第五章分子生物學(xué)研究方法演示文稿

第五章分子生物學(xué)研究方法演示文稿1本文檔共109頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分2優(yōu)選第五章分子生物學(xué)研究方法本文檔共109頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分基因克?。╣enecloning）經(jīng)無性繁殖獲得基因許多相同拷貝的過程，通常是將單個(gè)基因?qū)胨拗骷?xì)胞中復(fù)制而成。本文檔共109頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分本文檔共109頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分基因克隆的五個(gè)步驟分、切、連、轉(zhuǎn)、選本文檔共109頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分基因克隆需要什么？目的基因載體宿主基因操作方法本文檔共109頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分基因克隆目的基因序列已知目的基因序列未知本文檔共109頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分專題一：序列已知基因的克隆策略5.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)5.2載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用5.3工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用5.4細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖5.5核酸凝膠電泳技術(shù)本文檔共109頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分5.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)Polymerasechainreaction(PCR)wasdevelopedin1983byKaryMullis.In1993,MulliswasawardedtheNobelPrizeinChemistryalongwithMichaelSmithforhisworkonPCR.PCRamplifiesDNAsbyrepeatedroundsofDNAreplicationinvitro.本文檔共109頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。本文檔共109頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分本文檔共109頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍本文檔共109頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃本文檔共109頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物本文檔共109頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶本文檔共109頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始本文檔共109頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq本文檔共109頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束本文檔共109頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)本文檔共109頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的原理示意圖本文檔共109頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)本文檔共109頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較本文檔共109頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR過程的“三個(gè)步驟”變性（90℃-98℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。本文檔共109頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR反應(yīng)程序95℃5min95℃30S55℃30S72℃1min72℃10min4℃30個(gè)循環(huán)本文檔共109頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR反應(yīng)體系的“五個(gè)要素”模板引物dNTP緩沖液（其中需要Mg2+）DNA聚合酶本文檔共109頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10μLMg2+1.5mmol/L4種dNTP混合物200μmol/L引物110～100pmol引物210～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5μ加雙或三蒸水100μL本文檔共109頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分DNA聚合酶（DNApolymerase）TaqDNApolymerase，1976年從粞熱水生菌（Thermusaquaticus）分離，耐高溫，具有5’-3’外切酶活性，不具有3’-5’外切酶活性，PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾。PfuDNApolymerase，從火球菌（Pyrococcusfuriosis）分離，耐高溫，不具有5’-3’外切酶活性，具有3’-5’外切酶活性，PCR產(chǎn)物為平末端。本文檔共109頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分模板（Template）單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加?？梢允菑?fù)雜樣品。本文檔共109頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)?！?’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer本文檔共109頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分

引物設(shè)計(jì)原則（1）序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。本文檔共109頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記本文檔共109頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0OligoFPCRPrimer-Blast本文檔共109頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高簡便、快速對(duì)標(biāo)本的純度要求低

本文檔共109頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……本文檔共109頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PCR的種類基因組PCR反（逆）轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)DNA的PCR致突變PCR擴(kuò)增未知DNA序列的PCR重組PCR推薦書目《PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用》，黃留玉主編

本文檔共109頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分載體主要是小分子量的復(fù)制子如：病毒、噬菌體、質(zhì)粒。1972年，美國Stanford大學(xué)的P.Berg等首次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組；5.2

載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用本文檔共109頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具。本文檔共109頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件本文檔共109頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分39GeneralfeaturesofaVectorTheycontainanoriginofreplicationandcanautonomouslyreplicatingDNA

independentofhost’sgenome.Containsatleastone

selectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.Containsa

multiplecloningsite(MCS)tobecutbyrestrictionenzymesforDNAmanipulation.Easilytobeisolated

fromthehostcell.Mostarecircular,somearelinear(e.g.YACvector).本文檔共109頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分用于基因克隆的載體質(zhì)粒載體：10kb以下噬菌體載體：20kb黏粒（cosmid）噬菌體：50kb人工染色體：200kb-1Mb土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒：植物細(xì)胞，200kb本文檔共109頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分質(zhì)粒Plasmids:small,extrachromosomalcircularmolecules,from2to~200kbinsize,whichexistinmultiplecopieswithinthehostcells.嚴(yán)緊型質(zhì)粒拷貝數(shù)1-2/cell松弛型質(zhì)?？截悢?shù)>10/cell本文檔共109頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分克隆載體和表達(dá)載體克隆載體（CloningVector）

可攜帶插入的目的DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)并能自我復(fù)制的DNA分子。此種DNA分子含有能在宿主中復(fù)制的位點(diǎn)和便于篩選的遺傳標(biāo)志。

表達(dá)載體（ExpressionVector）

在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體。本文檔共109頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分本文檔共109頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分本文檔共109頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）DNA連接酶（DNAligase）反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscripatase）堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase）DNA聚合酶（DNApolymerase）5.3工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用本文檔共109頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分1970年，Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII，1972年，Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了EcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。

1）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用本文檔共109頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）定義：能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開DNA分子。限制性外切酶：是一類能從多核苷酸鏈的一端開始按序催化水解3’,5’-磷酸二酯鍵，降解核苷酸的酶。其水解的最終產(chǎn)物是單個(gè)的核苷酸。本文檔共109頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分本文檔共109頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分Whybeingused?--TobreaklargeDNAmoleculesintomanageablefragments.Nucleicacids-RestrictiondigestionRestrictionendonucleases(限制性內(nèi)切酶)cleaveDNAmoleculesatparticularsitesby

therecognitionofspecificsequences.本文檔共109頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分來源：細(xì)菌的限制－修飾系統(tǒng)。命名：微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株(品系)。限制性內(nèi)切酶本文檔共109頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分51the1stsuchenzymefoundEscherichiacoli

SpeciescategoryR13strainHowtonamearestrictionendonuclease?EcoRI本文檔共109頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分限制性核酸內(nèi)切酶的分類I型限制酶

屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割DNA兩種特性，隨機(jī)切割。II型限制酶

識(shí)別序列一般為4-6個(gè)堿基對(duì)，通常是反轉(zhuǎn)重復(fù)順序(回文結(jié)構(gòu))，具有180o的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性，特異性切割。III型限制酶

在DNA鏈上有特異位點(diǎn)切割，其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)以外。本文檔共109頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分53REusedinmolecularbiologytypicallyrecognize(識(shí)別)short(4-8bp)targetsequencesthatareusuallypalindromic(回文結(jié)構(gòu)),andcut(切割)atadefinedsequencewithinthosesequences.e.g.EcoRI5’….GAATTC.….3’

….CTTAAG….本文檔共109頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分54Therandomoccurrenceofthehexameric(六核苷酸的)sequence:

1/4096(4-6=1/46)Whatarethefrequenciesiftherecognitionsequencesarefour(tetrameric)andeight(octameric)nucleotides?HowtoestimatethefrequencyoftheREinaDNAmoleculeorgenome?本文檔共109頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分55Table1SomerestrictionEndonucleasesandtheirrecognitionsequencesEnzymeSequenceFrequencySau3A1EcoRINotI5’-GATC-3’5’-GAATTC-3’5’-GCGGCCGC-3’0.25kb4kb65kb本文檔共109頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分56(1)Restrictionenzymesdifferintherecognitionspecificity:targetsitesaredifferent.

(2)Restrictionenzymesdifferinthelengththeyrecognized,andthusthefrequenciesdiffer.

(3)RestrictionenzymesdifferinthenatureoftheDNAendstheygenerate:blunt/flushends(平末端),sticky/staggeredends(粘性末端).

(4)Restrictionenzymesdifferinthecleavageactivity.CharacteristicsofRE本文檔共109頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分57stickyends(粘性末端)bluntends(平末端)

Fig2Recognitionsequencesandcutsitesofvariousendonucleases本文檔共109頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分<1>同裂酶（isoschizomer）：來源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。

5’CCGG3’3’GGCC5’

5’

C

CGG3’3’GGC

C

5’HpaII、MspI少數(shù)有特殊性質(zhì)的II型酶本文檔共109頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分<2>同尾酶（isocaudarner)：作用后能產(chǎn)生相同的粘性末端。5’GGATCC3’3’CCTAGG5’5’AGATCC3’3’CCTAGA5’BamHIBagII本文檔共109頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切末端本文檔共109頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分1967年，世界上有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。2）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用本文檔共109頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分

DNA連接酶

（DNAligase）一種封閉DNA鏈上缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵。E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

本文檔共109頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分連接反應(yīng)體系三蒸水0.5μL目的基因

6μL載體

2μL緩沖液1μL連接酶

0.5μL溫度4℃,16℃本文檔共109頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分DNA連接酶只能作用于雙鏈DNA分子而不能將二個(gè)單鏈DNA分子連接。T4噬菌體DNA連接酶可連接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。大腸桿菌DNA連接酶不能連接平末端DNA分子。DNA重組技術(shù)常用T4噬菌體DNA連接酶。注意：本文檔共109頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分5.4細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株。接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。本文檔共109頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分為提高效率，可對(duì)受體菌進(jìn)行物理或化學(xué)處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過這種處理的細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）本文檔共109頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分CaCl2法大腸桿菌培養(yǎng)至0℃預(yù)處理的低滲CaCl2-甘油溶液42℃90s或37℃5min轉(zhuǎn)化效率：5×106~2×107個(gè)/μgDNA。

本文檔共109頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分電擊法電脈沖可以在細(xì)胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，介質(zhì)中的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。將生長至對(duì)數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4℃后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的電擊杯中進(jìn)行電擊。本文檔共109頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分電穿孔儀電擊杯本文檔共109頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選（Blue-whitescreening）本文檔共109頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分5.5核酸凝膠電泳技術(shù)一種分子被放置到電場中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。本文檔共109頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分核酸電泳的用途確定DNA或RNA的大小純化DNA或RNA片段分離DNA或RNA片段本文檔共109頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分Fig3:DNAisseparatedbygelelectrophoresislargemoderate

small本文檔共109頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分741.DNAandRNAmoleculesarenegativelycharged,thusmoveinthegelmatrix(膠支持物)towardthepositivepole(正電極).2.LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.ThelargeDNAmoleculesmoveslowerthanthesmallmolecules.3.ThemobilityofcircularDNAmoleculesisaffectedbytheirtopologicalstructures.ThemobilityofthesamemolecularweightDNAmoleculewithdifferentshapesis:supercoiled(超螺旋)>linear(線性)>nickedorrelaxed(缺刻或松散)

DNAgelmobility(DNA在膠上的遷移性)本文檔共109頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分75Gelmatrix(膠支持物)isaninserted,jello-likeporousmaterialthatsupportsandallowsmacromoleculestomovethrough.Gelmatrix(膠支持物)本文檔共109頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分76Agarose(瓊脂糖):amuchlessresolvingpowerthanpolyacrylamide,butcanseparateDNAmoleculesofuptotensofkb1kb0.5kb2kb3kb4kbDNAcanbevisualizedbystainingthegelwithfluorescentdyes,suchasethidiumbromide(EB溴化乙錠)本文檔共109頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分77Polyacrylamide

(聚丙稀酰胺):hashighresolvingcapability,andcanresolveDNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.butcanonlyseparateDNAoveranarrowsizerange(1toafewhundredbp).本文檔共109頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1本文檔共109頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。本文檔共109頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分常用緩沖液TAE：Tris-乙酸緩沖容量小，溶解度大，易儲(chǔ)存，可用于核酸純化。TBE：Tris-硼酸緩沖容量大，溶解度小，不易儲(chǔ)存，不用于核酸純化。TPE：Tris-磷酸緩沖容量大，不可用于核酸純化。本文檔共109頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分5.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)5.2載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用5.3工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用5.4細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖5.5核酸凝膠電泳技術(shù)專題一：序列已知基因的克隆策略本文檔共109頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分部分考研題Blue-whitescreening（武漢大學(xué)2008）Vector（上海交大2004，浙江大學(xué)2004、2006）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）（北京師范2008）限制性酶圖譜（華南理工2005）黏性末端（南京師范2006）同裂酶（南京師范2006）設(shè)計(jì)PCR引物的主要原則是什么？（中科院2007）描述PCR技術(shù)原理（浙江大學(xué)2004、2006）分子生物學(xué)研究中經(jīng)常用各種載體進(jìn)行研究工作，試問有哪些不同大小類型的載體，各自的主要特點(diǎn)是什么？（武漢大學(xué)2005、2009）堿法質(zhì)粒提取用到的溶液成分的作用時(shí)什么？操作中有哪些注意事項(xiàng)？（北京大學(xué)2010）本文檔共109頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分思考題請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一組試驗(yàn)來①克隆一個(gè)你所感興趣的人類基因；②并對(duì)基因產(chǎn)物大量表達(dá)與純化；③然后研究該基因的生物學(xué)功能。（武漢大學(xué)2005）本文檔共109頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分專題二：序列未知基因的克隆策略5.6構(gòu)建基因組文庫5.7構(gòu)建cDNA文庫5.8文庫篩選5.9RACE本文檔共109頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分85LibrariesofDNAmoleculescanbecreatedbycloning(GenomiclibraryandcDNAlibrary)ADNAlibrary(DNA文庫)isapopulationofidenticalvectorsthateachcontainsadifferentDNAinsert.GenomicLibrary(基因組文庫):theDNAinsertsinaDNAlibraryisderivedfromrestrictiondigestionorphysicalshearingofthegenomicDNA.cDNAlibrary(cDNA文庫):theDNAinsertsinaDNAlibraryisconvertedfromthemRNAsofatissue,acelltypeoranorganism.cDNAstandsfortheDNAcopiedfrommRNA.本文檔共109頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分5.6基因組DNA文庫構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€(gè)序列至少有一個(gè)代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫。本文檔共109頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分Clark和Carbon于1975年提出公式：

N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一個(gè)基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆數(shù)目；p表示所期望的靶基因在文庫中出現(xiàn)的概率；f表示重組克隆平均插入片段的長度與基因組DNA總長的比值。本文檔共109頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分構(gòu)建基因組文庫最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15—20kb）和限制性內(nèi)切酶部分消化法。本文檔共109頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分5.7cDNA文庫的構(gòu)建1總RNA的提取2mRNA的純化3cDNA的合成4cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫的構(gòu)建過程本文檔共109頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%1總RNA的提取本文檔共109頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分總RNA的抽提方法異硫氰酸胍-苯酚抽提法(TRIzol法)硅膠膜純化柱本文檔共109頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分RNA的濃度和純度可以通過測定其OD260和OD280來判斷。OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染，則OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。本文檔共109頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分RNA的瓊脂糖電泳檢測變性條件下，甲醛是最常用的變性劑，也可用加熱或尿素等變性劑。28S和18S亮度2:1rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。本文檔共109頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分2mRNA的純化5’端帽子結(jié)構(gòu)和3’端的polyA尾巴寡聚(dT)-纖維素柱色譜法本文檔共109頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期三\12點(diǎn)22分PolyATTractmRNA的分離純化過程簡圖。本文檔共109頁；