如VA菌根菌劑，蘭科菌根菌劑；藻類肥

料：固氮藍(lán)藻；

復(fù)合生物肥料：幾種微生物混合在一起；

三）按其功能和肥效劃分

1增加土壤氮素：如根瘤菌肥，固氮菌肥，固氮藍(lán)藻；

2分解土壤有機質(zhì)：如有機磷細(xì)菌肥料，綜合性菌肥；

3分解土壤難溶性礦物質(zhì)：如無機磷細(xì)菌肥料，鉀細(xì)菌菌肥；

4刺激植物生長：如抗生菌肥料-，促生菌肥；

5增加作物根系吸收營養(yǎng)能力：如菌根菌肥料；

四）按其產(chǎn)品劑型劃分

液劑：菌種投放到無菌罐中進行工業(yè)深層發(fā)酵：粉劑：液體微生物肥料和草炭土混合產(chǎn)

生，運輸方便，含菌量高，增產(chǎn)效果明顯；

顆粒：微生物肥料經(jīng)造粒設(shè)備進行噴霧，造粒，低溫烘干產(chǎn)生；

二作用

-）增進土壤肥力，協(xié)助農(nóng)作物吸收營養(yǎng)

1

自生，聯(lián)合或共生的固氮微生物肥料，可以增加土壤中的氮素來源;

多種溶磷，解鉀微生物，如芽抱桿菌，假單胞菌的應(yīng)用，可將土壤中難溶的磷鉀分解，

轉(zhuǎn)變?yōu)樽魑锬芪绽玫牧租洠?/p>

2菌根：

土壤真菌，與多種植物根系共生；菌絲可吸收更多的營養(yǎng)供給植物吸收利用，對磷的吸

收最明顯，對在土壤中活動性，移動緩慢的元素如鋅銅鈣等有加強吸收的作用；

國內(nèi)外以大量的菌根培養(yǎng)物用于名貴花卉，藥材；大量生產(chǎn)的外生菌根接種劑用于林業(yè)

取得明顯效果；

3分泌一些刺激素，維生素：

固氮菌能產(chǎn)生多種維生素類物質(zhì)，如生長素，肌醇，鹽酸，泛酸，毗哆醇，硫胺素，刺

激作物生長；

二）增強植物抗病蟲抗逆性

1肥料中有益微生物生長繁殖，在作物根際土壤微生物系統(tǒng)內(nèi)形成優(yōu)勢種群，限制了其

他病原微生物的生長繁殖機會，拮抗病原微生物；如植物根圈促生細(xì)菌PGPR,包括了好多

科的多種細(xì)菌；

2誘導(dǎo)作物產(chǎn)生超氧化物歧化酶，在植物受到病害，蟲害，干旱，衰老時，消除因逆境

產(chǎn)生的自由基；

三）減少化肥使用量

可提高土壤養(yǎng)分含量，因此在相同地力水平土壤上可減少化肥用量，并獲得增產(chǎn)效果；

可提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，如蛋白質(zhì)，糖，維生素含量提高；

三微生物肥料的施用條件

土壤持水量30%以上，低于30%時要澆水，及時中耕以保持土壤墉情；

溫度在10-40℃,

pll5.5~8,5；

含微生物繁殖所必需的營養(yǎng)；

選擇陰天或晴天傍晚使用，并結(jié)合蓋土，蓋糞，澆水措施；避免在高溫干旱條件使用，

避免受陽光直射；

四應(yīng)用前景及發(fā)展趨勢

-）應(yīng)用前景

1施用廣泛，市場容量大

適宜施用微生物肥料的作物種類：各種豆科作物，糧食作物，經(jīng)濟作物，蔬菜瓜果；

我國微生物肥料年產(chǎn)量10-40X1043化肥1.2X108t；

大豆種植面積1000X104hm2,花生330X104hm2,而實際應(yīng)用微生物肥料接種的大豆面

積1臨花生更少，其他大面積豆科綠肥，牧草極少應(yīng)用；因此，市場容量大；

2生產(chǎn)成本低，應(yīng)用效果好

美國和加拿大這樣重茬種植大豆的國家，農(nóng)民單靠接種劑可獲高產(chǎn)；

化肥生產(chǎn)成本的提高，價格上漲幅度過快，已令農(nóng)民難以接受，增加有機肥，微生物肥

料的施用不再是權(quán)宜之計，而是降低農(nóng)民投入，提高產(chǎn)品品質(zhì)，減少環(huán)境污染，取得較大

經(jīng)濟，社會和生態(tài)效益；

3生產(chǎn)無公害綠色食品，減少環(huán)境污染的需求

生產(chǎn)安全無公害的綠色食品是一個發(fā)展趨勢；

土壤物理性質(zhì)惡化，土壤質(zhì)量下降問題日益突出；

城市，農(nóng)村對廢棄物消納的壓力越來越大，要求無害化，肥料化；

二）現(xiàn)狀與問題

1在工廠化生產(chǎn)中，普遍缺乏高效菌株，菌種資源缺乏

2生產(chǎn)設(shè)備陳舊

很多是由已倒閉的小型酶制劑廠，味精廠，檸檬酸廠改造而成，效率低，能耗高；3

技術(shù)工藝落后生產(chǎn)過程中缺乏監(jiān)控和檢測手段，有的甚至是小作坊式生產(chǎn)；

4市場上魚目混珠，假冒偽劣屢禁不止

四）發(fā)展趨勢

1由單一菌種向復(fù)合菌種發(fā)展：固氮菌，磷細(xì)菌，鉀細(xì)菌復(fù)合；由單功能向多功能發(fā)

展；2使用芽抱桿菌：芽泡菌耐高溫，干燥，抗逆性強，利于制作顆粒劑，干粉；

3采用生物技術(shù)對菌種進行基因重組，選取高效菌種

4在生物肥劑型上，由粉狀轉(zhuǎn)向擠壓條狀，顆粒狀

5田間應(yīng)用上，向經(jīng)濟作物傾斜，和綠色食品生產(chǎn)相結(jié)合

第三節(jié)微生物肥料生產(chǎn)

一單一微生物肥料

根瘤菌肥料的出現(xiàn)已有100年的歷史，普遍應(yīng)用也有70年的歷史，是世界上公認(rèn)效果

最穩(wěn)定，最好的微生物肥料；

菌種：花生根瘤菌，大豆根瘤菌，華癸根瘤菌，苕子，蠶豆，豌豆根瘤菌，苜蓿根瘤

菌，菜豆根瘤菌，沙打旺根瘤菌；三葉草根瘤菌肥，百脈根根瘤菌肥，胡枝子根瘤菌肥，

綠豆根瘤菌肥；

大豆根瘤菌菌種的篩選

挖取帶根瘤的根系，裝入塑料袋中以備分離根瘤菌；

用流水反復(fù)沖洗根瘤，至無附著土壤，吸干水分，置75%酒精中浸3-5min,放0.1%升

汞中消毒3-5min,再用無菌水沖洗根瘤，除去殘存消毒液，切開根瘤，用接種環(huán)蘸瘤汁

在培養(yǎng)基上劃線；28—30℃培養(yǎng)；

培養(yǎng)基：甘露醇，酵母膏，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，氯化鈉；剛果紅；

菌落：菌落黏稠，乳白色，在平板上不吸色或早期不吸色，雜菌易吸色；選取典典型菌

落在剛果紅平板上劃線純化，保存；

菌株鑒定；根瘤菌桿狀，革蘭氏陰性，2—6根鞭毛或一根端生或側(cè)生，沒有芽胞；

一）菌種的制作

斜面培養(yǎng)

豆芽汁培養(yǎng)基：0.5kg綠豆芽，洗凈放入鍋里加水1kg煮沸20-30min,過濾即得豆芽

汁,加20g瓊脂加水0.5kg煮溶,過濾,混合后加糖,加碳酸鈣，補水到1000ml,調(diào)

pH6.8-7.2,121c30min,趁熱取出擺斜面；

28℃2-4d,菌苔長滿取出放冰箱保存；

~）擴大培養(yǎng)

1固體擴大培養(yǎng)

用克氏瓶制成斜面，作斜面菌種或液體種子接種，菌苔長滿；

2液體擴大培養(yǎng)

二角瓶搖床培養(yǎng);

500ml三角瓶裝1501nl培養(yǎng)基，28c旋轉(zhuǎn)式搖床230rpm,2-3d,每毫升含菌幾十億到?

百億；做種子；

3發(fā)酵罐培養(yǎng)

培養(yǎng)基，罐體，管道消毒，接種量2-3%,28-30℃,罐壓，通氣量0.8T：1,攪拌速度

360rpm,培養(yǎng)兩天；

三）吸附劑的準(zhǔn)備和接種

草炭，含豐富有機質(zhì)，保水力強，疏松不黏結(jié)，通氣良好；曬干，打碎，過篩，除去石

頭，雜草，調(diào)pH6.8-7.6,用石灰或過磷酸鈣調(diào)節(jié)；裝瓶2/3或3/4,126℃2-3h；

接種：

接種室：接種前一天關(guān)閉門窗，用福爾馬林熏蒸，紫外燈照射；

加壓噴射法裝瓶，或裝袋（塑料袋用福爾馬林熏）；

造粒方式：圓盤分開造粒；

四）根瘤菌肥的應(yīng)用

將選好的種子倒入內(nèi)壁光潔的瓷盆或木盆，用涼水將菌劑用水250-500g調(diào)成漿糊狀，

再把種子倒入拌勻，使每粒種子沾上菌劑，陰涼處攤開，稍陰干，使根瘤菌劑牢固地吸附

在種子上，播種時也易于撇開時，立即播種，隨即覆土；

應(yīng)用原理：

肥料通過拌種，土壤接種后在相應(yīng)的豆科種子周圍存活，繁殖，當(dāng)豆科植物萌發(fā)長出幼

根后，肥料中的相應(yīng)根瘤菌通過根部，侵入，并在較短時間后即形成根瘤，依靠豆科植物

的營養(yǎng)，實現(xiàn)生物固氮；

注意事項：

1專一性；

2用來拌種，不能做基肥或追肥；

3不能在太陽光直射或高溫條件存放，應(yīng)常溫保藏；存放不超半年；

4不要在晴天中午播種，宜在傍晚和陰天撒播，拌種后稍陰干就播種;

5最好一次用完;

6拌種不要與農(nóng)藥，過磷酸鈣一起拌，可與鈣磷鎂肥?起拌，先拌菌，后拌鈣磷鎂肥；

使用適量磷肥可提高根瘤菌的結(jié)瘤率；用含0.1%稀土化合物吸附根瘤菌；

7根瘤菌生長要求濕潤疏松的土壤，含水量在20-30%；稻田水要放干曬『2d再播種，

旱田要在下雨前后條播，蓋一層薄土；

8土壤pH,對于酸性土壤，作物種子和根瘤菌劑拌和后，再與泥漿，鈣鎂磷肥或