用ImageProPlus分析免疫組化圖片

用Image-ProPlus(IPP)

分析免疫組化圖片本文檔共61頁；當前第1頁；編輯于星期一\17點49分1.免疫組化圖片分析原理根據(jù)染色染料顏色的深淺及分布面積大小來確定目標蛋白的量。染色區(qū)域分布面積與目標蛋白量成正比。染色的顏色深淺與目標蛋白量的定量關系符合朗伯-比爾定律，是對數(shù)關系。本文檔共61頁；當前第2頁；編輯于星期一\17點49分1.1光密度與灰度—迷惑人的不同概念光密度：吸收光的物質(zhì)的光學密度。（opticaldensity,就是常說的OD值）光密度值是直接與染色物質(zhì)的量相關的?；叶龋夯沂遣粔蚝冢欠瓷淞炼鹊膯挝?。電子照片上像素的亮度稱為灰度。本文檔共61頁；當前第3頁；編輯于星期一\17點49分Gray:betweenwhiteandblackExample:1.Thebrightvalueondisplayscreenisgrayvalue.2.Thedarkvalueonawhitepaperisalsothegrayvalue.255本文檔共61頁；當前第4頁；編輯于星期一\17點49分OpticalDensity:

吸光物質(zhì)的光學密度.被測物質(zhì)的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值與物質(zhì)的量直接相關，數(shù)字圖象上點的灰度值與對應物質(zhì)OD值成對數(shù)關系，符合朗伯-比爾定律。理論上OD值是從零到無窮大。實際應用中，OD值的范圍常用

0-2.0或者0-3.0。本文檔共61頁；當前第5頁；編輯于星期一\17點49分用OD值是正確的分光光度計與酶標儀的測定值是OD值透射的顯微鏡圖象上的光強度要用OD值蛋白電泳條帶的測量也是OD值。螢光顯微鏡及螢光分光光度計的測量值是螢光強度(Fluorescenceintensity)用EB染色的DNA凝膠電泳條帶也是螢光強度，但處理方法與光密度相同，故也用OD值。這個OD與前面的OD又有不同的意義。它就是熒光的光密度。反映著熒光物質(zhì)的多少。本文檔共61頁；當前第6頁；編輯于星期一\17點49分處理照片時用的卻是灰度各種圖象被拍攝成照片進行數(shù)字圖象處理時，計算機是對照片的灰度進行測量和計算的。為了定量物質(zhì)含量，最后還是需要轉(zhuǎn)換為OD值來表示。所以對免疫組化照片的分析結果應該是一個OD值，光密度。不應該是灰度。準確地說，是對免疫組化照片的特定染色區(qū)域的灰度進行分析從而測量出組織切片的光密度值。本文檔共61頁；當前第7頁；編輯于星期一\17點49分用標準樣品才能把OD值

與樣品量關聯(lián)到一起OD值是一個沒有單位的相對值。使用酶標儀或分光光度計時要作標準曲線。對電泳條帶進行定量分析時一樣要作標準曲線。電泳條帶照片的灰度值與樣品量的關系為指數(shù)函數(shù)。在把灰度值轉(zhuǎn)換成OD值時，用一個標準點進行定量分析是不準確的。多個標準點的標準曲線亦有很大誤差，因此只能說是半定量分析。本文檔共61頁；當前第8頁；編輯于星期一\17點49分1.2定量分析的指標：

IOD(Integratedoptiondensity)

與MeanDensity將圖片上各點的光密度值累加起來，得到IOD。此值與目標物質(zhì)的總量成正比。IOD值除以有效目標分布區(qū)域的面積，得到Meandensity，此值反映了目標物質(zhì)的單位面積濃度。對樣品照片進行數(shù)字圖像分析比較時，就是比較它們之間的平均光密度值的大小。本文檔共61頁；當前第9頁；編輯于星期一\17點49分1.3比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色深度一樣，染色面積大的質(zhì)量大照片A照片B本文檔共61頁；當前第10頁；編輯于星期一\17點49分比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色區(qū)域面積相同，染色深的質(zhì)量大照片A照片B本文檔共61頁；當前第11頁；編輯于星期一\17點49分這回該怎么看？A的顏色深，面積小。B的顏色淺，面積大。照片A照片B本文檔共61頁；當前第12頁；編輯于星期一\17點49分比較體積！

尺寸光密度本文檔共61頁；當前第13頁；編輯于星期一\17點49分1.4實際圖片的情況很復雜的。陽性樣品染色深，陰性樣品染色淺。本文檔共61頁；當前第14頁；編輯于星期一\17點49分直接比較整張圖片的IOD

等于在比較整張圖片的meandensity本文檔共61頁；當前第15頁；編輯于星期一\17點49分哪一個染色物更多？染色區(qū)域顏色深度接近，染色面積有差異。本文檔共61頁；當前第16頁；編輯于星期一\17點49分使用不同的area會得到不同的結論

要結合切片情況來判斷。IOD對整張圖片的面積作平均。IOD對特定組織區(qū)域的面積作平均。IOD對顯色的組織區(qū)域作平均。本文檔共61頁；當前第17頁；編輯于星期一\17點49分對整張圖片區(qū)域進行平均的情況比較少，這張圖片中黃色的IOD值主要來自于中間一塊區(qū)域內(nèi)。本文檔共61頁；當前第18頁；編輯于星期一\17點49分右上角的空白區(qū)面積應該扣除。本文檔共61頁；當前第19頁；編輯于星期一\17點49分也許應是這個特定的組織區(qū)域本文檔共61頁；當前第20頁；編輯于星期一\17點49分這個區(qū)域是特定染色的區(qū)域。在計算IOD時能同時計算出來，但以此為平均面積往往并不正確。本文檔共61頁；當前第21頁；編輯于星期一\17點49分對單個細胞的分析比較單個細胞的IOD單個細胞的meandensity照片上各細胞IOD或meandensity的平均值本文檔共61頁；當前第22頁；編輯于星期一\17點49分邊界不清晰的貼壁細胞整張圖片IOD/細胞個數(shù)（照片中細胞數(shù)目不多，數(shù)起來不費事）本文檔共61頁；當前第23頁；編輯于星期一\17點49分細胞簇的分析測量整張圖片黃色區(qū)域IOD。再測量細胞分布的區(qū)域面積area。對染成藍色的細胞核計數(shù)，作為細胞數(shù)N。以IOD/（N）作為統(tǒng)計指標。或IOD/area本文檔共61頁；當前第24頁；編輯于星期一\17點49分2.從圖片上分析光密度方法

的技術進步簡單測量整張照片的光密度值。在照片上隨機選取數(shù)個區(qū)域，測量其光密度值。計算其平均值作為整張照片的光密度值。在照片上準確選擇被染上染料的特定顏色的區(qū)域，計算這些區(qū)域的累積光密度值（IOD），進而計算統(tǒng)計區(qū)域的平均光密度值。本文檔共61頁；當前第25頁；編輯于星期一\17點49分2.1測定整張照片的光密度-圖象分析儀其測定原理有點象分光光度計，直接測定切片的整體光密度?？梢愿鶕?jù)照片上象素點的亮度來區(qū)分測定區(qū)域其缺陷是顯而易見的。復染上的其他顏色的染料也會產(chǎn)生光密度吸收，導致嚴重的干擾。本文檔共61頁；當前第26頁；編輯于星期一\17點49分2.2抽樣測量光密度在彩色電子圖片上選取目標顏色區(qū)域，抽樣測量這些小區(qū)域的灰度值，取其平均值作為比較染色深淺的指標。隨機選取幾個區(qū)域

但是能作到“隨機”嗎？本文檔共61頁；當前第27頁；編輯于星期一\17點49分2.3ImageProplus的獨特優(yōu)勢。準確地按照一個顏色標準來選取一個AOI(areaofinteresting)。測量這個區(qū)域的光密度參數(shù)。本文檔共61頁；當前第28頁；編輯于星期一\17點49分使用IPP比前兩種方法更好。在查到文獻中使用的圖象分析方法是前兩種的時候，完全可以用IPP的分析測量來代替。結果更加準確。不必照搬文獻上所述的方法。隨著計算機技術的發(fā)展，以后也許還會有更好的圖象分析方法及圖象分析程序的。本文檔共61頁；當前第29頁；編輯于星期一\17點49分3.用IPP分析免疫組化圖片的過程拍攝樣品照片。選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域（AOI，areaofinteresting）。測量該區(qū)域的IOD。選擇并測量有效統(tǒng)計區(qū)域的面積計算光密度平均值IOD/area（meandensity）計算同一實驗組切片各照片的平均及標準差。用統(tǒng)計學方法分析各實驗組的平均meandensity之間是否有顯著性差異。本文檔共61頁；當前第30頁；編輯于星期一\17點49分3.1用于免疫組化半定量分析的照片拍攝與普通顯微鏡照片不同，用于免疫組化分析的顯微鏡照片有其特殊的拍攝要求。本文檔共61頁；當前第31頁；編輯于星期一\17點49分顯微鏡光源正確調(diào)整顯微鏡光源為日光色溫的白色光。此時是加藍色濾光片，燈絲電壓為9V左右。一般的顯微鏡上都會有指示的。此時的鏡下視野會感覺明亮得有點刺眼。不能通過調(diào)整聚光鏡光圈的方法減低亮度，這會影響到光學系統(tǒng)分辨率及圖象的清晰度。不能加過大的灰度鏡減低亮度。用25%的ND濾光片還行。6%的ND濾光片常導致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，將直接影響到照片色彩，從而使得測量結果不準確。本文檔共61頁；當前第32頁；編輯于星期一\17點49分固定顯微鏡的工作條件不僅是光源亮度，除了更換樣品時調(diào)節(jié)載物臺位置，其他部件一律固定下來。特別是不要來回切換使用不同放大倍數(shù)的物鏡。使用一個物鏡拍攝所有的照片后，再切換到另一個物鏡上拍攝照片。為保證顯微鏡光源的穩(wěn)定一致，所有照片應該一次拍攝完成。不能分數(shù)次拍攝。若能給顯微鏡加上穩(wěn)壓電源就更好了。這能保證顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定。本文檔共61頁；當前第33頁；編輯于星期一\17點49分必須使用手動控制曝光的相機對每張照片要使用相同曝光時間，而不是由相機自動控制曝光。染色深的陽性樣品就應該拍攝得較暗。染色淺的陰性對照樣品則應該拍攝得較明亮。各種拍攝條件確定后，就必須使用這個條件一次拍攝完所有的照片。以保證它們的曝光一致。本文檔共61頁；當前第34頁；編輯于星期一\17點49分控制相機曝光時間要把相機曝光時間控制到使視野中空白的地方呈現(xiàn)純亮的白色。拍攝出的照片上，沒有組織的空白處的背景灰度值應達到230左右。可以使用圖象分析軟件測量一下空白處的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易產(chǎn)生色彩的偏離，會影響到圖像分析數(shù)值的偏差。同時背景灰度值也不宜過高。把空白灰度值調(diào)到230以上相當于在分光光度計上調(diào)節(jié)100%透射。本文檔共61頁；當前第35頁；編輯于星期一\17點49分背景的影響左圖：暗且偏藍的背景嚴重影響到了陽性區(qū)域的色調(diào)。而且降低了黃色象素點的IOD值。這會嚴重影響分析結果。有的CCD具有手動較正色溫的功能，可以較正一下背景色調(diào)，但暗背景既使不偏色也是影響分析結果的。本文檔共61頁；當前第36頁；編輯于星期一\17點49分較暗的背景值對分析結果的影響顯著性差異無顯著性差異本文檔共61頁；當前第37頁；編輯于星期一\17點49分扣背景后依然沒有顯著性差異注意誤差線增大了，依然沒有顯著性差異本文檔共61頁；當前第38頁；編輯于星期一\17點49分不能使用相機的自動白平衡自動白平衡功能是相機根據(jù)照片總體色彩情況自動對每張照片進行白平衡校正。這會嚴重影響分析測量的準確性。顯微鏡照片用一兩種染料染色，照片的色彩就應該是不平衡的，不能校正。本文檔共61頁；當前第39頁；編輯于星期一\17點49分最好使用專業(yè)CCD拍攝民用數(shù)碼相機適用于拍攝日常生活中的照片，其自動曝光、自動白平衡功能會有效改善照片的直觀效果。但對于顯微鏡照片，這些功能卻會改變照片的原始面貌，而且它對每一張照片都使用了不同的拍攝條件。嚴重影響照片的分析測量結果。要想關閉這些功能，往往要進行很復雜的設置。不能使用自動白平衡校正，但在拍攝前使用手動的白平衡校正背景色彩卻是必須的。在拍攝照片時要對相機進行背景色彩校正，使得拍攝出的照片中空白的背景呈白色。這種較正將應用于所有拍攝的照片上，與自動白平衡較正不同。自動白平衡較正是對每一張照片都進行各自不同的色彩較正。本文檔共61頁；當前第40頁；編輯于星期一\17點49分應當把照片存為無損壓縮格式TIFF特別是對于染色較淺的圖片，保存為jpeg格式后會損失亮度細節(jié)，導致測量誤差增大。注意那些馬賽克本文檔共61頁；當前第41頁；編輯于星期一\17點49分總結拍攝注意事項：調(diào)整顯微鏡光源亮度（電壓9伏），足夠白，足夠亮。調(diào)整相機曝光時間，使背景呈現(xiàn)白色?；叶戎底詈媚苓_到230以上。確認相機未使用自動白平衡功能。但要使用手動校正白平衡功能校正背景色彩為純白色。使用同樣的顯微鏡工作條件與相機工作條件（曝光及白平衡設置）一次拍攝完所有照片。保存照片為TIFF格式。相素不必太大。本文檔共61頁；當前第42頁；編輯于星期一\17點49分3.2用Image-proplus分析免疫組化圖片與photoshop不同，image-proplus是一個圖片分析和定量測量軟件。IPP的功能不是用來美化圖片，如果照片效果不好或分析結果不理想，要從切片處理與拍攝過程上找原因，而不應試圖通過對圖片的修飾與處理來解決問題。通過IPP的分析測量只應當準確地反映圖片本身的真實測量數(shù)據(jù)。本文檔共61頁；當前第43頁；編輯于星期一\17點49分3.2.1開始使用IPPIPP的程序界面是典型的windows風格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。進入IPP后的第一件事就是打開一幅待分析的圖片。本文檔共61頁；當前第44頁；編輯于星期一\17點49分本文檔共61頁；當前第45頁；編輯于星期一\17點49分將分析圖片信息保存到數(shù)據(jù)庫中在程序中保存分析圖片過程信息是保存實驗原始數(shù)據(jù)的基本原則，必須遵守。將圖片信息及圖片分析過程及分析的信息存入IPP程序數(shù)據(jù)庫是一種保存實驗原始數(shù)據(jù)的操作。要注意對同一張圖片進行同樣的操作，由于一些手動的操作無法準確地重復，所以會出現(xiàn)兩次同樣的測量得到有差異的結果的情況。這也是保存測量結果的理由之一。本文檔共61頁；當前第46頁；編輯于星期一\17點49分3.2.2進行光密度值較正。本文檔共61頁；當前第47頁；編輯于星期一\17點49分光密度值校正前面曾經(jīng)說過，電子照片上象素點的強度是以灰度值來定義的，對8bit的數(shù)字圖象，最亮的白色其灰度值為255。最暗的黑色其灰度值為0。這正好與免疫組化染色的光密度值（OD）相反，所以必須進行校正。定義灰度值大的白色為光密度值=0；定義灰度值最小的黑色光密度值為無窮大。為方便計算，常常把純黑點的光密度值定為2.0或3.0。光密度值與灰度值的轉(zhuǎn)換關系符合朗伯-比爾定律，因此是對數(shù)關系。光密度較正的另一個作用是扣除背景。照片的白色背景處的灰度值（光密度值）往往小于255，定義這個小于255的值為光密度零點實際上就是在扣背景。本文檔共61頁；當前第48頁；編輯于星期一\17點49分正規(guī)的光密度值較正理論上，應該制作已知量的標準樣品（空白樣、標準樣系列、全黑樣品）來進行光密度值較正。能得到更精確的分析結果。在實際操作中，標準樣的制作十分麻煩，而且難于精確制作。實用性并不大。由于切片染色過程的影響因素太多，很難精確控制。所以最后的分析測量結果依然屬于半定量分析。本文檔共61頁；當前第49頁；編輯于星期一\17點49分3.2.3選擇測量參數(shù)及分析指標在分析免疫組化圖象時,一般是測量選定的具有特定顏色的區(qū)域的面積與累積光密度(IOD)對免疫組化的顯微照片,一般應分析它的平均光密度.即時IOD/area.根據(jù)圖象的特點,要分別測量選擇區(qū)域的IOD及area.對不同的組織照片，要使用不同的測量指標來進行比較。IPP可以測量多種幾何尺寸及光密度指標，可以根據(jù)需要選擇。在這個過程中，還可以設置數(shù)據(jù)過濾限制來去除干擾性的無效測量數(shù)據(jù)。本文檔共61頁；當前第50頁；編輯于星期一\17點49分本文檔共61頁；當前第51頁；編輯于星期一\17點49分3.2.4選取特定的待測對象(Objects)一般免疫組化樣品中黃色的區(qū)域為陽性染色區(qū)域。在測量時應當測量這些黃色（棕黃色）區(qū)域的光密度值。不測量其他顏色部分的。因此首要的任務就是把這些黃色的區(qū)域挑選出來。IPP可以根據(jù)圖片上象素點的顏色來自動選取待測區(qū)域的。使用segmentation工具。對于色差小的圖象，還可以使用手動的AOI工具定義待測區(qū)域。本文檔共61頁；當前第52頁；編輯于星期一\17點49分用IPP選取特定顏色區(qū)域選擇特定顏色的區(qū)域是IPP最有特色的功能，按照特定的顏色特征選取圖象中的特定區(qū)域，并計算這些區(qū)域的面積等幾何尺寸與光密度數(shù)據(jù)，就是IPP分析圖像工作的中心任務。Segmentation：適用于選取整張圖片中具有特定顏色的所有區(qū)域。IrregularAOI:手動選擇待測區(qū)域的工具。本文檔共61頁；當前第53頁；編輯于星期一\17點49分IrregularAOI工具是手動工具。

A:trace方式,手動或自動尋找區(qū)域邊界本文檔共61頁；當前第54頁；編輯于星期一\17點49分B：Magicwand方式,定義一片特定灰度范圍的區(qū)域。本文檔共61頁；當前第55頁；編輯于星期一\17點49分Segmentation工具：完全按照顏色標準來選取多個相同顏色的區(qū)域本文檔共61頁；當前第56頁；編輯于星期一\17點49分3.2.5測量并導出統(tǒng)計結果數(shù)據(jù)本文檔共61頁；當前第57頁；編輯于星期一\17點49分測量指標：1.整張圖片所有對象的IOD累加值（IODSUM）2