基因工程原理重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering

第五章基因工程原理第五章本文檔共96頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具——基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞外源基因的表達(dá)基因工程的應(yīng)用本文檔共96頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分第五章重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞本文檔共96頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分第一節(jié)受體細(xì)胞受體細(xì)胞（receptorcell），又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞，是能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。受體細(xì)胞的選擇應(yīng)符合以下原則：①便于重組DNA分子的導(dǎo)入②能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中③便于重組體的篩選④遺傳穩(wěn)定性高⑤安全性高⑥內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低⑦遺傳密碼無明顯偏倚性⑧具有較好的轉(zhuǎn)移后加工機(jī)制本文檔共96頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分1.原核受體細(xì)胞較為理想的受體細(xì)胞：大部分沒有細(xì)胞壁，便于外源DNA進(jìn)入沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)基因組簡單，不含線粒體、質(zhì)體多為單細(xì)胞，容易獲得一致性材料，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長常用細(xì)菌：大腸桿菌。本文檔共96頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分大腸桿菌。特點(diǎn)：G-,單個細(xì)胞，0.5μm*(1~3)μm，周身鞭毛、能運(yùn)動、無芽孢。例：胰島素、生長素、干擾素、RE……優(yōu)點(diǎn)：完善成熟的受體系統(tǒng)。缺點(diǎn)：毒素等，折疊加工問題本文檔共96頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢：結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡單培養(yǎng)簡單遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成污染具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核生物表達(dá)2.酵母受體細(xì)胞本文檔共96頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分3.植物受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：真核細(xì)胞、細(xì)胞的全能性。4.動物細(xì)胞受體細(xì)胞包括：小鼠BHK細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO，猴腎細(xì)胞等受體動物：鼠、牛、羊、魚等本文檔共96頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分第二節(jié)重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞一、重組基因?qū)朐耸荏w細(xì)胞接受DNA片段本文檔共96頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分轉(zhuǎn)化（transformation）——重組質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程，轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子。（一）轉(zhuǎn)化1928年英國學(xué)者F·Griffth在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的，證明了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化子DNA分子數(shù)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞數(shù)＝本文檔共96頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法對數(shù)生長后期的菌體5x107個/毫升冰浴10分鐘含CaCl2緩沖液15分鐘含CaCl2緩沖液（1）感受態(tài)的制備（2）DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（3）篩選轉(zhuǎn)化子。Ca2+：低溫下使磷質(zhì)層形成液晶結(jié)構(gòu)，使膜間核酸酶分離與DNA結(jié)合，抗DNase本文檔共96頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞將外源DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)并穩(wěn)定遺傳的過程。本文檔共96頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分D突變E突變?nèi)茉淳囵B(yǎng)誘導(dǎo)溶菌生長45℃15min39℃2-3h收集包裝物λ噬菌體DNA噬菌體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝本文檔共96頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（三）轉(zhuǎn)染是采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法，將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程。本文檔共96頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（四）電激穿孔是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收?！?988年，DowerWJ等參數(shù)：電場強(qiáng)度電脈沖時間外源DNA濃度當(dāng)50%～70%菌體細(xì)胞死亡時，轉(zhuǎn)化率最高本文檔共96頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（五）三親本雜交（triparentalmating）三親本雜交結(jié)合轉(zhuǎn)化法是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方法。本文檔共96頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分二、重組基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞（一）土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化外植體：植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。在繼代培養(yǎng)時，將培養(yǎng)的組織切段移入新的培養(yǎng)基時，這種切段也稱外植體。將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。本文檔共96頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（Vir區(qū)）（Con區(qū)）長度25kb，占Ti質(zhì)粒1/10主要功能是轉(zhuǎn)移DNA，隨機(jī)插入植物染色體中。——天然的質(zhì)?？寺≥d體。含有2類基因：（1）編碼冠癭堿合成酶（ocs、nos）及分解代謝的基因。（2）誘發(fā)腫瘤基因（Onc）Vir區(qū)：激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。占Ti質(zhì)粒1/3。Con區(qū)——調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，含有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因tra。Ori區(qū)——復(fù)制起始區(qū)。本文檔共96頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分限制性酶切開外源基因Ti質(zhì)粒載體本文檔共96頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（1）葉盤法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞本文檔共96頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（2）整體植株接種轉(zhuǎn)化法人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進(jìn)行侵染。獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。本文檔共96頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（3）原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法是以原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞，通過將根癌農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，然后洗滌除去殘留的根癌農(nóng)桿菌后，置于含抗生素的選擇培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)而再生成植株。本文檔共96頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（4）懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法與原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法相似本文檔共96頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（二）植物病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移植物病毒DNA病毒20%RNA病毒80%花椰菜花葉病毒：雙鏈DNA病毒本文檔共96頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（三）化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化（1）多聚物介導(dǎo)法聚乙二醇多聚賴氨酸多聚鳥苷酸本文檔共96頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（2）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體本文檔共96頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（四）物理方法介導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化（1）基因槍轉(zhuǎn)化本文檔共96頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（2）超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（3）激光微束穿孔轉(zhuǎn)化本文檔共96頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（4）顯微注射本文檔共96頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分三、重組基因?qū)雱游锸荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)染法本文檔共96頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（二）脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化本文檔共96頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（三）動物病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)法本文檔共96頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分第三節(jié)重組子篩選只有少數(shù)受體細(xì)胞能被導(dǎo)入重組DNA分子例：大腸桿菌108個大腸桿菌，轉(zhuǎn)化效率10-6只有100個細(xì)胞被轉(zhuǎn)化本文檔共96頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分克隆子的篩選：經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選（Screening）或選擇(Selection)。轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。如果重組子含有外源目的基因，又稱為陽性克隆子或期望重組子。本文檔共96頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分一、遺傳表型直接篩選（一）利用載體選擇性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子抗藥性標(biāo)插入失活篩選插入表達(dá)篩選α－互補(bǔ)法（藍(lán)白斑篩選法）（二）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞（三）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（四）營養(yǎng)缺陷型檢測法（五）形成噬菌斑篩選法本文檔共96頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分二、依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選三、核酸雜交分析（一）分子探針：放射性探針、非放射性探針、標(biāo)記探針的方法（二）核酸探針雜交分析四、免疫化學(xué)分析檢測（一）抗體檢測法（二）免疫沉淀測定法（Immunoprecipitation,IP）（三）轉(zhuǎn)譯篩選法五、PCR篩選法本文檔共96頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分一、遺傳表型直接篩選（一）利用載體選擇性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子1.抗藥性標(biāo)記氨芐青霉素氯霉素卡那霉素四環(huán)素鏈霉素本文檔共96頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分2.插入失活篩選本文檔共96頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分3.插入表達(dá)篩選載體的選擇性標(biāo)記基因前鏈接一段附調(diào)控序列，插入式禍福調(diào)控序列后，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)本文檔共96頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分。IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷4.α－互補(bǔ)法（藍(lán)白斑篩選法）乳糖操縱子：本文檔共96頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分IPTGα-互補(bǔ)：是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)。本文檔共96頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分IPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷顯色劑：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。本文檔共96頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（二）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTⅡ）基因（2）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因（3）氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶（CAT）基因（4）β—葡萄糖苷酶（GUS）基因（5）熒光素酶（LUC）基因（6）抗除草劑bar基因：抗草丁膦（7）冠癭堿合成酶基因報告基因(reportergene)——是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。本文檔共96頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分熒光素酶（LUC）基因轉(zhuǎn)入了螢火蟲的熒光素酶基因能發(fā)光的煙草(1)螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi(2)螢光素化腺苷酸+O2→氧螢光素+AMP+光機(jī)理：本文檔共96頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分GFP：綠色熒光蛋白日本科學(xué)家下村修（伍茲霍爾海洋生物學(xué)研究所）美國科學(xué)家馬丁?查爾菲（哥倫比亞大學(xué)）錢永?。永Ｄ醽喆髮W(xué)圣迭戈分校）2008年諾貝爾化學(xué)獎：本文檔共96頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分GFP標(biāo)記的微管將綠黃紅熒光蛋白質(zhì)植入魚的DNA分子結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)GFP的CHO細(xì)胞GFP轉(zhuǎn)基因小鼠本文檔共96頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（三）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（1）胸苷激酶（TK）基因：（2）二氫葉酸還原酶（DHFR）基因（3）黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因：胸苷（T）轉(zhuǎn)換成TMP的基因催化二氫葉酸還原成四氫葉酸催化GMP生成本文檔共96頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（四）營養(yǎng)缺陷型檢測法本文檔共96頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（五）形成噬菌斑篩選法本文檔共96頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分二、依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選（一）快速裂解菌落鑒定分子大小：瓊脂糖電泳，分析DNA分子大?。ǘ┫拗菩院怂醿?nèi)切酶酶解分析：DNA酶切圖譜（三）核酸雜交分析本文檔共96頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分三、核酸雜交分析基本原理：具有一定互補(bǔ)的兩條核酸(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈。核酸雜交：兩種不同來源單鏈DNA或RNA相互配對的過程。分子雜交：生物大分子之間通過相互作用結(jié)合在一起：核酸之間通過堿基互補(bǔ)配對；蛋白質(zhì)之間通過抗原、抗體反應(yīng)；核酸、蛋白質(zhì)之間通過疏水作用，氫鍵進(jìn)行相互作用。——1968年華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院RoyBritten等本文檔共96頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分常見的分子雜交：Southernblotting：DNA，DNA/RNA

Northernblotting：RNA，DNA/RNA

Dot/slotblotting（斑點(diǎn)/狹縫雜交）insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體待測分子探針本文檔共96頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（一）分子探針(Molecularprobe)：是指具有同特異性目標(biāo)分子產(chǎn)生很強(qiáng)的相互作用并可對其相互作用的產(chǎn)物進(jìn)行有效檢測的DNA分子、RNA分子和蛋白質(zhì)。1.放射性探針：32P、3H、35S、14C、125I本文檔共96頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分2.非放射性探針（1）生物素（biotin）標(biāo)記探針：生物素與dUTP中尿嘧啶的5位C相連，在聚合酶作用參入DNAdUTPBiotin(維生素H，VH)連接臂本文檔共96頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（藻紅素）（鏈霉親和素）（生物素）本文檔共96頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（2）

地高辛標(biāo)記探針：地高辛與UTP中尿嘧啶的C5相連dUTP連接臂地高辛地高辛：異羥基洋地黃毒苷，強(qiáng)心素，拉諾辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin本文檔共96頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（3）

熒光素標(biāo)記探針：用熒光素標(biāo)記核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗體。

熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素（黃綠色）羅丹明（紅色）羥基香豆素（蘭色）本文檔共96頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分3.標(biāo)記探針的方法（1）切口平移標(biāo)記法本文檔共96頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（2）隨機(jī)引物標(biāo)記法本文檔共96頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（3）末端標(biāo)記法本文檔共96頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（4）PCR標(biāo)記法本文檔共96頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（5）光敏標(biāo)記法：光敏基團(tuán)本文檔共96頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（6）化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法：（7）交叉相連標(biāo)記法：本文檔共96頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分對重組體克隆進(jìn)行篩選和鑒定的方法之一是利用核酸雜交法進(jìn)行篩選，它包括Southern印記雜交法、Northern印記雜交、斑點(diǎn)印記雜交和（菌落原位雜交）雜交。各種雜交中需要對探針進(jìn)行標(biāo)記，其中對探針進(jìn)行非放射性標(biāo)記的常見標(biāo)記物有（熒光素）、（生物素）、（地高辛）。標(biāo)記探針的方法（切口平移標(biāo)記法）、（隨機(jī)引物標(biāo)記法）、（末端標(biāo)記法）、（PCR標(biāo)記法）、（光敏標(biāo)記法）、化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法以及交叉相連標(biāo)記法。在利用lacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中，IPTG的作用是(a)(a)誘導(dǎo)宿主的α肽的合成(b)誘導(dǎo)宿主的ω肽的合成(c)作為酶的作用底物(d)作為顯色反應(yīng)的指示劑本文檔共96頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分α-互補(bǔ)篩選屬于下列哪種篩選方法：(B)A.抗藥性標(biāo)志選擇B.標(biāo)志補(bǔ)救C.原位雜交法D.酶聯(lián)免疫吸附E.分子雜交應(yīng)用α-互補(bǔ)篩選重組體時，含有外源基因的重組體菌落顏色應(yīng)為：(C)A.紫色B.藍(lán)色C.白色（阻遏蛋白不能表達(dá)）D.無色E.以上都不是水母發(fā)光蛋白由236個氨基酸構(gòu)成，其中Asp、Gly、Ser構(gòu)成發(fā)光環(huán)，現(xiàn)已將這種蛋白質(zhì)的基因作為生物轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，這種蛋白質(zhì)的作用是（篩選標(biāo)記）(C)A.促使目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中B.促使目的基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制C.使目的基因容易被檢測出來D.使目的基因容易成功表達(dá)建立了一個基因文庫后，如何鑒定一個攜帶目的基因的克隆?本文檔共96頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（二）核酸探針雜交分析基本原理：具有一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對原則高度特異地退火形成雙鏈。探針：用于檢測的核苷酸片段。Southernblotting：DNA/DNA,RNA

Northernblotting：RNA/DNA,RNA

Dotblotting：DNA芯片insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體本文檔共96頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（1）Southern印跡雜交

1975年由英國人southern創(chuàng)建待測的核酸序列：DNA探針：DNA或RNA本文檔共96頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分電轉(zhuǎn)移方法：濕式電轉(zhuǎn)移半干式電轉(zhuǎn)移本文檔共96頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（2）Nouthern印跡雜交（1979年，J.C.Alwine等）待測的核酸序列：RNA探針：DNA或RNA本文檔共96頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（3）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交待測的核酸序列：DNA和RNA探針：DNA或RNA本文檔共96頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（4）菌落（噬菌斑）原位雜交

Grunstein和Hosness，1975年本文檔共96頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（5）熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）用特定熒光素如生物素、地高辛等標(biāo)記探針，與靶DNA進(jìn)行雜交，通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo)記物，在熒光顯微鏡下觀察探針標(biāo)記或位點(diǎn)的技術(shù)。實驗流程：FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。本文檔共96頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分

組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交。是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置。（6）組織細(xì)胞的原位雜交本文檔共96頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（7）影響探針雜交的因素探針分子與目標(biāo)分子之間序列的同一性探針的長度：<500b探針濃度雜交加速劑：硫酸葡聚糖雜交漂洗液的組成、反應(yīng)溫度、鹽濃度本文檔共96頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分四、免疫化學(xué)分析檢測待測物：蛋白質(zhì)探針：抗原、抗體抗體測定法免疫沉淀法分類本文檔共96頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（一）抗體檢測法放射性抗體測定法非放射性抗體測定法分類本文檔共96頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分1.放射性抗體測定Broome和Gilbert,1978年本文檔共96頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分2.非放射性抗體測定本文檔共96頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分本文檔共96頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（二）免疫沉淀測定法（Immunoprecipitation,IP）是一種研究蛋白質(zhì)間交互作用的生物技術(shù)，這種技術(shù)是將蛋白質(zhì)視為抗原，并利用抗體與之進(jìn)行特異性結(jié)合的特性，來進(jìn)行研究。這項技術(shù)可用來將含有上千種不同蛋白質(zhì)的樣品中，分離和濃縮出特定蛋白質(zhì)。本文檔共96頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分（三）轉(zhuǎn)譯篩選法雜交抑制轉(zhuǎn)譯檢測法雜交選擇轉(zhuǎn)譯檢測法無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)：沒有完整細(xì)胞的體外蛋白質(zhì)翻譯合成系統(tǒng)。通常利用無細(xì)胞提取物提供所需要的核糖體、tRNA、酶類、氨基酸、能量供應(yīng)系統(tǒng)及無機(jī)離子等，在試管中以外加的mRNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。常用的無細(xì)胞提取物有兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物和麥胚抽提物等。本文檔共96頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期二\12點(diǎn)25分無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的作用：本文檔共96頁；當(dāng)前第91頁；編輯