DPPH·體外清除實(shí)驗(yàn)研究蘿芙木水溶性生物堿抗氧化活性

DPPH·體外清除實(shí)驗(yàn)研究蘿芙木水溶性生物堿抗氧化活性

【摘要】目的研究蘿芙木水溶性生物堿(WSAR)的抗氧化活性。方法根據(jù)DPPH·體系吸光值的變化研究催吐蘿芙木水溶性生物堿清除自由基的能力，DPPH·反應(yīng)體系為ml×10-5mol·L-1DPPH·+ml樣品溶液，反應(yīng)時(shí)間30min?？疾炝瞬煌瑵舛萕SAR和特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)與DPPH·自由基清除率的關(guān)系。結(jié)果DPPH·自由基的清除能力IC50(WSAR)=×10-4g/ml,IC50(TBHQ)=×10-5g/ml。結(jié)論蘿芙木水溶性生物堿具有抗氧化活性，可以開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑。

【關(guān)鍵詞】水溶性生物堿;抗氧化;自由基;蘿芙木

AntioxidantPotentialofWaterSolubleAlkaloidsfromRauvolfiaStudybyDPPH·invitroAssay

Abstract：ObjectiveTostudytheantioxidantpotentialofwatersolublealkaloidsfromRauvolfia(WSAR)bystudyingabsorptionspectrumofDPPH·reactionTheconditionwasdrawnasfollows,DPPH·reactionsystemwasmlof×10-5mol·L-1DPPH·+mlofsamplesolutionwiththereactiontimeof30min.TherelationbetweenDPPH·radicalscavengingrateandtheconcentrationofWSARandTBHQwerestudied,andIC50(thevalueofantioxidantconcentrationforscavenginghalfofDPPH·radical)wasusedastheindextoevaluatescavengingThedeterminingIC50valueswereasfollows:IC50(WSAR)=×10-4g/mlandIC50(TBHQ)=×10-5g/WatersolublealkaloidsfromRserpentinacanbeusedasnaturalantioxidant.

Keywords：Watersolublealkaloids;Freeradical;Antioxidant;Rauvolfia

研究表明，適量的自由基在免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和其它生化代謝過(guò)程中起著重要的作用，然而過(guò)量的自由基則在機(jī)體中引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子結(jié)構(gòu)的破壞，并隨著破壞層次逐漸擴(kuò)展造成功能損傷，引起心血管疾病、癌癥和衰老等，它是構(gòu)成很多疾病的病基礎(chǔ)。因此合理地使用抗氧化劑可以有效地預(yù)防和治療某些疾病，延緩衰老。

合成抗氧化劑往往具有一定的毒副作用，使得它們的使用受到嚴(yán)格控制。而天然抗氧化劑副作用較小，因此，尋找高效、價(jià)廉、低毒甚至無(wú)毒的天然抗氧化劑的備受關(guān)注。

夾竹桃科蘿芙木有135種，主要分布在美洲、非洲、大洋洲和亞洲，我國(guó)分布有9種和4變種。蘿芙木在非洲和印度被廣泛作為民間草藥。自從1952年Muller等從印度蘿芙木(Rauvolfiaserpentina)中提取出利血平并發(fā)現(xiàn)它具有降壓和安定作用之后，各國(guó)科學(xué)家對(duì)蘿芙木脂溶性成分進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)了一系列單萜吲哚類(lèi)生物堿[5～7]，并對(duì)其中一些成分進(jìn)行抗炎、降血脂、降血壓和鎮(zhèn)靜等藥理研究[8～10]，但是對(duì)蘿芙木抗氧化活性的研究報(bào)道甚少，2007年，Al-qirim等[11]報(bào)道了印度蘿芙木標(biāo)準(zhǔn)提取物能夠保護(hù)小鼠心肌免受過(guò)氧化自由基的傷害。由于蘿芙木的民間用藥多為水溶性成分，為了對(duì)蘿芙木傳統(tǒng)的藥理作用做進(jìn)一步的研究，本實(shí)驗(yàn)以海南引種的催吐蘿芙木RauvolfiavomitoriaAfzel.exSpreng為原材料制備水溶性生物堿，并對(duì)其進(jìn)行體外清除DPPH·自由基活性的研究，測(cè)定自由基的清除能力，評(píng)價(jià)蘿芙木的抗氧化活性。

1材料與儀器

材料與試劑催吐蘿芙木干根(海南省五指山市海南制藥廠提供)粉碎過(guò)40目篩，TBHQ(廣東省食品工業(yè)研究所)，有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DPPH·母液：稱(chēng)取mgDPPH·(2,2-二苯基-1-苦基肼，sigma-Aldrich)溶于少量體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇中，最后定容至100ml(即×10-4mol/L)，置于冰箱中冷藏備用。

儀器與設(shè)備722S可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，BT-244-S型電子天平(德國(guó)Sartorius)。

2方法與結(jié)果

水溶性生物堿的制備以催吐蘿芙木生藥粉為材料制備乙醇提取物浸膏，然后采用雷氏銨鹽沉淀法制得水溶性生物堿，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

蘿芙木水溶性生物堿清除DPPH·自由基能力

水溶性生物堿清除DPPH·能力的測(cè)定方法采用文獻(xiàn)[13,14]所述方法：將DPPH·貯備液用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇稀釋至×10-5mol/L。按表1加樣，總體積3ml。用光徑1cm的比色皿在517nm處測(cè)定各吸光值(A)。每一吸光值平行測(cè)定3次，最后取其平均值。DPPH·自由基清除率按式①計(jì)算：清除率(%)=(1-Ai-AjAo)×100%①表1DPPH·反應(yīng)體系加樣表

DPPH·自由基穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)為了了解DPPH·自由基體系在催吐蘿芙木水溶性生物堿作用下吸光值A(chǔ)隨時(shí)間的變化規(guī)律，取適量水溶性生物堿用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇配制成質(zhì)量濃度為mg/ml樣品溶液，按照“”項(xiàng)下方法，每隔2min測(cè)定吸光值A(chǔ)。吸光值隨時(shí)間變化規(guī)律如1。A值在最初20min內(nèi)下降較快，在20～30min內(nèi)，反應(yīng)體系的A值變化緩慢，30min后A值基本保持不變。故測(cè)定催吐蘿芙木水溶性生物堿與DPPH·自由基的反應(yīng)時(shí)間為30min。

圖1加樣品后DPPH·吸光度A隨時(shí)間變化曲線

DPPH·自由基清除率與樣品濃度關(guān)系稱(chēng)取適量水溶性生物堿用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇倍比稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為，，，，，mg/ml的樣品溶液。測(cè)定各樣品溶液對(duì)DPPH·自由基的清除率。催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基清除率與樣品濃度關(guān)系見(jiàn)表2。表2水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基的清除效果

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，可得催吐蘿芙木水溶性生物堿清除DPPH·自由基的劑量-效應(yīng)關(guān)系，如2。由圖2可知，在～mg/ml范圍，DPPH·自由基清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，在mg/ml時(shí)，清除率為%，而在mg/ml時(shí)，清除率達(dá)到%。

圖2催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基清除作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系

數(shù)據(jù)分析采用SAS(STATISTICALANALYSISSYSTEM)對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Reg過(guò)程進(jìn)行一元非線性回歸分析，建立催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基清除作用的劑量-效應(yīng)回歸方程。

回歸方程顯著性分析見(jiàn)表3，模型Y=a+bX+cX2的參數(shù)a=48，b=26，c=-06，a達(dá)到顯著水平()，b和c均達(dá)到極顯著水平()，在此基礎(chǔ)上建立的催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基清除作用的劑量-效應(yīng)回歸方程為式②。相關(guān)系數(shù)R2=8，說(shuō)明該回歸方程具有可靠性，能較好的解釋催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基清除作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系。Y=48+06X2②表3回歸方程顯著性分析

催吐蘿芙木水溶性生物堿的抗氧化水平抗氧化劑清除DPPH·自由基能力采用IC50表示。IC50的物理意義為當(dāng)抗氧化劑對(duì)DPPH·自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的質(zhì)量濃度，IC50值越低，抗氧化劑清除自由基的能力越強(qiáng)。由回歸方程計(jì)算出DPPH·自由基清除率為50%時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度IC50=×10-4g/ml。

3結(jié)論

研究催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基體系吸光值的變化，認(rèn)為采用分光光度法測(cè)定催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基體外清除實(shí)驗(yàn)的條件是反應(yīng)體系經(jīng)30min后在517nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

提出以IC50值作為評(píng)價(jià)樣品清除DPPH·自由基能力的指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定不同質(zhì)量濃度的催吐蘿芙木水溶性生物堿對(duì)DPPH·自由基清除率曲線，計(jì)算出其IC50值為×10-4g/ml。特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)是現(xiàn)今食品醫(yī)藥行業(yè)廣為的合成抗氧化劑，在與WSAR同等條件下測(cè)定TBHQ對(duì)DPPH·自由基的清除能力IC50為×10-5g/ml。這表明蘿芙木水溶性生物堿具有較強(qiáng)的抗氧化活性。蘿芙木化學(xué)成分多以吲哚類(lèi)生物堿為主，而生物堿是自然界中具有強(qiáng)生理活性的氮雜環(huán)化合物[15]，深入研究，可以開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑。

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