光學(xué)顯微成像

光學(xué)顯微成像—光學(xué)顯微攝影的用光方法與技巧光學(xué)顯微攝影的照明，會對物鏡解像力產(chǎn)生明顯影響，一般要求光源的輸出能夠集中到很小面積上，光強高、熱量小，幾何尺寸不大。在一般明視場照明顯微攝影時，通常采用6伏或者12伏螺口形白熾鎢絲燈泡做照明光源，色溫為2700?3200K，其亮度的調(diào)整由變壓器實現(xiàn)，這種照明盡管看上去很亮，色溫并不高，所以，應(yīng)盡量用最高電壓，使燈光亮度、色溫提高，并使用RAW格式拍攝，以便后期校正色溫。但是，白熾鎢絲燈泡長期使用，其鎢絲蒸發(fā)后所產(chǎn)生的沉物會積聚在玻璃罩內(nèi)壁，這樣會降低亮度與色溫。所以，12伏100瓦的鹵素鎢絲燈光便成了光學(xué)顯微攝影的優(yōu)質(zhì)光源。（這種鹵素鎢絲燈在燈管內(nèi)充鹵素氣體，在燈絲點燃后，蒸發(fā)出來的鎢會與鹵素氣體形成鹵化鎢，附著在燈管內(nèi)壁，而關(guān)閉電源冷卻時，鹵化鎢又會分解，屆時鎢又回到燈絲上去，這樣便延長了燈泡的使用壽命，改善了光源照明，縮小了燈泡的幾何尺寸，提高了光源強度）。用于光學(xué)顯微攝影的光源還有氙燈、鋯燈、電子閃光燈、汞蒸氣燈等，可以根據(jù)不同的目的，選用適當(dāng)?shù)墓庠础Ｈ珉療舨粌H可以發(fā)出連續(xù)的可見光，還包含長波紫外線和紅外光譜部分;汞蒸氣是優(yōu)質(zhì)的單色光源，特別適于單色黑白顯微攝影。拍攝顯微照片，要求有明亮、均勻、無反光的照明條件，其照明方法可分為兩類，即透射照明和反射照明（落射光照明）透射光照明是指從光源射出的光線從標(biāo)本的下面透過標(biāo)本進入物鏡。而落射照明是指光線從正面投射到標(biāo)本的正面，物鏡接受的光是從標(biāo)本反射來的光。落射光照明主要用于拍攝不透明的標(biāo)本，如皮膚、小生物、植物果實表面等。拍出的像有立體感。落射光與物鏡之間的角度越小越好，現(xiàn)代顯微攝影裝置的落射光大多與物鏡合軸。在沒有專業(yè)設(shè)備的情況下可以用斜射照明，在對應(yīng)面加反光屏，或用另一只燈做輔助光，也可以使用環(huán)形閃光燈。雖然現(xiàn)在的相機均有自動測光或自動曝光功能，但是如果一個視野中亮處面積超過二分之一，則易出現(xiàn)曝光不足的現(xiàn)象，所以如果標(biāo)本主體小，又處在亮背景中，就要適當(dāng)增加曝光時間。在控制曝光時，要注意以下因素：光源強度的影響：由于電壓的變化，光源亮度可能產(chǎn)生5-10倍的變化。光源的距離及對標(biāo)本的照射面積。光源的波長及色溫。光源的波長長、色溫低，色光偏紅時，曝光時間要長些。光波短，色溫高，色光偏青時，曝光時間要短些。電壓的波動會引起曝光量的改變，所以攝制過程中要保持電壓的相對穩(wěn)定。聚光器的位置經(jīng)過實驗固定后不宜改動。使用濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡等都要按其曝光指數(shù)增加曝光時間（手動曝光）。目鏡的放大倍率。以某5倍的目鏡作曝光基準(zhǔn)1時，某10倍目鏡要4倍的曝光量，某15倍目鏡要增至9倍的曝光。物鏡的倍率和N?A值：如果把某10倍的目鏡作為1時，某40倍目鏡要2.5倍的曝光，某100倍的物鏡要4倍的曝光。從目鏡出射點到感光片的距離標(biāo)本的染色也會對曝光產(chǎn)生影響標(biāo)本與目鏡間的介質(zhì)折射率大、曝光時間短，反之，曝光時間長。曝光時間與折射率成反比。聚光鏡的光闌孔徑變化能使曝光產(chǎn)生2?20倍的變化。濾色片幾乎在拍攝什么樣的標(biāo)本都有用場。例如：用濾色片校正反差突出重點光學(xué)顯微攝影往往要突出重點，這就要使用適當(dāng)?shù)臑V色鏡加強反差，強調(diào)需要突出的重點結(jié)構(gòu)，而減弱其非重點部分。使用標(biāo)本染色補色的濾色鏡可以增強標(biāo)本反差，比如蘇木精染出的色標(biāo)本中用綠濾色鏡，就可增強反差。兩種顏色的結(jié)構(gòu)體現(xiàn)：如果想使標(biāo)本中兩種以上的顏色都清楚地呈現(xiàn)在畫面上，如紅、藍(lán)兩種顏色，可以采取兩次曝光的方法，先用紅濾色鏡，再用藍(lán)濾色鏡各曝一次光，就可以清楚地體現(xiàn)兩種顏色的結(jié)構(gòu)短波光濾色鏡可以提高對標(biāo)本的分辨率。短波光濾色鏡（如UV鏡）可以分辨出在可見光下肉眼看不見的組織結(jié)構(gòu)。用紫外線濾色片配合紫外膠片可提高成像可分辨，達(dá)到560?1000線